一種用于三維多細(xì)胞球培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)板及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于三維多細(xì)胞球培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)板及其制備方法。本發(fā)明公開的細(xì)胞培養(yǎng)板其底部修飾有具有規(guī)則的圖案化微孔結(jié)構(gòu)的聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)水凝膠膜。其制備方法分細(xì)胞培養(yǎng)板表面處理、水凝膠預(yù)聚液配制、水凝膠紫外固化、水凝膠膜的圖案化等步驟。水凝膠膜規(guī)則的圖案化微孔結(jié)構(gòu)系通過溶漲起皺原位自發(fā)形成，不使用任何模具。利用本發(fā)明公開的細(xì)胞培養(yǎng)板可方便地大量制備尺寸均一的多細(xì)胞球。
【專利說明】一種用于三維多細(xì)胞球培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)板及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于三維多細(xì)胞球培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)板及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，人體中的絕大多數(shù)細(xì)胞生活在三維的環(huán)境中，細(xì)胞必須通過細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，獲得各種生化和機(jī)械信號(hào)，才能維持其正常的生理活動(dòng)。大量研究表明，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用對(duì)于調(diào)控細(xì)胞的遷移、增殖和分化有重要的作用。一般使用的二維單層培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏這樣的信號(hào)傳遞，不能很好地模擬體內(nèi)細(xì)胞的微環(huán)境。相反，在三維的多細(xì)胞球(multicellularspheroids)中細(xì)胞與外部環(huán)境之間的相互作用可大部分得到重建。因此，和細(xì)胞單層相比，多細(xì)胞球能更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞的微環(huán)境，其在基因及功能表達(dá)等諸多方面更接近于正常人體細(xì)胞。三維多細(xì)胞球在藥物篩選、腫瘤研究以及組織工程等領(lǐng)域的應(yīng)用正受到越來越多的關(guān)注，迫切需要方便的、可大批量制備、并能控制多細(xì)胞球的大小和分布的多細(xì)胞球制備技術(shù)。
[0003]培養(yǎng)多細(xì)胞球的方法很多。傳統(tǒng)的懸滴法(hanging drop)可很好地控制多細(xì)胞球的大小和分布，但是操作非常繁瑣，且不能大量制備。不黏附涂層法和懸浮培養(yǎng)法可大量制備多細(xì)胞球，但是得到的多細(xì)胞球分布很寬，應(yīng)用受到很大限制。近年來發(fā)展的圖案化微孔法(miCTowells)可得到大小一致的多細(xì)胞球，而且可規(guī)?；a(chǎn)，是制備多細(xì)胞球的理想方法。但是文獻(xiàn)中一般應(yīng)用光刻等技術(shù)制備圖案化微孔，這一方法需要特殊裝備，只能在少數(shù)有條件的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。此外利用光刻等技術(shù)制備的圖案化微孔還存在與商品化細(xì)胞培養(yǎng)板不匹配的問題。這些問題大大限制了微孔法的推廣和使用。
[0004]本發(fā)明公開的細(xì)胞培養(yǎng)板底部修飾有聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)水凝膠膜，這一水凝膠膜具有細(xì)胞不黏附性，并且具有規(guī)則的圖案化微孔結(jié)構(gòu)，因此可用于單分散多細(xì)胞球的制備。本發(fā)明中圖案化微孔結(jié)構(gòu)不是采用光刻、模具模壓等方法制備，而是利用水凝膠溶漲起皺自發(fā)形成。本發(fā)明公開的細(xì)胞培養(yǎng)板可用于單分散多細(xì)胞球的大規(guī)模制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開的細(xì)胞培養(yǎng)板示意圖如附圖1所示。其底部修飾有聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)水凝膠膜，這一水凝膠膜具有細(xì)胞不黏附性，并且具有規(guī)則的圖案化微孔結(jié)構(gòu)。其用于多細(xì)胞球培養(yǎng)的操作類似普通的二維單層細(xì)胞培養(yǎng)，不同的是由于規(guī)則的圖案化微孔結(jié)構(gòu)的存在，細(xì)胞均勻地聚集在每個(gè)微孔底部，并且由于水凝膠膜的細(xì)胞不黏附性，細(xì)胞逐步融合形成尺寸均一的多細(xì)胞球。
[0006]本發(fā)明公開的細(xì)胞培養(yǎng)板的制備過程如下:
[0007](I)細(xì)胞培養(yǎng)板表面處理。將濃硫酸加入多孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中，處理1-12小時(shí)，水洗晾干。[0008](2)配制預(yù)聚液。預(yù)聚液由已部分聚合的甲基丙烯酸羥乙酯，光引發(fā)劑和交聯(lián)劑組成。各組分含量分別為甲基丙烯酸輕乙酯80wt% _98wt%,光引發(fā)劑lwt% -10wt%和交聯(lián)劑 Iwt % -1Owt % ο
[0009](3)將預(yù)聚液加入到多孔板的每個(gè)孔中，紫外光照引發(fā)聚合，得到PHEMA水凝膠膜。
[0010](4)向多孔板的每個(gè)孔中加入水，PHEMA水凝膠膜發(fā)生溶脹。由于基底的束縛，水凝膠膜只能在垂直基底的方向溶脹，因此發(fā)生起皺現(xiàn)象，最終形成規(guī)則的圖案。
[0011](5)移去各孔中的水，晾干，滅菌消毒，無菌包裝。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1、細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)構(gòu)及多細(xì)胞球培養(yǎng)步驟示意圖。
[0013]圖2、細(xì)胞培養(yǎng)板制備步驟示意圖。
[0014]圖3、細(xì)胞培養(yǎng)板中PHEMA水凝膠膜顯微照片顯示其規(guī)則的圖案化微孔結(jié)構(gòu)。
[0015]圖4、利用本發(fā)明公開的細(xì)胞培養(yǎng)板制備的尺寸均一的NIH3T3細(xì)胞多細(xì)胞球。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。但本發(fā)明并不限于下列實(shí)施例。
[0017]實(shí)施例1:
[0018]將濃硫酸加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中，處理1-12小時(shí)，水洗晾干。配制水凝膠預(yù)聚液，其中光引發(fā)劑含量為2wt`%，交聯(lián)劑含量為7wt%，余為已部分聚合的甲基丙烯酸羥乙酯。將預(yù)聚液加入到12孔板的每個(gè)孔中，500W紫外固化燈下照射4min，得到PHEMA水凝膠膜。
[0019]實(shí)施例2:
[0020]向?qū)嵤├?中得到的12孔板的每個(gè)孔中加入水，PHEMA水凝膠膜發(fā)生溶脹。由于基底的束縛，水凝膠膜只能在垂直基底的方向溶脹，因此發(fā)生起皺現(xiàn)象，最終形成規(guī)則的圖案。如附圖3所示。
[0021]實(shí)施例3:
[0022]向?qū)嵤├?中得到的12孔板的每個(gè)孔中加入3mL NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)，得尺寸均一的NIH3T3多細(xì)胞球。如附圖4所示。
【權(quán)利要求】
1.一種用于三維多細(xì)胞球培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)板，其特征在于其底部修飾有聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)水凝膠膜，且水凝膠膜具有規(guī)則的圖案化微孔結(jié)構(gòu)。
2.權(quán)利要求1中細(xì)胞培養(yǎng)板的制備方法分細(xì)胞培養(yǎng)板表面處理、水凝膠預(yù)聚液配制、紫外固化、水凝膠膜的圖案化等步驟。
3.權(quán)利要求1中細(xì)胞培養(yǎng)板的制備方法，其特征在于水凝膠膜規(guī)則的圖案化微孔結(jié)構(gòu)系通過溶漲起皺原位自發(fā)形成，不使用任何模具。
4.權(quán)利要求2中預(yù)聚液由已部分聚合的甲基丙烯酸羥乙酯、光引發(fā)劑和交聯(lián)劑組成，各組分含量分別為甲基丙烯酸輕乙酯80wt% _98wt%、光引發(fā)劑lwt% -10?1:%和交聯(lián)劑Iwt % -1Owt %。`
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK103756902SQ201410012323
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】張擁軍, 趙梓淇, 關(guān)英 申請(qǐng)人:南開大學(xué)