一種新型羰基還原酶、其基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)源于金黃桿菌（Chryseobacteriumsp.CA49）的新型羰基還原酶ChKRED03及其編碼基因，并利用該羰基還原酶作為生物催化劑催化底物3,5-雙三氟甲基苯乙酮制備光學(xué)純(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值大于99%。除了羰基還原酶ChKRED03純酶以外，還可以利用相應(yīng)的重組菌休止細(xì)胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形態(tài)作為生物催化劑，同樣能達(dá)到本發(fā)明的效果。該酶是一種具有潛力的新型生物催化劑，具有較大的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種新型羰基還原酶、其基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新的基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物，具體涉及一種來(lái)源于金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49)的新型羰基還原酶ChKRED03及其基因，并利用其生物催化生產(chǎn)(S)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，屬于應(yīng)用微生物與酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]兩種光學(xué)純的[3，5- 二(三氟甲基)苯基]乙醇都是合成NK-1受體拮抗劑的中間體，其中R構(gòu)型是Merk公司研發(fā)的藥物阿瑞匹坦(Aprepitant,商品名“Emend”)的關(guān)鍵手性中間體，而S構(gòu)型常用于整合到拮抗劑中用于臨床評(píng)價(jià)(Pollard D, et al.Effectivesynthesis of (S)-3, 5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymaticreduction.Tetrahedron:Asymmetry, 2006, 17, 554-559)。近年來(lái)，以潛手性麗 3, 5_ 雙三氟甲基苯乙酮為底物經(jīng)生物催化過(guò)程獲得S構(gòu)型醇迅速發(fā)展。目前報(bào)道的可以實(shí)現(xiàn)該催化過(guò)程的的微生物菌株有Saccharomyces Rhodotorula (張芳等，紅酵母靜息細(xì)胞催化 (S)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇的不對(duì)稱還原反應(yīng).藥物生物技術(shù)，2007，14 (6):411-414),Candida tropicalisl04 (王普等，一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法.中國(guó)專利，CN101519674)等，這些全細(xì)胞的生物催化過(guò)程往往ee值不高或者底物轉(zhuǎn)化濃度較低；商業(yè)酶則有來(lái)自 Rhodococcus erythropolis、Candida parapsilosis、Candida boidinii等菌株的乙醇脫氫酶ADH,其中由Merk公司開(kāi)發(fā)的ADH RE (來(lái)源于Rhodococcus erythropolis)催化工藝(Pollard D, et al.Effective synthesis of (S)-3, 5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymatic reduction.Tetrahedron:Asymmetry, 2006, 17, 554-559),已達(dá)到 100g/l 的工業(yè)化水平，該過(guò)程需要添加甲酸脫氫酶FDH用于輔酶循環(huán)。開(kāi)發(fā)更多有潛力的催化劑，既可獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物催化工藝，又能豐富生物催化工具箱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種羰基還原酶ChKRED03及其基因，以及利用該酶還原底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮制備光學(xué)純(S)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法。
[0004]本發(fā)明所述的羰基還原酶ChKRED03的基因堿基數(shù)為735bp，其序列為SEQ IDN0.1，編碼244個(gè)氨基酸殘基，其序列為SEQ ID N0.2。
[0005]羰基還原酶ChKRED03從金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因組中克隆獲得，該菌的保藏編號(hào)為CCTCC M2012484 (中國(guó)武漢，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012 年 11 月 27 日)。
[0006]羰基還原酶ChKRED03的基因PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)的引物如下:正向5 ' -gaattcATGAATTTCACAGATAAAAATGTAATCATTAC-3 '(酶切位點(diǎn) EcoR I),反向5 ' -aagcttTATCTGCGGATCGTTACTCC-3 '(酶切位點(diǎn) Hind III)。模板為金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因組DNA。獲得的目標(biāo)基因所編碼的蛋白質(zhì)命名為羰基還原酶ChKRED03。將目標(biāo)基因連入pET28a ( + )空載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a_ChKRED03，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中構(gòu)建重組菌。將上述構(gòu)建的重組菌以常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)純化獲得純酶。
[0007]根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的知識(shí)，任何基因經(jīng)操作或者改造后連入各類表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至合適宿主細(xì)胞，經(jīng)適當(dāng)條件誘導(dǎo)均能過(guò)量表達(dá)目的蛋白。因此，羰基還原酶ChKRED03表達(dá)的載體可以為pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表達(dá)宿主可以為大腸桿菌，畢赤酵母，鏈霉菌等。
[0008]本發(fā)明還提供了羰基還原酶ChKRED03作為生物催化劑在轉(zhuǎn)化底物3，5_雙三氟甲基苯乙酮生成(S)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。其反應(yīng)式如下:
[0009]
【權(quán)利要求】
1.一種羰基還原酶GKRED03的基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
2.一種羰基還原酶aKRED03，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
3.如權(quán)利要求2所述的羰基還原酶CXKRED03作為生物催化劑在轉(zhuǎn)化底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮 生成(5.)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P7/22GK103695443SQ201410012867
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2014年1月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月12日
【發(fā)明者】吳中柳, 劉艷, 裴小瓊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所