一種高緯度城市生活污水植物水處理方法
【專利摘要】一種高緯度城市生活污水植物水處理方法，它涉及一種生活污水的水處理方法。它采用外來入侵物種進(jìn)行城市生活污水水處理，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)空心蓮子草的氧結(jié)合能力和需氧量，使其可以處理污染程度高的生活污水水體；而且可以提高空心蓮子草的耐寒性，令其可在高緯度地區(qū)應(yīng)用，使冬季水處理時間延長、水處理效果提升。方法：一、構(gòu)建植物表達(dá)載體；二、構(gòu)建空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株；三、培育、繁殖空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株，再將其移植到高緯度污染水體中進(jìn)行污水處理和修復(fù)。本發(fā)明應(yīng)用于水環(huán)境工程領(lǐng)域。
【專利說明】一種高緯度城市生活污水植物水處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生活污水的水處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于城市的快速發(fā)展和人口數(shù)量的不斷增加，我國的生活污水越來越多。環(huán)?？偩謭蟾骘@示，目前城市生活污水排放量以年均5%的速度遞增，已超過工業(yè)污水排放量。生活污水不但影響水質(zhì)，對我們生活的環(huán)境更是一大危害。
[0003]空心蓮子草(拉丁學(xué)名:Alternantheraphiloxeroides (Mart.)Griseb.),別名:革命草、水花生、喜旱蓮子草等，屬莧科的一種植物。多年生草本；莖基部匍匐，上部上升，管狀，不明顯4棱，長55~120厘米，具分枝，幼莖及葉腋有白色或銹色柔毛，莖老時無毛，僅在兩側(cè)縱溝內(nèi)保留。葉片矩圓形、矩圓狀倒卵形或倒卵狀披針形。具有藥用價值。20世紀(jì)50~70年代，隨著養(yǎng)豬事 業(yè)的發(fā)展，作為優(yōu)良飼料在中國進(jìn)行大力推廣，上世紀(jì)80年代后期為野生，自然蔓生面積迅速擴(kuò)大?？招纳徸硬葜饕谵r(nóng)田(包括水田和旱田)、空地、魚塘、溝渠、河道等環(huán)境中生長為害，阻塞水上交通，封閉河塘水面，降低作物產(chǎn)量，影響農(nóng)田排灌，被列為中國首批外來入侵物種。
[0004]空心蓮子草適應(yīng)性強(qiáng)，既能扎根生于淺水中，也能漂浮于水面上；抗酸堿能力強(qiáng)，可在PH值為3~12的環(huán)境中生長；并能耐受30%的鹽濃度。但是被生活污染嚴(yán)重污染的水體中氧氣的含量低，成為制約空心蓮子草進(jìn)行植物水處理的一個瓶頸。而且，在高緯度地區(qū)冬季空心蓮子草雖然水下部分仍有活力，來年春天仍可萌發(fā)生長，但水面部分己凍死，由于高緯度地區(qū)冬季時間長導(dǎo)致其難以在高緯度地區(qū)用于水體修復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明采用外來入侵物種進(jìn)行城市生活污水水處理，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)空心蓮子草的氧結(jié)合能力和需氧量，使其可以處理污染程度高的生活污水水體；而且可以提高空心蓮子草的耐寒性，令其可在高緯度地區(qū)應(yīng)用，使冬季水處理時間延長、水處理效果提升。
[0006]高緯度城市生活污水植物水處理方法按以下步驟進(jìn)行:
[0007]—、構(gòu)建植物表達(dá)載體；
[0008]二、構(gòu)建空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株；
[0009]三、培育、繁殖空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株，再將空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株移植到高緯度污染水體中進(jìn)行污水處理和修復(fù)；
[0010]其中，步驟一中植物表達(dá)載體中包含啟動子super promoter和透明顫菌血紅蛋白基因。
[0011]本發(fā)明也利用高緯度地區(qū)冬季寒冷的自然條件對空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株的生長和蔓延進(jìn)行遏制，在利用空心蓮子草的同時防止空心蓮子草產(chǎn)生生態(tài)破壞。【具體實施方式】
[0012]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0013]【具體實施方式】一:本實施方式高緯度城市生活污水植物水處理方法按以下步驟進(jìn)行:
[0014]—、構(gòu)建植物表達(dá)載體；
[0015]二、構(gòu)建空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株；
[0016]三、培育、繁殖空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株，再將空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株移植到高緯度污染水體中進(jìn)行污水處理和修復(fù)；
[0017]其中，步驟一中植物表達(dá)載體中包含啟動子super promoter和透明顫菌血紅蛋白基因。
[0018]本實施方式中先將核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的啟動子super promoter導(dǎo)入到載體p3300-Tnos中，然后將人工合成的透明顫菌血紅蛋白基因(如SEQ ID N0:2所示)和導(dǎo)入啟動子super promoter的載體p3300_Tnos都用XbaI和SacI進(jìn)行雙酶切,之后進(jìn)行連接，獲得植物表達(dá)載體。
[0019]本實施方式獲得的植物表達(dá)載體分別用EcoRI和Hind II1、XbaI和EcoR1、XbaI和SacI進(jìn)行雙酶切，分別獲得1.8kb、0.7kb和456bp三條條帶，說明植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。
[0020]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，然后對目的基因(啟動子superpromoter和透明顫菌血紅蛋白基因)進(jìn)行檢測與測定，選擇成功表達(dá)的農(nóng)桿菌導(dǎo)入空心蓮子草；之后利用抗生素進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的篩選，并利用PCR法進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的鑒定，含有啟動子super promoter和透明顫菌血紅蛋白基因的為成功轉(zhuǎn)化的空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株。
[0021]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點是:步驟三中空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株生根后，幼苗高度長到3cm進(jìn)行移植。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
[0022]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點是:步驟一中啟動子super promoter 導(dǎo)入到載體 p3300_Tnos 后獲得質(zhì)粒 p3300_super promoter-Tnos,然后用堿裂解法提取p3300_super promoter-Tnos質(zhì)粒，再用XbaI和SacI進(jìn)行雙酶切，XbaI和SacI雙酶切反應(yīng)體系為50 μ L，由20 μ L的質(zhì)粒、0.5 μ L的限制性內(nèi)切酶Xbal、0.5 μ L的限制性內(nèi)切酶Sacl、5 μ L的10Χ共用酶切緩沖液和余量的ddH20組成；雙酶切反應(yīng):在30°C水浴鍋中放置2h。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
[0023]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點是:步驟一中經(jīng)過雙酶切的人工合成的透明顫菌血紅蛋白基因和表達(dá)載體p3300-super promoter-Tnos進(jìn)行連接，連接體系為IOyL,由6μ L的人工合成的透明顫菌血紅蛋白基因片段、2μ L的載體 p3300_super promoter-Tnos 片段，1 μ L 的 T4DNA ligation buffer 和 1 μ L 的 T4DNAligation組成；16°C連接反應(yīng)12h，獲得植物表達(dá)載體。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
[0024]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點是:步驟二按以下步驟構(gòu)建空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株:
[0025]①農(nóng)桿菌(LBA4404)感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0026]1、從含有50mg/L Sm、50mg/L Rif的YEB的平板上挑取農(nóng)桿菌LBA4404的單菌落；[0027]2、接種于5mL含Sm和Rif的YEB液體培養(yǎng)基內(nèi)，28°C，180r/min，振蕩培養(yǎng)I~2d ；
[0028]3、取菌液按1:10的比例重新接種于50mL含Sm和Rif的YEB中；
[0029]4、振蕩培養(yǎng)6~8h，至對數(shù)生長期OD6tltl ^ 0.5 ；
[0030]5、菌液置于冰上20~30min,分裝于高壓滅菌的1.5mL eppendorf管中；
[0031]6、4°C、5000r/min 離心 IOmin,棄上清；
[0032]7、沉淀加入800 μ L冰預(yù)冷的0.05mol/L CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴20~30min ；
[0033]8、4°C、5000r/min 離心 IOmin,棄上清；
[0034]9、沉淀加入100 μ L冰預(yù)冷的0.05mol/L CaCl2重懸細(xì)胞；
[0035]10、置于4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0036]②凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404
[0037]1、取農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入3~4μ L植物表達(dá)載體，輕輕混勻，置冰上30min ；
[0038]2、液氮冷凍3 ~5min，迅速移至37 °C水浴鍋放置中2~3min融化；
[0039]3、加入 800 μ L YEB，28°C振蕩培養(yǎng) 4 ~5h ;
[0040]4、8000r/min離心5min，去上清，留下適量上清，將沉淀混勻，取100 μ L涂于含相應(yīng)抗生素YEB的平板上，28°C倒置暗培養(yǎng)48h。
[0041]③準(zhǔn)備農(nóng)桿菌侵染的受體材料
[0042]育苗:將空心蓮子草的葉片用水清洗2~3遍后，用75%酒精對葉片進(jìn)行表面消毒15~30s，再用0.1%的升汞消毒30~60s，無菌水沖洗5遍，然后接種于MStl培養(yǎng)基中；
[0043]④農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的再生
[0044]1、菌種活化
[0045]將農(nóng)桿菌接種于加有Sm、Rif和Kan的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)36~48h，或至長出單菌落；挑取單菌落并接種于IOmL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，180r/min，振蕩培養(yǎng)；待菌液長至對數(shù)生長期，即0D_ = 0.4~0.6，再次將菌液接種于含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化；
[0046]2、侵染
[0047]取出預(yù)培養(yǎng)的空心蓮子草外植體放入活化好的農(nóng)桿菌菌液中，浸泡10~15min，其間輕搖幾次；取出材料，用無菌水沖洗4~5次，然后用無菌濾紙吸去多余的液體；
[0048]3、共培養(yǎng)
[0049]將侵染后的外植體接種到MStl培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng)I~2d ;
[0050]4、繼代培養(yǎng)
[0051 ] 外植體經(jīng)共培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基MS1中，28 °C光培養(yǎng)，分化愈傷組織，約IOd左右繼代一次；
[0052]5、篩選培養(yǎng)
[0053]繼代培養(yǎng)2~3周后，外植體愈傷組織開始分化出抗性芽，將抗性芽轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基MS2上，并繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)；
[0054]6、抗性芽的生根培養(yǎng)
[0055]待芽長至3~4cm長，將其剪下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS3上，誘導(dǎo)生根，大約15~20d長出不定根。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。[0056]實施例1
[0057]在高緯度地區(qū)進(jìn)行對比試驗:
[0058]試驗地點:大慶市，大慶市位于黑龍江省西部，松遼盆地中央坳陷區(qū)北部，市區(qū)地
理位置北緯45° 46’，東經(jīng)124° 19’至125° 12’之間。試驗生活污水采自大慶市薩南公園。
[0059]試驗分為兩種方案進(jìn)行，第一種方案采用本發(fā)明的生活污水處理方法，第二種方
案直接采用未經(jīng)過改造的普通空心蓮子草處理生活污水；每種方案又采取3種不同的種植
密度進(jìn)行試驗，并選擇一同緯度、同水質(zhì)、同面積、同樣條件的水域作為空白對照樣。
[0060]2011年春天試驗地點平均氣溫達(dá)到15°C將幼苗高為3cm的空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植
株和普通空心蓮子草植株移植到各自的污染水體中進(jìn)行試驗。
[0061]移植1個月后對植株的各種生物量進(jìn)行測量，測量結(jié)果如表1所示。
[0062]表1
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種高緯度城市生活污水植物水處理方法，其特征在于高緯度城市生活污水植物水處理方法按以下步驟進(jìn)行: 一、構(gòu)建植物表達(dá)載體； 二、構(gòu)建空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株； 三、培育、繁殖空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株，再將空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株移植到高緯度污染水體中進(jìn)行污水處理和修復(fù)； 其中，步驟一中植物表達(dá)載體中包含啟動子super promoter和透明顫菌血紅蛋白基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高緯度城市生活 污水植物水處理方法，其特征在于步驟一中選用載體p3300-Tnos構(gòu)建植物表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高緯度城市生活污水植物水處理方法，其特征在于步驟一中啟動子super promoter的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高緯度城市生活污水植物水處理方法，其特征在于步驟一中透明顫菌血紅蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
【文檔編號】C12N15/82GK103739080SQ201410013153
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】肖宇, 孫力, 高宇, 田媛 申請人:黑龍江省科學(xué)院大慶分院