一種梨果實果梗長度主效qtl位點的snp分子標記方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種與梨果實果梗長度主效QTL位點的SNP標記方法及其應用，屬于植物分子育種領域。梨果梗長度主效QTL位點的SNP標記為Pyb07_095（LOD值=9.19），位于scaffold278.0的第502462個堿基處。利用Pyb07_095開發(fā)基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果實果梗長度的特異標記，該特異引物可對果梗長度進行良好分型，即檢測QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達果梗長度大小的差異。本發(fā)明提供的梨果實果梗長度主效QTL分子標記可用于梨果實果梗長度性狀的分子標記輔助選擇育種，對于加快梨品種的遺傳改良進程，提高育種選擇效率具有重要的理論和實踐指導意義。
【專利說明】一種梨果實果梗長度主效QTL位點的SNP分子標記方法及
其應用
[0001]一、【技術(shù)領域】
本發(fā)明屬于分子遺傳育種領域，提供了梨果實果梗長度的主效QTL位點及其SNP標記方法，可用于梨果實果梗長度性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率。
[0002]二、【背景技術(shù)】
我國是世界梨屬L.)植物最主要的起源地之一，遺傳多樣性豐富。梨的栽培種分布廣泛，除了海南省和臺灣省，都有栽培。梨果實的營養(yǎng)價值高，香甜多汁，而深受消費者喜愛。果梗長度是影響梨果實發(fā)育和品質(zhì)的重要因素之一，果柄是水分和碳水化合物運輸?shù)焦麑崈?nèi)的必經(jīng)之路，其長短與粗細也直接影響到物質(zhì)的運轉(zhuǎn)。梨低序位果果柄粗且短，有利于營養(yǎng)和水分的運輸，因此一般留果都選擇留低序位的果。碳水化合物的運輸可能因果柄的限制而運輸速率降低，導致高序位果果實發(fā)育狀況較差或滯后，采收時果實較小。果梗長短在梨果實發(fā)育中起到重要作用，同時也是梨采后分級的重要標準，果梗的完好通常是水果新鮮度的表征，果梗缺損會導致其內(nèi)部水分流失，加上其干枯和腐爛，會進一步影響到果實的品質(zhì)。因此，果梗長度是梨新品種選育時的重要評價指標之一。
[0003]由于絕大多數(shù)梨品種是自交不親和的，梨的遺傳組成表現(xiàn)高度雜合性；同時，由于多年生果樹的農(nóng)藝性狀多數(shù)表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳特征，有關梨的重要性狀遺傳規(guī)律研究相對滯后，也難以開展目標性狀的遺傳改良。近年來，隨著分子標記技術(shù)的迅速發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現(xiàn)，以及數(shù)量性狀作圖方法的不斷完善，使得數(shù)量性狀基因座(QTL)定位變成了現(xiàn)實，也為提高目標數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的可能性、準確性及預見性奠定了基礎。利用分子標記定位數(shù)量性狀QTL，其實質(zhì)就是分析分子標記與目標性狀QTL之間的連鎖關系，即利用已知座位的分子標記來定位未知座位的QTL，通過計算分子標記與QTL之間的交換率，來確定QTL的具體位置?；讷@得的標記基因型分離與數(shù)量性狀表型之間的關系，可直接確定控制數(shù)量性狀位點，開發(fā)可應`用于分子標記輔助選擇育種的技術(shù)，這已在許多重要農(nóng)作物上取得了成功應用。
[0004]目前有關梨數(shù)量性狀的QTL定位研究仍屬起步階段，已有的研究主要是針對一些病害或生長性狀，對梨果梗長度性狀的QTL定位及檢測QTL位點上的多態(tài)性表達果梗長度大小差異的SNP分子標記的開發(fā)應用研究尚未有報道。因此，開展梨果梗長度性狀的QTL定位，基于相應序列信息開發(fā)SNP分子標記，并建立雜交后代早期輔助選擇技術(shù)體系，對于提高梨果實品質(zhì)，提高育種效率，節(jié)約生產(chǎn)成本顯得尤為重要。
[0005]三、
【發(fā)明內(nèi)容】
技術(shù)要求
本發(fā)明的目的是定位梨果實果梗長度主效QTL，根據(jù)貢獻位點Pyb07_095序列信息開發(fā)基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果實果梗長度的SNP特異標記，檢測QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達果梗長度大小的差異。通過該分子標記可以預測梨果梗長度的大小，為實現(xiàn)果梗長度性狀的早期鑒定和篩選提供分子輔助選擇技術(shù)支持。
[0006]技術(shù)方案一種與梨果實果實果梗長度主效QTL位點緊密連鎖的SNP標記引物，其特征在于:
正向引物 LFP-F 5，- TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3，
反向引物 LFP-R 5，- GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3，
該引物用來檢測梨基因組序列scaffold278.0 (登錄號為AJSUOOOOOOOO)的第502462個堿基處是否存在一個與梨果實果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095，同時檢測QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達果梗長度大小的差異，該SNP位點位于第7連鎖群的33.5 cM處，其解釋了遺傳變異的25.68%，L0D值為9.19。
[0007]所述引物用于檢測梨果實果梗長度主效QTL位點的SNP標記方法，其特征在于:HRM 反應體系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒中的
說明書進行，HRM分析是在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀上進行；
10 μ L反應體系:含有2 ng.μ 1梨基因組DNA模板，1 X Master Mix, 2.0 mmol
?I71 MgCl2,0.2 mmol.I71權(quán)利要求1所述的引物；
擴增程序采用降落式PCR (touchdown PCR):95 °C預變性10 min，然后95 V變性10s、60~55 V (每循環(huán)下降0.5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序進行45個循環(huán)。擴增產(chǎn)物序列大小在249bp，表明存在一個與梨果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095 ；
PCR循環(huán)結(jié)束后進行熔解，其程序為:95 ° C 1 min, 40 ° C 1 min, 65 ° C 1 s，再從65 ° C連續(xù)升溫至95 ° C，每升高0.04 ° C，收集熒光1次，最后降溫至40 ° C;
最后，在 Light Cycler? 480 II 的 Gene Scanning 軟件中 1.5 version 自動生成擴增產(chǎn)物的熔解曲線，分別以已知梨果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095上表達的果梗長度大的品種和表達的果梗長度小的品種為對照，檢測QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達果梗長度大小的差異。如果未知品種得到的擴增產(chǎn)物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在梨梗長度主效QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達的果梗長度大小和對照相似。
[0008]所述的已知與梨果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095上多態(tài)性表達的果梗長度大的品種為‘碭山酥梨’，表達的果梗長度小的品種為‘八月紅’。
[0009]所述引物和方法可以用在梨分子育種中檢測與梨果實縱徑主效QTL位點是否存在，同時檢測QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達果梗長度大小的差異。
[0010]有益效果
(1)本發(fā)明首次對決定‘八月紅’和‘碭山酥梨’果實果梗長度的數(shù)量性狀位點進行了QTL定位，定位的QTL位點對該數(shù)量性狀的貢獻率較高，位點的貢獻率為25.68%。這為實現(xiàn)分子輔助育種多基因控制性狀遺傳改良奠定了重要的基礎和必要的前提。
[0011](2)目前普遍認為可應用于分子輔助選擇的連鎖標記與目標性狀的距離需(5cM,本發(fā)明中果梗長度主效QTL定位直接定位到SNP標記上，且L0D值為9.19，連鎖性和可靠性高，這對于提高分子標記輔助選擇的準確性和效率具有重要意義。
[0012](3)本發(fā)明根據(jù)定位的梨果梗長度性狀主效QTL位點連鎖標記Pyb07_095開發(fā)檢測梨果梗長度大小的SNP標記引物，用于預測QTL位點Pyb07_095上多態(tài)性表達果梗長度大小差異，為梨果實果梗長度大小的預先選擇提供了可靠的分子標記來源。
[0013](4)利用開發(fā)的SNP標記引物，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’ 29株雜交群體進行QTL位點Pyb07_095上多態(tài)性表達果梗長度大小差異基因型檢測，可將雜交群體分為兩組，與果實實際測量的果梗長度大和小相符。群體試驗表明，開發(fā)的SNP標記特異引物可以對后代果梗長度進行良好分型(圖2)，因此，具有良好的應用價值，可實現(xiàn)對梨果實果梗長度性狀的預先選擇和輔助育種。
[0014]四、【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為梨果梗長度主效QTL區(qū)間及SNP標記位點Pyb07_095在第7連鎖群上的位置。LG7代表的是‘八月紅’和‘碭山酥梨’合并遺傳連鎖圖譜的第7連鎖群。SNP標記名稱起始為‘Pyb’的代表來自‘八月紅’的SNP標記，起始名稱為‘Pyd’的代表來自‘碭山酥梨’的SNP標記。
[0015]連鎖群左側(cè)的數(shù)字是標記之間的遺傳距離，單位為cM。連鎖群右側(cè)的實心長方形指示QTL作圖區(qū)間。右邊的曲線圖為QTL的L0D分布圖，灰色線為3.0閾值。果實果梗長度QTL位點對應連鎖群上的Pyb07_095標記，其位于7連鎖群33.5 cM處，L0D值為9.19。
[0016]圖2為依據(jù)Pyb07_095開發(fā)的HRM特異標記引物，在‘八月紅’和‘碭山酥梨’后代29個個體中檢測的溶解曲線，可良好分型。熔解曲線:線型1—綠色曲線，16株個體，果梗長度平均值4.28 cm;線型2—藍色曲線，13株個體，果梗長度平均值3.36cm。兩組差值
0.92 cm，差異達到極顯著水平，(P小于0.01)。
[0017]五、【具體實施方式】實施例1:
梨果實果梗長度主效QTL連鎖的分子標記，是通過以下方法獲得的:a)利用‘八月紅’和‘碭山酥梨’(品種為公知公用，見文獻:張瑞萍等，梨AFLP標記遺傳圖譜構(gòu)建及果實相關 性狀的QTL定位，園藝學報，2011，38 (10):1991 - 1998)雜交獲得其102株？1后代單株。
[0018]b)利用RADseq方法高通量測序，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及后代進行分析，并統(tǒng)計分析多態(tài)性位點在后代群體中的遺傳類型，利用X 2測驗分析各標記分離是否符合3:1或1:1的孟德爾遺傳分離比例。
[0019]c)用Joinmap4.0分析軟件構(gòu)建‘八月紅’和‘碭山酥梨’的分子遺傳連鎖圖譜。將第b)步驟中得到的多態(tài)性標記位點按Joinmap4.0分析軟件中適于CP群體構(gòu)圖的格式導入Joinmap4.0，排除缺失數(shù)據(jù)過多的位點和顯著偏分離的位點，卡方檢測的P值為0.05，選擇Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖。
[0020]d)對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及其匕群體單株的果實果梗長度進行測定，測定方法采用游標卡尺的方法。
[0021]e)將果梗長度的表型值和標記信息的相關文件導入MapQTL5.0軟件，選擇區(qū)間作圖法，以L0D值> 3.0為標準，對梨的果梗長度進行QTL分析和定位。結(jié)果表明，在‘八月紅’和‘碭山酥梨’的第7連鎖群上檢測到果梗長度的主效QTL位點(圖1)，對該性狀的貢獻率為25.68%，其對應的SNP標記Pyb07_095在連鎖群上的遺傳距離為33.5 cM, L0D值為
9.19。
[0022]f)利用SNP標記位點Pyb07_095開發(fā)HRM特異引物。
[0023]通過梨全基因組數(shù)據(jù)庫(http://peargenome.njau.edu.cn/),搜索出第7連鎖群上SNP標記Pyb07_095的DNA序列，選取的該位點前后200 bp的序列，依據(jù)引物設計原則，開發(fā)設計SNP標記引物。正向引物序列LFP-F為‘5- TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3’；反向引物LFP-R為5 GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3’。擴增產(chǎn)物序列大小249bp，利用設計的SNP標記引物在‘八月紅’和‘碭山酥梨’的基因組DNA上進行PCR擴增，引物均擴增正常，PCR產(chǎn)物符合預測大小。因此，該引物可作為梨果梗長度性狀的檢測標記。
[0024]g)利用HRM技術(shù)對梨果實果梗長度進行分型。
[0025]HRM 反應體系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒中的說明書進行，HRM分析是在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀上進行。
[0026]10 μ L反應體系:含有2 ng.μ L-1梨基因組DNA模板，1 X Master Mix,.2.0 mmol.L—1 MgCl2,0.2 mmol.L—1權(quán)利要求1所述的引物；擴增程序采用降落式PCR(touchdown PCR):95 °C預變性 10 min,然后 95 °C 變性 10 s、60 ~55 °C (每循環(huán)下降.0.5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序進行45個循環(huán)。
[0027]PCR循環(huán)結(jié)束后進行熔解，其程序為:95 ° Cl min, 40 ° C I min, 65 ° CI S，再從65 ° C連續(xù)升溫至95 ° C，每升高0.04 ° C，收集熒光I次，最后降溫至40
° C。
[0028]最后，在LightCycler? 480 II 的 Gene Scanning 軟件中 1.5 version 自動生成擴增產(chǎn)物的熔解曲線
利用g)步驟中得到的SNP標記引物對‘八月紅’ X ‘碭山酥梨’的29個雜交后代群體進行HRM分析(圖2)。
[0029]線型I一綠色曲線， 16個體線型相似，平均值4.28 cm，為果梗長度大；
線型2—藍色曲線，13個體線型相似，平均值3.36 cm，為果梗長度小。
[0030]統(tǒng)計分析表明，29個個體分型為兩種基因型，分離比例為16:13。根據(jù)QTL位點Pyb07_095上多態(tài)性表達果梗長度大小差異基因分型結(jié)果將29個個體的果梗長度表型數(shù)據(jù)，進行顯著性測驗，測驗結(jié)果顯示兩類基因型的個體果梗長度差值為0.92 cm，差異極顯著(P=0.0002)。因此，通過對果梗長度性狀的表型測定結(jié)果與HRM分型結(jié)果的比較分析，證明該特異SNP標記可檢測QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達果梗長度大小的差異，對梨果實果梗長度良好分型。
【權(quán)利要求】
1.一種與梨果實果梗長度主效QTL位點緊密連鎖的SNP標記引物，其特征在于:正向引物 LFP-F 5，- TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3，反向引物 LFP-R 5，- GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3，該引物用來檢測登錄號為AJSUOOOOOOOO的梨基因組序列scaffold278.0的第502462個堿基處是否存在一個與梨果實果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095，同時檢測QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達果梗長度大小的差異，該位點位于第7連鎖群的33.5 cM處，其解釋了遺傳變異的25.68%，對應的SNP標記為Pyb07_095，LOD值為9.19。
2.權(quán)利要求1所述引物用于檢測梨果實果梗長度主效QTL位點的SNP標記方法，其特征在于:HRM 反應體系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒中的說明書進行，HRM分析是在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀上進行；10 μ L反應體系:含有2 ng.μ l-1梨基因組DNA模板、1 X Master Mix,2.0 mmol?I71 MgCl2、0.2 mmol.I71權(quán)利要求1所述的引物；擴增程序采用降落式PCR:95 °C預變性10 min，然后95 V變性10 s、60~55 °C，每循環(huán)下降0.5 °C，退火15 s、72 V延伸12 s的程序進行45個循環(huán)；如果擴增產(chǎn)物序列大小在249bp，表明存在 一個與梨果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095 ；PCR循環(huán)結(jié)束后進行熔解，其程序為:95 ° C 1 min, 40 ° C 1 min, 65 ° C 1 s，再從65 ° C連續(xù)升溫至95 ° C，每升高0.04 ° C，收集熒光1次，最后降溫至40 ° C;最后，在 LightCycler? 480 II 的 Gene Scanning 軟件中 1.5 version 自動生成擴增產(chǎn)物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果實果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095上表達的果梗長度大的品種和表達的果梗長度小的品種為對照，檢測QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達果梗長度大小的差異，如果未知品種得到的擴增產(chǎn)物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果實果梗長度主效QTL位點Pyb07_095上的多態(tài)性表達的果梗長度大小和對照相似。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述的已知具有與梨果實果梗長度相關的QTL位點Pyb07_095上表達的果梗長度大的品種為‘碭山酥梨’，表達的果梗長度小的品種為‘八月紅，。
4.權(quán)利要求1所述引物在梨分子育種中的應用。
5.權(quán)利要求2或3所述方法在梨分子育種中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103740828SQ201410014478
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】吳俊 , 張紹鈴, 李雷廷, 齊開杰, 劉倫, 謝智華, 陳惠
申請人:南京農(nóng)業(yè)大學