一種指導β-受體阻斷藥用藥的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種指導β-受體阻斷藥用藥的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法。本發(fā)明試劑盒包括超純水，X溶液，10×PCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，特點是PCR引物包括以下3個與β-受體阻斷藥用藥相關基因上的3個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其基因序列如SEQ?ID?NO.1～NO.11所示；其使用方法包括采集樣本并提取核酸的步驟；以提取的核酸為模板進行PCR反應的步驟；最后GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品的步驟，優(yōu)點是特異性強、準確度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果。
【專利說明】—種指導β-受體阻斷藥用藥的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及多重基因檢測試劑盒及其使用方法，尤其是涉及一種指導β -受體阻斷藥用藥的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]β_受體阻斷藥是五種一線降壓藥之一，受體阻滯劑是能選擇性地與β腎上腺素受體結合、從而拮抗神經遞質和兒茶酚胺對β受體的激動作用的一種藥物類型。腎上腺素受體分布于大部分交感神經節(jié)后纖維所支配的效應器細胞膜上，其受體分為3種類型，即β I受體、β2受體和β 3受體。βI受體主要分布于心肌，可激動引起心率和心肌收縮力增加；β 2受體存在于支氣管和血管平滑肌，可激動引起支氣管擴張、血管舒張、內臟平滑肌松弛等；β3受體主要存在于脂肪細胞上，可激動引起脂肪分解。這些效應均可被β受體阻滯劑所阻斷和拮抗。研究表明，降壓藥物的療效與藥物遺傳多態(tài)性有密切關系，如能在用藥前測定病人的基因類型，有目的地選擇藥物和藥物劑量，既可使疾病得到及時有效的治療、減少不良反應的發(fā)生，也能減少醫(yī)療費用的支出。 [0003]現(xiàn)有的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測方法主要為基因芯片法、熒光定量PCR (qPCR)和Sanger測序法。
[0004](I) qPCR檢測方法:采用熒光淬滅及雙末端標記技術，針對SNP位點變異設計特異性的探針。其優(yōu)點是靈敏度高、準確性強。其缺點是(I)通量低:不適宜多SNP位點的檢測；難以設置內控基因。(2)成本較高:探針標記成本高；若需獲得所有相關SNP信息，需進行多個檢測試驗，疊加成本更加昂貴。
[0005](2)基因芯片法:基因芯片是通過微加工技術，將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規(guī)律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。DNA芯片:由于高通量等優(yōu)點在SNP檢測中得到大量應用，依靠野生型與突變型基因雜交動力學的差異對突變位點進行檢測。其優(yōu)點是:(1)高通量并行檢測；(2)操作簡便快速:整個檢測只需4-8小時基本可以出結果。缺點:1)不同SNP位點之間的雜交動力學差異不同，在進行多位點同時檢測時條件難以控制；2)技術成本昂貴、復雜:每個樣品需要一個芯片，成本大于Y1000/樣品，不利于大規(guī)模推廣；探針的合成與固定比較復雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；3)重復性差，準確性低，易出現(xiàn)假陽性假陰性結果；4)靈敏度較低:芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由于引物較多，容易自身產生二聚體，發(fā)夾結構，或由于Tm值不同，而導致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度；5)由于芯片的種類較多，難以制定一個統(tǒng)一的質量控制標準。
[0006](3)Sanger (雙脫氧鏈終止法)測序法:Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。其優(yōu)點是SNP分析金標準，能發(fā)現(xiàn)已知SNP，也能發(fā)現(xiàn)未知SNP。缺點是每個樣本的每個位點均需要經PCR擴增，跑膠，然后切膠純化，再測序。步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長，多個SNP位點檢測累計價格相對昂貴。
[0007]多重SNP位點檢測方法基于多重PCR和毛細管電泳(CE)分離技術。采用多重PCR方法，在同一個反應管中同時加入> I對特異性基因擴增引物及反應內參引物，根據(jù)基因擴增片段的大小用毛細管電泳分離分析多個SNP位點及基因型，能快速有效地檢測多個SNP位點，克服了傳統(tǒng)方法存在的缺陷，具有以下優(yōu)勢:
[0008]1、高通量:本系統(tǒng)實現(xiàn)單個反應檢測30-40個位點。
[0009]2、準確性強:采用CE對PCR產物進行分離，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；
[0010]3、敏感性高，結果重復性好:本系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)PCR擴增方法的不均等擴增造成的偏差，提高了對一套目的基因進行定性的速度和敏感性，采用激光誘導熒光-PMT，具有超高靈敏度；
[0011]4、方法簡便，使用經濟:本發(fā)明提供從試劑、多重PCR引物設計、結果分析等全套實驗方案；每個樣品的檢測成本少于Y50,利于大規(guī)模推廣；
[0012]5、靈活性強:可隨時根據(jù)需求調整檢測的靶基因。
[0013]6、易于實現(xiàn) 自動化。
[0014]目前，國內外還沒有關于基于多重PCR和CE的多重SNP檢測指導β -受體阻斷藥用藥的試劑盒及其使用方法的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0015]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果的基于多重SNP檢測系統(tǒng)的指導β -受體阻斷藥用藥的引物組合物。
[0016]本發(fā)明所要解決的技術問題還在于提供包含上述引物組合物的試劑盒及其使用方法。
[0017]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術手段是:一種用于指導β -受體阻斷藥用藥的引物組合物，包括以下3個與β -受體阻斷藥用藥相關基因上的3個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其核酸序列如下表1所示:
[0018]表1
[0019]
【權利要求】
1.一種用于指導β-受體阻斷藥用藥的引物組合物，其特征在于，包括以下3個與β -受體阻斷藥用藥相關基因上的3個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其核酸序列如下:
2.一種指導β_受體阻斷藥用藥的多重基因檢測試劑盒，其特征在于，包括如權利要求I所述的引物組合物、PCR反應液和陽性對照品；所述PCR反應液包括以下組分:超純水，X溶液，10XPCR緩沖液，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種指導β_受體阻斷藥用藥的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID N0.12所示；反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID N0.13所示；所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種指導β_受體阻斷藥用藥的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照品為上述3個與β -受體阻斷藥用藥相關基因上的3個SNP位點上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
5.一種指導β_受體阻斷藥用藥的多重基因檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)采集樣本并提取核酸 采集患者口腔拭子或血液樣品，從中提取核酸； (2)以提取的核酸為模板進行PCR反應 取DNA樣品2 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，25mM的氯化鎂3.4 μ L，PCR弓丨物溶液2 μ L，DNA聚合酶0.6 μ L，X溶液2 μ L，超純水10 μ L混勻后加入到96孔樣品板上進行PCR反應，反應條件:95°C I分鐘-M0C 30秒鐘，60。。30秒鐘，70。。I分鐘，循環(huán)35次；70°C I分鐘；4°C直至收取PCR產物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA如SEQ ID N0.12所示；反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA如SEQ ID N0.13所示；所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記；PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為200nM，所述的PCR引物包括以下3個與β -受體阻斷藥用藥相關基因上的3個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.1~N0.11所示； (3)毛細電泳分離樣品 取PCR產物0.1-1 μ L，上樣緩沖液38.75 μ L，DNA標準品0.5 μ L，礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進行毛細電泳分離樣品，將遺傳分析儀的軟件獲得的圖譜與標準圖譜對比，獲得指導β_受 體阻斷藥用藥相關基因的SNP位點的等位基因型。
【文檔編號】C12N15/11GK103740831SQ201410014962
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權日:2014年1月13日
【發(fā)明者】南麗, 曾縣平, 吳勇, 呂軍英 申請人:寧波海爾施基因科技有限公司