一種天然哺乳動物尿酸酶制備方法
【專利摘要】一種天然哺乳動物尿酸酶制備方法，所述方法包括如下步驟：(1)預處理：將新鮮哺乳動物肝臟均質破碎后，用pH值介于7.2-8.8之間的緩沖液洗滌，洗滌沉淀用pH值介于9.7-10.5之間的緩沖液溶解，得尿酸酶初提液；(2)粗純化：將上述初提液進行硫酸銨分級沉淀及溶解，復溶液進行陰離子交換層析純化，得尿酸酶粗純品溶液；(3)精純化：將上述尿酸酶粗純品溶液進行親和層析純化，得純度高于97.0％的尿酸酶純品溶液。該制備方法未包含尿酸酶失活變性步驟、制備周期短、收率高，所得產(chǎn)品酶比活性高、純度高，可用于天然或重組哺乳動物尿酸酶結構功能、理化性質及免疫原性研究。
【專利說明】一種天然晡乳動物尿酸酶制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種天然哺乳動物尿酸酶制備方法，屬生物工程和酶制劑【技術領域】。
【背景技術】
[0002]尿酸酶(EC1.7.3.3.，Uricase)是嘌呤代謝過程中存在的一種氧化酶，在氧氣存在的情況下它能催化尿酸生成過氧化氫和5-羥基異尿酸，后者在水中會自發(fā)轉化為尿囊素并放出二氧化碳。尿酸酶蛋白廣泛存在于微生物(芽孢桿菌、曲霉菌)(Bayol A，Capdevielle J, Malazzi P,et al.Biotechnol Appl Biochem.2002.36(Ptl):21_31.)、植物(豆類植物)(Lucas K, Boland MJ, Schubert KR.Arch Biochem Biophys.1983.226 (I):190-197.)及動物(哺乳動物、兩棲動物)(Varela-Echavarria A,Montes de Oca-Luna R,Barrera-Saldana HA.FASEB J.1988.2(15):3092-3096.)中。晶體衍射結果表明活性尿酸酶是由四個結構相同的尿酸酶單體非共價締合而成的同源四聚體:首先兩個單體蛋白彼此頭尾相連形成環(huán)狀二聚體；之后兩個環(huán)狀二聚體上下重疊形成四聚體(Gabison L，ChiadmiM,El Hajji M,et al.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2010.66(Pt6):714-724.)。在多種哺乳動物(小鼠、大鼠、豬、犬、羊或兔)肝臟中發(fā)現(xiàn)了活性尿酸酶蛋白。尿酸酶以天然結晶的形式存在于哺乳動物肝臟過氧化物酶體中，是過氧化物酶體擬核的主要組成部分；尿酸酶蛋白在核糖體內翻譯后，需經(jīng)復雜的定向轉運過程進入過氧化物酶體(GoldmanBM, Blobel G.Proc Natl Acad Sci USA.1978.75(10):5066-5070.)，并在此過程中逐漸聚集結晶，起到降解尿酸和支撐擬核骨架的雙重作用(Antonenkov VD,Grunau S,OhlmeierS, et al.Antioxid Redox Signal.2010.13 (4):525-537.),但該形式尿酸酶翻譯后轉運和聚集機制及其他生物學功能至今未知。
[0003]高尿酸血癥是人體內嘌呤代謝紊亂導致的代謝類疾病，而痛風則是由慢性高尿酸血癥進一步發(fā)展而形成的因`尿酸結晶沉積到腎臟、關節(jié)和軟組織導致的慢性疾病(ChoiHK, Mount DB, Reginato AM.Ann Intern Med.2005.143 (7):499-516.)。本質上，高尿酸血癥是人在進化過程中由于尿酸酶基因突變失活而引起的，突變在人尿酸酶基因編碼序列中引入提前終止密碼子，人類因此而不能自身合成活性尿酸酶，從而導致嘌呤分解代謝終止于尿酸(Christen P, Peacock WC, Christen AE, et al.EurJ Biochem.1970.12(1):3-5.)。其他哺乳動物體內均存在活性尿酸酶，它可將溶解性低的尿酸鹽轉變?yōu)橐兹艿哪蚰宜?Shnitka TK.J Ultrastruct Res.1966.16(5):598-625.)，由腎臟更有效的排泄。目前國內無任何尿酸酶類藥物上市，國際上已上市的尿酸酶類藥物有1975年法國批準上市的天然提取 Aspergillus fIavus 來源尿酸酶(Uricozyme) (Patte C, SakirogluC，Ansoborlo S，et al.Ann Oncol.2002.13 (5):789-795.) ,2002 年 FDA 批準上市的重組 Aspergillus fIavus 來源尿酸酶(Rasburicase) (Cammalleri L, MalaguameraM.1nt J Med Sc1.2007.4(2):83-93.)和 2010 年 FDA 批準上市的 PEG 修飾重組豬源尿酸酶(Pegloticase)(Schlesinger N, Yasothan U, Kirkpatrick P.Nat Rev DrugDiscov.2011.10(1):17-18.)。Uricozyme 和 Rasburicase 僅可用于腫瘤化療引起的急性高尿酸血癥的短期治療，其療效較別嘌呤醇顯著(Goldman SC, Holcenberg JS, FinklesteinJZ, et al.Blood.2001.97(10):2998-3003.)，然而，由于微生物來源尿酸酶與推測出的人尿酸酶的同源性低于40%，多次給藥后病人體內極易產(chǎn)生抗體(Pui CH, Mahmoud HH,Wiley JM, et al.J Clin Oncol.2001.19(3):697-704.)，無法用于慢性痛風的長期治療。Pegloticase未修飾蛋白基因來源于豬，因其與人尿酸酶的同源性高于90%,免疫原性低，經(jīng)PEG長效化修飾后，可用于慢性高尿酸血癥和痛風的長期治療，具有快速消融痛風石的獨特功效。
[0004]提取制備高純度哺乳動物尿酸酶蛋白，對其進行結構確認、酶比活性及免疫原性分析，不僅可用于哺乳動物尿酸酶翻譯后轉運和聚集機制及其他生物學功能研究，還可作為參考品進行哺乳動物尿酸酶類藥物臨床前藥學性質研究。然而，目前尚無商業(yè)化高純度活性哺乳動物尿酸酶蛋白出售，且未見文獻公開天然哺乳動物尿酸酶蛋白提取及純化方法。目前可獲及的哺乳動物尿酸酶相關文獻主要側重于基因工程重組尿酸酶研究，均未涉及天然哺乳動物尿酸酶提取及制備方法。另一方面，Liu等人(Liu J, Li G, Liu H, ZhouX.Appl Biochem Biotechnol.1994.47 (I):57-63.)和 Rainbird等人(Rainbird RM, AtkinsCA.Biochim Biophys Acta.1981.659 (I):132-140.)分別公開了假絲酵母和βΧ?根瘤尿酸酶提取純化方法，但鑒于哺乳動物肝臟組織與微生物和植物根瘤構造的差異性，上述研究資料均無法直接用于高純度哺乳動物尿酸酶制備。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種高純度天然哺乳動物尿酸酶制備方法。該方法未包含尿酸酶失活變性步驟、制備周期短、收率高，所得產(chǎn)品酶比活性高、純度高，可作為生化標準品，用于天然或重組哺乳動物尿酸酶結構功能、理化性質及免疫原性研究。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為:一種天然哺乳動物尿酸酶制備方法，所述方法包括如下步驟:
[0007]I)預處理:將新鮮哺乳動物`肝臟均質破碎后，用pH值介于7.2-8.8之間的緩沖液洗滌，洗滌沉淀用pH值介于9.7-10.5之間的緩沖液溶解，得尿酸酶初提液；
[0008]2)粗純化:將上述初提液進行硫酸銨分級沉淀，復溶緩沖液溶解，復溶液進行陰離子交換層析純化，得尿酸酶粗純品溶液；
[0009]3)精純化:將上述尿酸酶粗純品溶液進行親和層析純化，得純度高于97.0%的尿酸酶純品溶液。
[0010]作為優(yōu)選，上述步驟I)預處理所述的哺乳動物為小鼠、大鼠、豬、犬、羊或兔。上述動物均為實驗研究常用的哺乳動物，本發(fā)明人經(jīng)過逐個試驗，發(fā)現(xiàn)上述方法均可用于高純度小鼠、大鼠、豬、犬、羊或兔等哺乳動物尿酸酶制備。
[0011]作為優(yōu)選，上述步驟I)預處理所述洗滌緩沖液包括磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨酸甲烷-鹽酸緩沖液；洗滌緩沖液濃度介于IOmM-0.2M之間；洗滌緩沖液與動物肝臟的混合比例介于5: 1-20: I之間(體積質量比，mL: g)。經(jīng)研究，硼酸鹽緩沖液在pH8.0以下時，緩沖能力較弱，而磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨酸甲烷-鹽酸緩沖液在濃度介于IOmM-0.2M之間時，在pH7.2-8.8范圍內均可保持良好的緩沖能力。
[0012]優(yōu)選的，洗滌緩沖液與動物肝臟的混合比例介于5: 1-20: I之間(體積質量比，mL: g)。
[0013]作為優(yōu)選，上述步驟I)預處理所述溶解緩沖液為碳酸鹽緩沖液；溶解緩沖液濃度介于50mM-0.2M之間；溶解緩沖液與動物肝臟洗滌后沉淀的混合比例介于50: 1-200: I之間(體積質量比，mL: g)。本發(fā)明人經(jīng)溶解pH篩選發(fā)現(xiàn)，當pH值低于9.6時，因靠近其等電點，無法充分溶解混于肝臟碎片中的尿酸酶蛋白；pH值高于10.8時，雖可使尿酸酶蛋白充分溶解，但酶活測定結果顯示，此時尿酸酶蛋白已變性失活?；钚阅蛩崦傅鞍诪榉枪矁r作用締合而成的同源四聚體蛋白，該結構對PH和變性劑均高度敏感；pH高于10.8時，活性四聚體尿酸酶蛋白將被不可逆的解聚為單體蛋白，導致其變性失活。為保持尿酸酶活性并進一步提高其溶解度，本發(fā)明確定的較優(yōu)的尿酸酶蛋白溶解PH值介于9.7-10.5之間。在此pH范圍內具有良好緩沖能力的緩沖液包括碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液和硼砂-氫氧化鈉緩沖液等。經(jīng)研究，單位體積下，PH值介于9.7-10.5之間的碳酸鹽緩沖液可溶解的活性尿酸酶蛋白量遠高于其他類型緩沖液；更進一步的研究表明，50mM以下時碳酸鹽緩沖能力較弱，且因離子強度低，活性尿酸酶溶解度較低；0.2M以上時因離子強度過高，存在部分鹽析特性，導致活性尿酸酶溶解度降低；50mM-0.2M的碳酸鹽溶解哺乳動物尿酸酶能力最強。鑒于哺乳動物尿酸酶溶解度較低，溶解緩沖液所需體積遠大于洗滌緩沖液體積，更具體的，溶解緩沖液與動物肝臟洗滌后沉淀的混合比例介于50: 1-200: I之間(體積質量比，mL: g)。
[0014]作為優(yōu)選，上述步驟2)粗純化所述沉淀尿酸酶蛋白的硫酸銨飽和度介于
5.0% -15.0%之間；尿酸酶蛋白復溶緩沖液與預處理所述溶解緩沖液相同；復溶緩沖液體積為尿酸酶初提液體積的20% -50%。硫酸銨分級沉淀是常用的濃縮、純化粗提蛋白的方法。哺乳動物尿酸酶蛋白35%以上的氨基酸為疏水性氨基酸(Colloc’h N, Poupon A,MomonJP.Proteins.2000.39(2):142-54.)，利用該特性并結合硫酸銨分級沉淀，可去除大部分疏水性低的蛋白雜質，并進一步濃縮尿酸酶蛋白。鑒于哺乳動物尿酸酶蛋白較強的疏水性，硫酸銨飽和度介于5.0% -15.0%之間時，可使97.0%以上的活性尿酸酶蛋白沉淀。利用與尿酸酶初溶一致的緩沖液即可充分溶解被硫酸銨沉淀的活性尿酸酶蛋白；同時，因此時雜質蛋白含量降低，僅需尿酸酶初提液體積的20% -50%即可使90.0%以上的活性尿酸酶蛋白重新溶解(與尿酸酶初提液相比)。
[0015]作為優(yōu)選，上述步驟2)粗純化所述陰離子交換層析純化介質為偶聯(lián)二乙基(2-羥丙基)氨基乙基(QAE)或二乙氨基乙基(DEAE)基團的瓊脂糖系列離子交換介質。偶聯(lián)二乙基(2-羥丙基)氨基乙基，即QAE。二乙氨基乙基，即DEAE。具體的，DEAE Sepharose FastFlow和QAE Sepharose Fast Flow填料,可較好的用于哺乳動物尿酸酶蛋白離子交換層析純化。
[0016]作為優(yōu)選，上述步驟2)粗純化所述陰離子交換層析純化包含下述步驟:待陰離子交換層析柱用復溶緩沖液平衡后，將硫酸銨沉淀復溶樣品進行上樣，復溶緩沖液復平衡后，用含0.1M-0.3M氯化鈉的復溶緩沖液洗脫，收集洗脫樣品。
[0017]作為優(yōu)選，上述步驟3)精純化所述親和層析純化包含下述步驟:待黃嘌呤親和層析柱用復溶緩沖液平衡后，將尿酸酶粗純品樣品進行上樣，復溶緩沖液復平衡后，用含0.05mM-0.2mM黃嘌呤的復溶緩沖液洗脫，收集洗脫樣品。
[0018]作為優(yōu)選，上述步驟3)精純化所述尿酸酶精純品，其純度測定方法為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和反相-高效液相色譜(RP-HPLC)測定。更具體的，常規(guī)15.0 %等梯度還原SDS-PAGE即可準確測定尿酸酶蛋白電泳純度，電泳所需分離膠、濃縮膠、電泳緩沖液、樣品緩沖液、染色液和脫色液等均與《中華人民共和國藥典》2010年版三部附錄IV C “SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法” 一致，電泳所用Marker即為常規(guī)中分子量Marker。常規(guī)全梯度RP-HPLC即可準確測定尿酸酶蛋白液相純度，更具體的，RP-HPLC所用分析柱為C4、CS或C18反相分析型色譜柱；分析所用A、B液分別為添加了 0.1%三氟乙酸的DDW和乙腈；洗脫梯度為0-30min，B從5-95% ;檢測波長為214nm。
[0019]本發(fā)明創(chuàng)造性的開發(fā)了從哺乳動物肝臟提取高純度尿酸酶方法，操作步驟簡單、未包含尿酸酶失活變性步驟、制備周期短、收率高，所得產(chǎn)品酶比活性保留率高、SDS-PAGE純度和RP-HPLC純度均高于97.0 %，不僅可用于哺乳動物尿酸酶翻譯后轉運和聚集機制及其他生物學功能研究，還可作為參考品進行哺乳動物尿酸酶類藥物臨床前藥學性質研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]附圖1:精純 化后哺乳動物尿酸酶蛋白SDS-PAGE電泳圖譜(從左起，條帶1:小鼠尿酸酶蛋白；條帶2:大鼠尿酸酶蛋白；M:中分子量蛋白marker ;條帶3:豬尿酸酶蛋白；條帶4:犬尿酸酶蛋白；條帶5:羊尿酸酶蛋白；條帶6:兔尿酸酶蛋白。)
[0021]附圖2:精純化后犬尿酸酶蛋白RP-HPLC圖譜
【具體實施方式】
[0022]以下對本發(fā)明的特點進行描述，所舉實施例僅為說明目的而并不旨在對本發(fā)明進行限制。
[0023]實施例1.高純度天然小鼠尿酸酶蛋白制備
[0024](I)稱取新鮮小鼠肝臟10g，用均質機均質后，將其與150mL洗滌緩沖液(25mM三羥甲基氨酸甲烷-鹽酸緩沖液，PH7.8)混合，室溫攪拌1.5-3h后離心，離心沉淀用上述洗滌緩沖液反復洗滌2-4次；
[0025](2)將肝臟洗滌后沉淀與750mL溶解緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗΙΟ.2)混合，室溫攪拌過夜后離心，離心后上清即為尿酸酶初提液；
[0026](3)在750mL尿酸酶初提液中補入75mL飽和硫酸銨溶液，靜止過夜后離心，沉淀用250mL復溶緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗΙΟ.2)復溶過夜，離心后上清進行陰離子層析純化；
[0027](4)取QAE Sepharose Fast Flow填料,裝入層析柱,用再生液(2M NaCl)沖洗5個柱體積后，用復溶緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗΙΟ.2)平衡，將硫酸銨沉淀復溶樣品上樣，用復溶緩沖液復平衡，檢測A28tol,穿透峰棄去，待A28tlnm下至基線后，用含0.2M NaCl的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得尿酸酶粗純品溶液；
[0028](5)取黃嘌呤親和填料，裝入層析柱，用含0.15mM黃嘌呤的復溶緩沖液沖洗5個柱體積后，用平衡液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗΙΟ.2)平衡，將尿酸酶粗純品溶液上樣，檢測A28tol,穿透峰棄去，待A28tlnm下至基線后，用含0.15mM黃嘌呤的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得小鼠尿酸酶純品溶液。
[0029]實施例2.高純度天然大鼠尿酸酶蛋白制備[0030](I)稱取新鮮大鼠肝臟20g，用均質機均質后，將其與300mL洗滌緩沖液(25mM三羥甲基氨酸甲烷-鹽酸緩沖液，PH7.8)混合，室溫攪拌1.5-3h后離心，離心沉淀用上述洗滌緩沖液反復洗滌2-4次；
[0031](2)將肝臟洗滌后沉淀與1.5L溶解緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.2)混合，室溫攪拌過夜后離心，離心后上清即為尿酸酶初提液；
[0032](3)在1.5L尿酸酶初提液中補入150mL飽和硫酸銨溶液，靜止過夜后離心，沉淀用500mL復溶緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.2)復溶過夜，離心后上清進行陰離子層析純化；
[0033](4)取QAE Sepharose Fast Flow填料,裝入層析柱,用再生液(2M NaCl)沖洗5個柱體積后，用復溶緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.2)平衡，將硫酸銨沉淀復溶樣品上樣，用復溶緩沖液復平衡，檢測A28tol,穿透峰棄去，待A28tlnm下至基線后，用含0.2M NaCl的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得尿酸酶粗純品溶液；
[0034](5)取黃嘌呤親和填料，裝入層析柱，用含0.15mM黃嘌呤的復溶緩沖液沖洗5個柱體積后，用平衡液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.2)平衡，將尿酸酶粗純品溶液上樣，檢測A28tlnm,穿透峰棄去，待A28tlnm下至基線后，用含0.15mM黃嘌呤的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得大鼠尿酸酶純品溶液。
[0035]實施例3.高純度天然豬尿酸酶蛋白制備
[0036](I)稱取新鮮豬肝臟100g，用均質機均質后，將其與1.5L洗滌緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖，PH8.2)混合，室溫攪拌1.5-3h后離心，離心沉淀用上述洗滌緩沖液反復洗滌2-4次；
[0037](2)將肝臟洗滌后沉淀與7.5L溶解緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.2)混合，室溫攪拌過夜后離心，離心后上清即為尿酸酶初提液；
[0038](3)在7.5L尿酸酶初提液中補入750mL飽和硫酸銨溶液，靜止過夜后離心，沉淀用2.5L復溶緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.2)復溶過夜，離心后上清進行陰離子層析純化；
[0039](4)取QAE Sepharose Fast Flow填料,裝入層析柱,用再生液(2M NaCl)沖洗5個柱體積后，用復溶緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.2)平衡，將硫酸銨沉淀復溶樣品上樣，用復溶緩沖液復平衡，檢測A28tol,穿透峰棄去，待A28tlnm下至基線后，用含0.2M NaCl的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得尿酸酶粗純品溶液；
[0040](5)取黃嘌呤親和填料，裝入層析柱，用含60 μ M黃嘌呤的復溶緩沖液沖洗5個柱體積后，用平衡液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.2)平衡，將尿酸酶粗純品溶液上樣，檢測A28tol,穿透峰棄去，待A28tol下至基線后，用含90 μ M黃嘌呤的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得豬尿酸酶純品溶液。
[0041]實施例4.高純度天然犬尿酸酶蛋白制備
[0042](I)稱取新鮮犬肝臟100g，用均質機均質后，將其與1.5L洗滌緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖，PH8.0)混合，室溫攪拌1.5-3h后離心，離心沉淀用上述洗滌緩沖液反復洗滌2-4次；
[0043](2)將肝臟洗滌后沉淀與7.5L溶解緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.2)混合，室溫攪拌過夜后離心，離心后上清即為尿酸酶初提液；
[0044](3)在7.5L尿酸酶初提液中補入750mL飽和硫酸銨溶液，靜止過夜后離心，沉淀用2.5L復溶緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗΙΟ.2)復溶過夜，離心后上清進行陰離子層析純化；
[0045](4)取DEAE Sepharose Fast Flow填料,裝入層析柱,用再生液(2M NaCl)沖洗5個柱體積后，用復溶緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗΙΟ.2)平衡，將硫酸銨沉淀復溶樣品上樣，用復溶緩沖液復平衡，檢測A28tlnm，穿透峰棄去，待A28tol下至基線后，用含0.15M NaCl的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得尿酸酶粗純品溶液；
[0046](5)取黃嘌呤親和填料，裝入層析柱，用含60 μ M黃嘌呤的復溶緩沖液沖洗5個柱體積后，用平衡液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗΙΟ.2)平衡，將尿酸酶粗純品溶液上樣，檢測A28tol,穿透峰棄去，待A28tol下至基線后，用含90 μ M黃嘌呤的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得犬尿酸酶純品溶液。
[0047]實施例5.高純度天然羊尿酸酶蛋白制備
[0048](I)稱取新鮮羊肝臟100g，用均質機均質后，將其與0.5L洗滌緩沖液(IOmM磷酸鹽緩沖，PH7.2)混合，室溫攪拌1.5-3h后離心，離心沉淀用上述洗滌緩沖液反復洗滌2-4次；
[0049](2)將肝臟洗滌后沉淀與5.0L溶解緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗΙΟ.5)混合，室溫攪拌過夜后離心，離心后上清即為尿酸酶初提液；
[0050](3)在5.0L尿酸酶初提液中補入250mL飽和硫酸銨溶液，靜止過夜后離心，沉淀用2.5L復溶緩沖液(50m M碳酸鹽緩沖，ρΗΙΟ.5)復溶過夜，離心后上清進行陰離子層析純化；
[0051](4)取DEAE Sepharose Fast Flow填料,裝入層析柱,用再生液(2M NaCl)沖洗5個柱體積后，用復溶緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.5)平衡，將硫酸銨沉淀復溶樣品上樣，用復溶緩沖液復平衡，檢測A28tol,穿透峰棄去，待A28tlnm下至基線后，用含0.3M NaCl的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得尿酸酶粗純品溶液；
[0052](5)取黃嘌呤親和填料，裝入層析柱，用含60 μ M黃嘌呤的復溶緩沖液沖洗5個柱體積后，用平衡液(50mM碳酸鹽緩沖，ρΗ10.5)平衡，將尿酸酶粗純品溶液上樣，檢測A28tol,穿透峰棄去，待A28tol下至基線后，用含50 μ M黃嘌呤的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得羊尿酸酶純品溶液。
[0053]實施例6.高純度天然兔尿酸酶蛋白制備
[0054](I)稱取新鮮犬肝臟50g，用均質機均質后，將其與1.0L洗滌緩沖液(0.2M磷酸鹽緩沖，PH8.8)混合，室溫攪拌1.5-3h后離心，離心沉淀用上述洗滌緩沖液反復洗滌2-4次；
[0055](2)將肝臟洗滌后沉淀與10.0L溶解緩沖液(0.2M碳酸鹽緩沖，pH9.7)混合，室溫攪拌過夜后離心，離心后上清即為尿酸酶初提液；
[0056](3)在10.0L尿酸酶初提液中補入1.5L飽和硫酸銨溶液，靜止過夜后離心，沉淀用
2.0L復溶緩沖液(0.2M碳酸鹽緩沖，pH9.7)復溶過夜，離心后上清進行陰離子層析純化；
[0057](4)取DEAE Sepharose Fast Flow填料,裝入層析柱,用再生液(2M NaCl)沖洗5個柱體積后，用復溶緩沖液(0.2M碳酸鹽緩沖，pH9.7)平衡，將硫酸銨沉淀復溶樣品上樣，用復溶緩沖液復平衡，檢測A28tol,穿透峰棄去，待A28tlnm下至基線后，用含0.1M NaCl的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得尿酸酶粗純品溶液；
[0058](5)取黃嘌呤親和填料，裝入層析柱，用含60 μ M黃嘌呤的復溶緩沖液沖洗5個柱體積后，用平衡液(0.2Μ碳酸鹽緩沖，ρΗ9.7)平衡，將尿酸酶粗純品溶液上樣，檢測A28tol，穿透峰棄去，待A28tol下至基線后，用含200 μ M黃嘌呤的復溶緩沖液洗脫，收集含有尿酸酶蛋白的洗脫峰，即得兔尿酸酶純品溶液。
[0059]實施例7.尿酸酶蛋白SDS-PAGE純度測定
[0060](1)15%的分離膠配置
[0061]雙蒸水:3.3mL ；1.5M Tris-HCl (ρΗ8.8):2.5mL ；10% SDS:100 μ L ;30%丙烯酰胺單體貯液:4.0mL ；TEMED:4μ L ；10%過硫酸銨:100 μ L ;總體積:IOmL0混勻后加入電泳槽的玻璃板夾縫中，并在膠面上加入約Icm雙蒸水，待膠自然凝聚后，除凈雙蒸水，并在夾縫中放入梳子。
[0062](2) 5 %的濃縮膠配置
[0063]雙蒸水:3.4mL ；1M Tris-HCl (ρΗ6.8):0.63mL ；10% SDS:50 μ L ;30%丙烯酰胺單體貯液:0.83mL ；TEMED.5 μ L ;10%過硫酸銨:150 μ L ;總體積:5mL。混勻后，加入夾縫中并沒過梳孔，待凝聚后小心拔出梳子，用電泳緩沖液沖洗加樣孔，清除未凝聚的丙稀酰胺。
[0064](3)溶液配置
[0065]①電泳緩沖液(IOX):稱取Tris3.0g，甘氨酸14.4g，SDSl.0g，加適量的超純水溶解，用HCl調pH至8.3，加超純 水定容至1000mL。
[0066]②供試品緩沖液(4X):稱取Tris0.303g、溴酚藍2mg、SDS0.8g，量取鹽酸
0.189mL、甘油4mL，加水溶解并稀釋至10mL，使用前按體積比加入終濃度5%的β -巰基乙
醇，即得。
[0067]③考馬斯亮藍染色液稱取考馬斯亮藍R2501g，加入甲醇200mL、冰醋酸50mL、水250mL混勻，即得。
[0068]④考馬斯亮藍脫色液取甲醇400mL、冰醋酸IOOmL與水500mL混勻，即得。
[0069](4)樣品制備
[0070]將小鼠、大鼠、豬、犬、羊和兔尿酸酶純品樣品分別與4X凝膠樣品緩沖液3: I混勻，在100°C沸水中保溫4-5min，取出待用。
[0071](5)樣品測定
[0072]將樣品及標準蛋白加入點樣孔后，接通電源，恒壓電泳至溴酚藍到離底部約0.5cm時，停止電泳。將分離膠從玻璃板上取下，在染色液中染色l_2h，脫色8h，換保存液保存。
[0073]如附圖1所示，小鼠、大鼠、豬、犬、羊和兔尿酸酶純品電泳條帶均位于33.0kDa標準條帶附近，未見明顯雜質條帶，SDS-PAGE純度均高于97.0%。
[0074]實施例8.尿酸酶蛋白RP-HPLC純度測定
[0075]儀器:AglientllOOHPLC;色譜柱:Waters symmetry300TM(C4 5 μ m
4.6 X 250mm);流動相:A液為0.1 %三氟乙酸+水溶液；B液為0.1 %三氟乙酸+乙腈溶液；流速:1.0mL/min ;洗脫方式:0_30min，B從5-95%;檢測波長:214nn。取10 μ L犬尿酸酶純品樣品，按上述條件進行全梯度RP-HPLC純度測定。
[0076]如附圖2所示，犬尿酸酶純品RP-HPLC圖譜未見明顯雜質條帶，主峰RP-HPLC純度高于97.0%。
[0077]實施例9.尿酸酶蛋白酶比活性測定
[0078](I)單位體積酶活測定
[0079]尿酸標準曲線:稱取0.0840g尿酸于500ml容量瓶中，用0.1M四硼酸納(pH8.6)溶解至刻度，即為500 μ M尿酸，并依次稀釋至120、100、60、40、20、10 μ Μ，在波長293nm處測
定吸光度，確定尿酸濃度線性范圍，繪制尿酸溶液濃度與吸光值標準曲線。
[0080]酶活檢測方法:由于尿酸在293nm處有特征吸收峰，產(chǎn)物在此波長范圍內無吸收峰，而不同的尿酸濃度對應不同的吸光值，并且呈線性變化。隨著尿酸被尿酸酶降解，定時檢測293nm處吸光度的減少量以進行酶活換算。在比色杯中加入3mL37°C預熱的IOOyM尿酸溶液，再加入10 μ I適度稀釋的犬尿酸酶純品溶液并混勻，定時測定293nm處吸光度變化；測定時間3min(30S監(jiān)控一次)；根據(jù)標準曲線計算尿酸降解量，計算單位體積酶比活性。
[0081]I單位⑶酶活定義為，在37°C、pH8.6緩沖液條件下，每分鐘轉化I μ mo I尿酸所
需酶的量。
[0082](2)濃度測定(Lowry 法)
[0083]按Lowry法測定犬尿酸酶純品蛋白濃度。
[0084]①溶液配制
[0085]4%碳酸鈉溶液:稱取4.0g碳酸鈉，用蒸餾水溶解至100mL。
[0086]0.2M氫氧化鈉溶液:稱取0.8g氫氧化鈉，用蒸餾水溶解至100mL。
[0087]0.04M硫酸銅溶液:稱取1.0g硫酸銅,用蒸懼水溶解至100mL。
[0088]0.1M酒石酸鉀溶液:稱取2.0g酒石酸鉀，用蒸餾水溶解至100mL。
`[0089]堿性銅溶液:臨用前取試劑A和B各35mL，試劑C和D各0.7mL混勻配制而成。
[0090]酚試劑:購自上海生工生物工程有限公司。
[0091]標準蛋白質溶液:取蛋白含量測定國家標準品(批號:200919，含量:13.7mg/支)，用超純水準確稀釋至1.0mg/mL,為標準蛋白質備液。精確量取標準蛋白質備液
0.35mL，用超純水精確稀釋至3.5mL，作為標準蛋白質溶液(100 μ g/mL)。
[0092]②實驗方法
[0093]標準曲線:精確量取標準蛋白質溶液(100 μ g/mL) OmL,0.2mL、0.4mL、0.6mL、
0.8mL、l.0mL,分別置于試管中,用蒸懼水補至1.0mL,并加入5.0mL堿性銅溶液,混勻,室溫放置10分鐘，迅速加入0.5mL酚試劑，混勻，室溫放置30分鐘后檢測650nm波長吸光值，并根據(jù)蛋白濃度和吸光值繪制標準曲線；
[0094]將犬尿酸酶純品用DDW適當稀釋，操作同上，檢測樣品650nm波長吸光值，帶入標準曲線，計算相應蛋白濃度。
[0095]按上述方法測定，犬尿酸酶純品溶液酶比活性為18.5U/mg，表明本方法制備哺乳動物尿酸酶具有較好的酶比活性。
【權利要求】
1.一種天然哺乳動物尿酸酶制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 1)預處理:將新鮮哺乳動物肝臟均質破碎后，用PH值介于7.2-8.8之間的緩沖液洗滌，洗滌沉淀用pH值介于9.7-10.5之間的緩沖液溶解，得尿酸酶初提液； 2)粗純化:將上述初提液進行硫酸銨分級沉淀，復溶緩沖液溶解，復溶液進行陰離子交換層析純化，得尿酸酶粗純品溶液； 3)精純化:將上述尿酸酶粗純品溶液進行親和層析純化，得尿酸酶純品溶液。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述的哺乳動物為小鼠、大鼠、豬、犬、羊或兔。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟I)預處理所述洗滌緩沖液包括磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨酸甲烷-鹽酸緩沖液；洗滌緩沖液濃度介于IOmM-0.2M之間；以體積質量比mL.g計，洗滌緩沖液與動物肝臟的混合比例介于5: 1-20: I之間。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟I)預處理所述溶解緩沖液為碳酸鹽緩沖液；溶解緩沖液濃度介于50mM-0.2M之間；以體積質量比mL:g計，溶解緩沖液與動物肝臟洗滌后沉淀的混合比例介于50: 1-200: I之間。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟2)粗純化所述沉淀尿酸酶蛋白的硫酸銨飽和度介于5.0% -15.0%之間。
6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟2)粗純化所述尿酸酶蛋白復溶緩沖液與預處理所述溶解緩 沖液相同；復溶緩沖液體積為尿酸酶初提液體積的20% -50%。
7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟2)粗純化所述陰離子交換層析純化介質為偶聯(lián)二乙基(2-羥丙基)氨基乙基或二乙氨基乙基基團的瓊脂糖系列離子交換介質。
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟2)粗純化所述陰離子交換層析純化包含下述步驟:待陰離子交換層析柱用復溶緩沖液平衡后，將硫酸銨沉淀復溶樣品進行上樣，復溶緩沖液復平衡后，用含0.1M-0.3M氯化鈉的復溶緩沖液洗脫，收集洗脫樣品。
9.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟3)精純化所述親和層析純化包含下述步驟:待黃嘌呤親和層析柱用復溶緩沖液平衡后，將尿酸酶粗純品樣品進行上樣，復溶緩沖液復平衡后，用含0.05mM-0.2mM黃嘌呤的復溶緩沖液洗脫，收集洗脫樣品。
10.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟3)精純化所述尿酸酶精純品，其純度測定方法為常規(guī)還原型十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳或全梯度反相-高效液相色譜測定。
【文檔編號】C12N9/06GK103756983SQ201410015218
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權日:2014年1月10日
【發(fā)明者】張淳, 范開, 馮尚彩, 劉兆明 申請人:臨沂大學