多異瓢蟲特異性coi引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多異瓢蟲特異性COI引物以及含有該引物的檢測試劑盒，根據(jù)多異瓢蟲特有的mtDNA序列，設(shè)計(jì)了一對多異瓢蟲特異性COI引物HvF1和HvR1（SEQ?ID?No.1和2），該對引物僅對多異瓢蟲具有特異性擴(kuò)增能力，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為230bp，質(zhì)粒濃度檢出限為1.503567837E+05，DNA濃度檢出限為1.5ng/μL。本發(fā)明采用PCR技術(shù)，提高了檢測準(zhǔn)確性，節(jié)約了檢測時(shí)間，所述試劑盒產(chǎn)品適于基層推廣應(yīng)用。
【專利說明】多異瓢蟲特異性CO I引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及多異瓢蟲特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多異瓢蟲Hippodamia variegate (Goeze)屬昆蟲綱、鞘翅目、瓢蟲科瓢蟲亞科。常捕食棉蚜、麥蚜、豆蚜、玉米蚜等蚜蟲，所以多見于棉花、小麥、豇豆、玉米等農(nóng)作物中。多異瓢蟲起源于古北區(qū)，在歐洲是常見的蚜蟲捕食者，同時(shí)在南非、肯尼亞、印度、中國、加拿大、美國、智利都有記載。在我國新疆、山東等地，多異瓢蟲是棉蚜的重要捕食性天敵；在南非，它對麥雙尾蚜的害蟲控制作用也非常顯著。由此可見，多異瓢蟲是一種有效地生物防治物種。
[0003]同時(shí)，多異瓢蟲也捕食同一生境的其他自然天敵，該捕食現(xiàn)象稱為集團(tuán)內(nèi)捕食作用。隨著對該作用研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)其對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中不同物種的種群動(dòng)態(tài)以及對害蟲生物防治效果產(chǎn)生復(fù)雜而巨大的影響。在研究方法學(xué)方面，發(fā)現(xiàn)常規(guī)的腸道解剖、行為觀察等傳統(tǒng)研究方法無法準(zhǔn)確評(píng)估瓢蟲集團(tuán)內(nèi)瓢蟲之間的捕食作用。目前，對多異瓢蟲進(jìn)行特異性檢測的方法尚未建立，在物種鑒定領(lǐng)域，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction, PCR)技術(shù)因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速等優(yōu)點(diǎn)而占據(jù)重要地位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供多異瓢蟲特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)多異瓢蟲的線粒體DNA序列，設(shè)計(jì)一對多異瓢蟲特異性COI引物，其包括:
[0006]正向引物HvFl:5’ -GGAAGATTAATTGGAAATGAT-3’
[0007]反向引物HvRl:5 ’ -CCTATTTCAACAATTCTTCTAAAT-3 ’。
[0008]本發(fā)明還提供含有引物HvFl和HvRl的用于檢測多異瓢蟲的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液等中的至少一種。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0009]本發(fā)明還提供所述引物HvFl和HvRl，以及含有引物HvFl和HvRl的試劑盒在檢測多異瓢蟲中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供一種多異瓢蟲的特異性快速PCR檢測方法，包括以下步驟:
[0011]I)提取樣品DNA;
[0012]2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物HvFl和HvRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0013]3)分析PCR產(chǎn)物。[0014]PCR反應(yīng)體系以20 μ L計(jì)為:
[0015]
【權(quán)利要求】
1.多異瓢蟲特異性COI引物，其特征在于，其包括: 正向引物 HvFl:5’ -GGAAGATTAATTGGAAATGAT-3’ 反向引物 HvRl:5’ -CCTATTTCAACAATTCTTCTAAAT-3’。
2.含有權(quán)利要求1所述引物的用于檢測多異瓢蟲的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
5.權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述試劑盒在檢測多異瓢蟲中的應(yīng)用。
6.多異瓢蟲的特異性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取樣品DNA； 2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物HvFl和HvRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以20μ L計(jì)為:
模板 DNA1.0llL
2.5mM dNTPs0.4li L
1(^1^引物}^「丨0.4μ?
ΙΟμΜ 引物 HvRl0.4liL
5U&L Easy Taq DNA聚合酶0_2μ?
10 X Easy 緩沖液2.0μ.?CidH2O補(bǔ)足至 20μΕ。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為:94°C4分鐘；94°C30秒，56 0C 30秒，72 0C 30秒 ，共40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103757015SQ201410015249
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】楊帆, 王倩, 陸宴輝, 徐建祥 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所