菊屬及近緣屬植物通用ssr分子標(biāo)記cssr2及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標(biāo)記CSSR2，用于PCR擴(kuò)增所述標(biāo)記CSSR2的引物序列如Seq?ID?No.1和2所示。本發(fā)明還提供了所述SSR標(biāo)記在菊屬與亞菊屬的屬間雜交種鑒定中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供了擴(kuò)增所述SSR分子標(biāo)記的方法，建立了一個(gè)在菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料之間通用的SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系，該標(biāo)記可以用于進(jìn)行菊屬，亞菊屬及太行菊屬屬內(nèi)和屬間的雜種鑒定，植物遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種等，應(yīng)用前景十分廣闊。
【專利說(shuō)明】菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標(biāo)記CSSR2及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標(biāo)記CSSR2及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]菊屬(Chrysanthemum)屬于雙子葉植物綱菊科，原產(chǎn)于我國(guó)的菊屬植物主要有:野菊(C.1ndicum)、神農(nóng)香菊(C.1ndicum var.aromaticum),毛華菊(C.vestitum)、甘菊(C.1avandulifolium)> 小紅菊(C.chanetii )、紫花野菊(C.zawadskii )、菊花腦(C.mankingense)等。其中，菊花(Chrysanthemum morrofolium)是觀賞價(jià)值最高的種，菊花是中國(guó)十大名花和世界四大切花之一，在中國(guó)有三千多年的栽培歷史，形成了花型豐富、花色多樣的品種群。除觀賞價(jià)值外，菊屬植物還有很高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值等。菊花含有水蘇堿、刺槐甙、木樨草甙、大波斯菊甙、腺膘呤、膽堿、葡萄糖甙等成分，尤其富含揮發(fā)油，并且油中主要為菊酮、龍腦、龍腦已酸酯等物質(zhì)。功效作用方面，菊花具有平肝明目、散風(fēng)清熱、消咳止痛的功效，用于治療頭痛眩暈、目赤腫痛、風(fēng)熱感冒、咳嗽等病癥效果顯著。
[0003]亞菊屬(Ajania),屬于雙子葉植物綱菊科，主要分布于我國(guó)除東南半壁以外的廣大地區(qū)。蒙古、蘇聯(lián)及朝鮮北部和阿富汗北部也有少數(shù)種。亞菊屬的野生種磯菊(A.acificum)，原產(chǎn)于我國(guó)臺(tái)灣和日本，已經(jīng)較為廣泛的應(yīng)用于我國(guó)東南沿海以及日本、荷蘭等國(guó)的園林中， 作為地被以及盆栽植物栽培。其葉片光亮革質(zhì)具有較高的觀賞價(jià)值。菊花育種工作者也把磯菊作為親本和菊屬植物進(jìn)行雜交育種，以提高菊花的枝葉觀賞性。
[0004]太行菊屬(Opisthopappus),菊科,包括太行菊(0.taihangensis)和長(zhǎng)裂太行菊(0.1ongilobus)兩種，主要分布于我國(guó)山西、河北、河南等地，植株匍匐生長(zhǎng)，多生于陡坡，峭壁的巖石縫隙中，耐瘠薄，耐寒以及耐旱性強(qiáng)，已成為園藝工作者的重要育種材料。
[0005]亞菊屬和太行菊屬作為菊屬的近緣屬，已成為新的種質(zhì)資源被菊花育種工作者用來(lái)與菊花進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，以提高現(xiàn)有菊花品種群的抗性和觀賞性。
[0006]簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplesequence repeat, SSR),也稱微衛(wèi)星 DNA(microsatellite),是一種由2~5個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的長(zhǎng)達(dá)幾十甚至幾百個(gè)核苷酸的序列。這些序列廣泛存在于真核生物基因組的不同座位上，每個(gè)座位重復(fù)單位的數(shù)量可能不完全相同，因而形成多態(tài)性。由于其具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物的群體和進(jìn)化遺傳研究、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。
[0007]然而，目前菊花的SSR標(biāo)記開發(fā)處于起步階段，亞菊屬(Ajania)和太行菊屬(Opisthopappus)由于缺乏基因序列信息，尚未發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記開發(fā)相關(guān)研究的報(bào)導(dǎo)；因此目前亞菊屬(Ajania)和太行菊屬(Opisthopappus)還沒有SSR分子標(biāo)記被開發(fā)出來(lái),也沒有能夠用于菊屬以及近緣屬之間通用的SSR標(biāo)記；因此，開發(fā)菊屬、亞菊屬和太行菊屬微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)于菊屬，亞菊屬和太行菊屬的野生資源的開發(fā)利用，開展屬間遠(yuǎn)緣雜交育種以及分子水平研究具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標(biāo)記CSSR2及應(yīng)用。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標(biāo)記CSSR2，用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記CSSR2的引物對(duì)為:
[0010]上游引物:5’-TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3’和
[0011]下游引物:5’-CACATAACCACCACTACCACCA-3’。
[0012]本發(fā)明中涉及的近緣屬植物包括但不限于菊屬(Chrysanthemum)、亞菊屬(Ajania)、太行菊屬(Opisthopappus)等。
[0013]本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記在菊屬及近緣屬植物屬內(nèi)或?qū)匍g雜種鑒定、植物材料遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等方面的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種鑒定菊屬及近緣屬植物品種的方法，包括以下步驟:
[0015]I)提取待測(cè)植物的基因組DNA ；
[0016]2)以待測(cè)植物的基因組DNA為模板，利用上述用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記CSSR2的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0017]3 )檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018]步驟2)中PCR反應(yīng)體系為:引物各0.32 μ Μ/μ L，Taq DNA聚合酶0.2U/μ L，dNTP0.4 μ M/ μ L, Mg2+0.65 μ M/ μ L,模板 DNA2 ~4ng/ μ L，以 ddH20 配制。
[0019]步驟2)中 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?MV 5min ；94°C 0.5min，50 ~62°C 0.5min，72°C lmin,共 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。優(yōu)選地，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?MV 5min ；94°C 0.5min,58°C 0.5min,72 °C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
[0020]本發(fā)明首次提供一種在菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料之間通用的SSR分子標(biāo)記一CSSR2。本發(fā)明還提供了該SSR標(biāo)記在菊屬與亞菊屬的屬間雜交種鑒定中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供了擴(kuò)增該SSR位點(diǎn)的引物序列和擴(kuò)增方法，建立了一個(gè)在菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料之間通用的SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系，該標(biāo)記可以用于進(jìn)行菊屬，亞菊屬及太行菊屬屬內(nèi)和屬間的雜種鑒定，植物遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種等，應(yīng)用前景十分廣闊。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為本發(fā)明CSSR2位點(diǎn)的SSR引物擴(kuò)增的菊屬、亞菊屬及太行菊屬植物材料基因組DNA的STR分型圖；其中，I~28分別對(duì)應(yīng)表1中列出的菊屬、亞菊屬及太行菊屬的28種植物材料，橫坐標(biāo)代表擴(kuò)增產(chǎn)物大小，縱坐標(biāo)代表擴(kuò)增強(qiáng)度。
[0022]圖2為亞菊屬野生種磯菊(母本)，菊屬地被菊品種“鋪地淡粉”(父本)，及其雜交后代 AP1、AP2、AP3。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例用于說(shuō)明 本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。[0024]實(shí)施例1菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標(biāo)記CSSR2的獲得
[0025](I)在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Genbank/)下載網(wǎng)站上截至2012年4月公布的所有菊屬植物的7180個(gè)EST序列，應(yīng)用CAP3軟件進(jìn)行拼接處理，得到拼接基因序列。然后利用SSRIT軟件(http://www.gramene.0rg/db/markers/ssrtool)進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索,然后利用Primer Premier5.0軟件進(jìn)行SSR位點(diǎn)上、下游引物的設(shè)計(jì)。
[0026]其中擴(kuò)增所述分子標(biāo)記CSSRl和CSSR2的引物為如下引物對(duì):
[0027]CSSR2 上游引物 F: 5’ -TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3’
[0028]CSSR2 下游引物 R: 5，-CACATAACCACCACTACCACCA-3’
[0029](2)提取了菊屬(Chrysanthemum)、亞菊屬(Ajania),太行菊屬(Opisthopappus)的常見植物材料的DNA樣品(見表1)。
[0030]表1菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料
[0031]
【權(quán)利要求】
1.菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標(biāo)記CSSR2，其特征在于，用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記CSSR2的引物對(duì)為: 上游引物:5，-TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3，和 下游引物:5’-CACATAACCACCACTACCACCA-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于，所述近緣屬植物包括但不限于菊屬(Chrysanthemum)、亞菊屬(Ajania)、太行菊屬(Opisthopappus)。
3.權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記在菊屬及近緣屬植物屬內(nèi)或?qū)匍g雜種鑒定、植物材料遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
4.一種鑒定菊屬及近緣屬植物品種的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取待測(cè)植物的基因組DNA； 2)以待測(cè)植物的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記CSSR2的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)體系為:引物各0.32 μ M/ μ L, Taq DNA 聚合酶 0.2U/ μ L, dNTP0.4 μ M/ μ L, Mg2+0.65 μ M/ μ L,模板 2 ~4ng/μ L,以ddH20配制。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C5min ；94°C 0.5min，50 ~62°C 0.5min,72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。`
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C5min ；94°C 0.5min,58°C 0.5min,72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述近緣屬植物包括但不限于菊屬、亞菊屬、太行菊屬。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103773762SQ201410016955
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】張啟翔, 劉華, 孫明, 高亦珂, 潘會(huì)堂, 程堂仁, 王佳, 楊煒茹 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)