靶向egfr的重組蛋白光敏劑及其制備方法
【專利摘要】靶向EGFR的重組蛋白光敏劑及其制備方法，涉及基因工程技術(shù)和抗腫瘤生物藥物領(lǐng)域。本發(fā)明提供的重組蛋白質(zhì)從N端到C端依次為表皮生長因子EGF干擾序列（從1到20共20個氨基酸）—linker蛋白序列（從21到35共15個氨基酸序列）—藻藍蛋白α亞基序列（從36到194共159個氨基酸序列）—含有6×His標(biāo)簽序列（從195到200共6個氨基酸序列）。該蛋白可以直接靶向高表達EGFR的腫瘤細胞表面，在630nm激光照射20min，表現(xiàn)出較強的光致殺滅腫瘤細胞效應(yīng)，抑制率達到95%；該蛋白表達量高，易于純化，性能穩(wěn)定，不含有機溶劑，靶向性好，是一種全新的融合蛋白光敏劑。
【專利說明】靶向EGFR的重組蛋白光敏劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)中重組蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種重組蛋白光敏劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國每年腫瘤發(fā)病率超過260萬，平均每2.5min就有一個人死于腫瘤，因次腫瘤成為嚴(yán)重威脅人類健康的一種高發(fā)病。光動力學(xué)治療是現(xiàn)代無償治療的最新進展，以安全、有效、毒副作用小和成本相對較低而收到臨床治療的青睞，1996年美國批準(zhǔn)光動力學(xué)治療用于臨床，中國于2003年批準(zhǔn)用于臨床。決定光動力學(xué)治療效果的關(guān)鍵因素在于光敏劑，由于腫瘤組織對光敏劑只是相對的選擇性吸收，并不具備特異性，所以正常組織中不可避免地潴留有少量的光敏劑，可能產(chǎn)生光毒副作用，因此需要開發(fā)靶向光敏劑。目前常用的靶向光敏劑通過為化學(xué)偶聯(lián)法得到，其不足之處在于產(chǎn)量低，成本高、活性低、有可能引入有機溶劑而增加毒副反應(yīng)等。
[0003]藻藍蛋白只有結(jié)合了色基才具有光學(xué)活性，因而可以用于腫瘤光動力學(xué)治療和診斷以及免疫學(xué)等醫(yī)學(xué)研究的藻膽蛋白必須結(jié)合有色基。色基生成和連接到脫輔基蛋白的過程是一系列酶促反應(yīng)過程(Tooley et al., 2001; Fairchild & Glazer, 2001)。此前，我們成功克隆了基因 cpcE、cpcF、hoi 及pcyA,構(gòu)建了載體 pO)F -cpcE-cpcF, hol-pcyA(VI)，最終獲得了具有光學(xué)活性的藻藍蛋白及別藻藍蛋白a亞基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提高一種靶向向EGFR的重組蛋白光敏劑及其制備方法。
[0005]本發(fā)明是靶向向EGFR的重組蛋白光敏劑及其制備方法，靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，該光敏劑是通過將6XHis蛋白純化標(biāo)簽、EGFR干擾序列、linker蛋白、集孢藻PCC7120藻藍蛋白a進行融合，構(gòu)建融合蛋白光敏劑，經(jīng)過發(fā)酵和純化后，去除6XHis標(biāo)簽，獲得可以靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，經(jīng)630nm光照后可以殺滅腫瘤細胞。
[0006]靶向EGFR的重組蛋白光敏劑的制備方法，其步驟為:
(1)設(shè)計引物EGFRil和EGFRi2,即序列3和序列4，Iinkerl和linker2,即序列5和序列6，以及PC a I和PC a 2，即序列I和序列8 ；
(2)從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆藻藍蛋白a亞基基因 PCa ;
(3)以EGFRil和EGFRi2為引物進行重疊延伸PCR擴增，得到EGFRi— Iinkerl核苷酸序列；
(4)以Iinkerl和linker2為引物進行重疊延伸PCR擴增，得到linker2_PCaI核苷酸序列；
(5)以EGFR1-1inkerl 和 linker2_PC a I 為模版，以 EGFRil 和 linker2 為引物進行 PCR擴增，得到EGFR1-1inker-PCa I核苷酸序列；(6)以EGFR1-1inker-PCa I和PC a為模版，以EGFRil和PC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長600BP ；
(7 )將融合基因序列克隆入表達載體pCDF -cpcE-cpcF, ho1-pcyA載體，構(gòu)建pCDF-/?c a -cpcE-cpcF, hol-pcyA 轉(zhuǎn)化 DH5 a ；
(8)培養(yǎng)重組菌種8h，誘導(dǎo)表達12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0007]本發(fā)明將EGFR的干擾序列和藻藍蛋白融合，克隆入p⑶hol-pcyA(Vl)載體，構(gòu)建具有靶向EGFR作用的重組蛋白光敏劑。
[0008]重組蛋白光敏劑可無需引入有機溶劑、不會使蛋白變性、產(chǎn)量高、成本低，可以克服化學(xué)偶聯(lián)光敏劑的不足。本專利利用EGFR的干擾序列和藻藍蛋白構(gòu)建重組蛋白類光敏劑，改善光動力學(xué)治療的應(yīng)用效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是靶向EGFR的重組蛋白光敏劑基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖，圖2是靶向EGFR的重組蛋白光敏劑SDS-PAGE電泳圖，圖3是靶向EGFR的重組蛋白光敏劑的紫外吸收光譜，圖4是靶向EGFR的重組蛋白光敏劑熒光發(fā)射光譜，圖5是鏡下觀察靶向EGFR的重組蛋白光敏劑光照后殺滅宮頸癌Hela細胞，圖6是靶向EGFR的重組蛋白光敏劑不同條件下殺滅Hela細胞效果和量 效關(guān)系(靶向EGFR的重組蛋白光敏劑對Hela細胞的增殖抑制)。
【具體實施方式】
[0010]本發(fā)明是靶向向EGFR的重組蛋白光敏劑及其制備方法，靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，該光敏劑是通過將6XHis蛋白純化標(biāo)簽、EGFR干擾序列、linker蛋白、集孢藻PCC7120藻藍蛋白a進行融合，構(gòu)建融合蛋白光敏劑，經(jīng)過發(fā)酵和純化后，去除6XHis標(biāo)簽，獲得可以靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，經(jīng)630nm光照后可以殺滅腫瘤細胞。
[0011]以上所述的靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，融合蛋白EGFR干擾序列選自SEQ IDN0.1，藻藍蛋白a亞基序列選自SEQ ID N0.2，并和linker和6XHis蛋白純化標(biāo)簽序列融合而成。
[0012]根據(jù)以上所述的靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，融合蛋白具有SEQ ID N0.3的氨基酸序列。
[0013]根據(jù)以上所述的靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，編碼融合蛋白的基因具有SEQ IDN0.4的核苷酸序列。
[0014]靶向EGFR的重組蛋白光敏劑的制備方法，其步驟為:
(1)設(shè)計引物EGFRil和EGFRi2,即序列3和序列4，Iinkerl和linker2,即序列5和序列6，以及PC a I和PC a 2，即序列I和序列8 ；
(2)從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆藻藍蛋白a亞基基因 PCa ;
(3)以EGFRil和EGFRi2為引物進行重疊延伸PCR擴增，得到EGFRi— Iinkerl核苷酸序列；
(4)以Iinkerl和linker2為引物進行重疊延伸PCR擴增，得到linker2_PCaI核苷酸序列；
(5)以EGFR1-1inkerl 和 linker2_PCa I 為模版，以 EGFRil 和 linker2 為引物進行 PCR擴增，得到EGFR1-1inker-PCa I核苷酸序列；
(6)以EGFR1-1inker-PCaI和PC a為模版，以EGFRil和PC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長600BP ；
(7 )將融合基因序列克隆入表達載體pCDF -cpcE-cpcF, ho1-pcyA載體，構(gòu)建pCDF-/?c a -cpcE-cpcF, hol-pcyA 轉(zhuǎn)化 DH5 a ；
(8)培養(yǎng)重組菌種8h，誘導(dǎo)表達12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0015]實施例1:
(1)重組菌種的構(gòu)建:設(shè)計引物EGFRil和EGFRi2(序列3和序列4)，linkerUPlinker2(序列5和序列6)，以及PC a I和PC a 2(序列7和序列8);從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆藻藍蛋白a亞基基因PC a ;以EGFRil和EGFRi2為引物進行重疊延伸PCR擴增,得到EGFRi — Iinkerl核苷酸序列；以Iinkerl和linker2為引物進行重疊延伸PCR擴增，得至Ij linker2 — PC a I核苷酸序列；以EGFRi — Iinkerl和linker2 —PC a I為模版，以EGFRil和linker2為引物進行PCR擴增，得到EGFRi — linker — PC a I核苷酸序列；以EGFRi — linker — PC a I和PC a為模版，以EGFRil和PC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長600BP，如圖1所示；將融合基因序列克隆入表達載體 pCDF -cpcE-cpcF, hol-pcyA 載體，轉(zhuǎn)化疋 coli BL21。
[0016](2)重組蛋白光敏劑的發(fā)酵純化:取重組菌種5ml，接種與100ml LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)8h，轉(zhuǎn)入28°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白，如圖2所示，蛋白大小約22kD，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0017](3)重組蛋白光學(xué)特性分析:用可見分光光度計對兩種具有光學(xué)活性的重組蛋白在40(T800nm進行掃描，觀察蛋白的特征吸收峰；用熒光分光光度計對兩種重組蛋白的熒光光譜性質(zhì)進行檢測，觀察蛋白的激發(fā)波長與激發(fā)峰。重組蛋白在625nm處有最大吸收峰，如圖3所不,重組蛋白以波長580nm的入射光進行掃描最大突光發(fā)射峰在645nm處,如圖4所示。
[0018](4)重組蛋白光敏劑光毒性分析:細胞生存率的MTT檢測法當(dāng)細胞達到對數(shù)生長期時，將細胞濃度調(diào)節(jié)至0.5 X 1O5個/ mL,向96孔板每孔加入45 y L的細胞懸液，經(jīng)過夜培養(yǎng)使細胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，置換成等量無血清RPMI1640培養(yǎng)基，然后向每孔中加溶解的重組蛋白樣品，使其終濃度分別為12.5，25，50，IOOiig / mL，另設(shè)對照孔加入PC a使其終濃度為100 μg / mL作用4 h后，用625nm激光逐孔照射20min，之后補加等體積含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時設(shè)對照加入含重組蛋白光敏劑1OOμ g / mL及不含光敏劑的非光照對照孔。24h后，向每孔中加入1Oμ L濃度為5 mg / mL MTT (噻唑藍)，培養(yǎng)4 h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 u L DMS0,緩慢振蕩，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸收值A(chǔ)。不加任何處理的細胞為空白對照，單用樣品或單用激光照射為陰性對照。加樣孔激光照射前后對比如圖5所示，照射12h后細胞凋亡明顯，24h后基本不存在活細胞，而對照組細胞增殖明顯不同濃度的重組蛋白光敏劑光照后對腫瘤細胞的抑制率如圖6所示，由圖可見，光照后細胞增殖抑制率明顯增加，且隨著光敏劑濃度增加，抑制率逐漸增加，說明本發(fā)明制備的光敏劑具有較好的光毒性；和非靶向的PCa相比，在加入劑量大致相同的情況下，靶向EGFR的重組蛋白光敏劑光毒性效果較好，說明其具有較好的靶向性。
[0019]實施例2:
(I)重組菌種的構(gòu)建:設(shè)計引物EGFRil和EGFRi2(序列3和序列4)，linkerUPlinker2(序列5和序列6)，以及PC a I和PC a 2(序列7和序列8);從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆藻藍蛋白a亞基基因PCa ;以EGFRil和EGFRi2為引物進行重疊延伸PCR擴增,得到EGFRi — Iinkerl核苷酸序列；以Iinkerl和linker2為引物進行重疊延伸PCR擴增，得至Ij linker2 — PC a I核苷酸序列；以EGFRi — Iinkerl和linker2 —PCa I為模版，以EGFRil和linker2為引物進行PCR擴增，得到EGFRi — linker — PC a I核苷酸序列；以EGFRi — linker — PC a I和PC a為模版，以EGFRil和PC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長600BP，如圖1所示；將融合基因序列克隆入表達載體 pCDF -cpcE-cpcF, hol-pcyA 載體，轉(zhuǎn)化疋 coli BL21。
[0020](2)重組蛋白光敏劑的發(fā)酵純化:取重組菌種800ml，接種于含4L LB液體培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)4h，加入補料培養(yǎng)基800ml再培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)入28°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達12h，超聲破碎菌體 ，用鎳親和色譜柱純化蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白，如圖2所示，蛋白大小約22kD，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0021](3)重組蛋白光學(xué)特性分析:用可見分光光度計對兩種具有光學(xué)活性的重組蛋白在40(T800nm進行掃描，觀察蛋白的特征吸收峰；用熒光分光光度計對兩種重組蛋白的熒光光譜性質(zhì)進行檢測，觀察蛋白的激發(fā)波長與激發(fā)峰。重組蛋白在625nm處有最大吸收峰，如圖3所不,重組蛋白以波長580nm的入射光進行掃描最大突光發(fā)射峰在645nm處,如圖4所示。
[0022](4)重組蛋白光敏劑光毒性分析:細胞生存率的MTT檢測法當(dāng)細胞達到對數(shù)生長期時，將細胞濃度調(diào)節(jié)至0.5 X IO5個/ mL,向96孔板每孔加入45 y L的細胞懸液，經(jīng)過夜培養(yǎng)使細胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，置換成等量無血清RPMI1640培養(yǎng)基，然后向每孔中加溶解的重組蛋白樣品，使其終濃度分別為12.5，25，50，IOOiig / mL，另設(shè)對照孔加入PC a使其終濃度為100 ii g / mL作用4 h后，用625nm激光逐孔照射20min，之后補加等體積含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時設(shè)對照加入含重組蛋白光敏劑IOOii g / mL及不含光敏劑的非光照對照孔。24h后，向每孔中加入IOiiL濃度為5 mg / mL MTT (噻唑藍)，培養(yǎng)4 h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 u L DMS0,緩慢振蕩，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸收值A(chǔ)。不加任何處理的細胞為空白對照，單用樣品或單用激光照射為陰性對照。加樣孔激光照射前后對比如圖5所示，照射12h后細胞凋亡明顯，24h后基本不存在活細胞，而對照組細胞增殖明顯不同濃度的重組蛋白光敏劑光照后對腫瘤細胞的抑制率，如圖6所示，光照后細胞增殖抑制率明顯增加，且隨著光敏劑濃度增加，抑制率逐漸增加，說明本發(fā)明制備的光敏劑具有較好的光毒性；和非靶向的PCa相比，在加入劑量大致相同的情況下，靶向EGFR的重組蛋白光敏劑光毒性效果較好，說明其具有較好的靶向性。
[0023]實施例3:
(I)重組菌種的構(gòu)建:設(shè)計引物EGFRil和EGFRi2(序列3和序列4)，linkerUPlinker2(序列5和序列6)，以及PC a I和PC a 2(序列7和序列8);從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆藻藍蛋白a亞基基因PCa ;以EGFRil和EGFRi2為引物進行重疊延伸PCR擴增,得到EGFRi — Iinkerl核苷酸序列；以Iinkerl和linker2為引物進行重疊延伸PCR擴增，得至Ij linker2 — PC a I核苷酸序列；以EGFRi — Iinkerl和linker2 —PC a I為模版，以EGFRil和linker2為引物進行PCR擴增，得到EGFRi — linker — PC a I核苷酸序列；以EGFRi — linker — PC a I和PC a為模版，以EGFRil和PC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長600 bP，如圖1所示；將融合基因序列克隆入表達載體 pCDF -cpcE-cpcF, hol-pcyA 載體，轉(zhuǎn)化疋 coli BL21。
[0024](2)重組蛋白光敏劑的發(fā)酵純化:取重組菌種800ml，接種于含4L LB液體培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，37 °C培養(yǎng)4h，接種入含有80L培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中，培養(yǎng)4h，加入補料培養(yǎng)基15L，37°C再培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)入28°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白，如圖2所示，蛋白大小約22kD，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0025](3)重組蛋白光學(xué)特性分析:用可見分光光度計對兩種具有光學(xué)活性的重組蛋白在40(T800nm進行掃描，觀察蛋白的特征吸收峰；用熒光分光光度計對兩種重組蛋白的熒光光譜性質(zhì)進行檢測，觀察蛋白的激發(fā)波長與激發(fā)峰。重組蛋白在625nm處有最大吸收峰，如圖3所不,重組蛋白以波長580nm的入射光進行掃描最大突光發(fā)射峰在645nm處,如圖4所示。
[0026](4)重組蛋白光敏劑光毒性分析:細胞生存率的MTT檢測法當(dāng)細胞達到對數(shù)生長期時，將細胞濃度調(diào)節(jié)至0.5 X 1O5個/ mL,向96孔板每孔加入45 y L的細胞懸液，經(jīng)過夜培養(yǎng)使細胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，置換成等量無血清RPMI1640培養(yǎng)基，然后向每孔中加溶解的重組蛋白樣品，使其終濃度分別為12.5，25，50，IOOiig / mL，另設(shè)對照孔加入PC a使其終濃度為100 ii g / mL作用4 h后，用625nm激光逐孔照射20min，之后補加等體積含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時設(shè)對照加入含重組蛋白光敏劑IOOii g / mL及不含光敏劑的非光照對照孔。24h后，向每孔中加入IOii L濃度為5 mg / mL MTT (噻唑藍)，培養(yǎng)4 h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 u L DMS0,緩慢振蕩，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸收值A(chǔ)。不加任何處理的細胞為空白對照，單用樣品或單用激光照射為陰性對照。加樣孔激光照射前后對比如圖5，照射12h后細胞凋亡明顯，24h后基本不存在活細胞，而對照組細胞增殖明顯不同濃度的重組蛋白光敏劑光照后對腫瘤細胞的抑制率，如圖6所示，光照后細胞增殖抑制率明顯增加，且隨著光敏劑濃度增加，抑制率逐漸增加，說明本發(fā)明制備的光敏劑具有較好的光毒性；和非靶向的PCa相比，在加入劑量大致相同的情況下，靶向EGFR的重組蛋白光敏劑光毒性效果較好，說明其具有較好的靶向性。
【權(quán)利要求】
1.靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，該光敏劑是通過將6XHis蛋白純化標(biāo)簽、EGFR干擾序列、linker蛋白、集孢藻PCC7120藻藍蛋白a進行融合,構(gòu)建融合蛋白光敏劑,經(jīng)過發(fā)酵和純化后，去除6 XHis標(biāo)簽，獲得可以靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，經(jīng)630nm光照后可以殺滅腫瘤細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，其特征在于融合蛋白EGFR干擾序列選自SEQ ID N0.1，藻藍蛋白a亞基序列選自SEQ ID N0.2，并和linker和6XHis蛋白純化標(biāo)簽序列融合而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，其特征在于融合蛋白具有SEQID N0.3的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，其特征在于編碼融合蛋白的基因具有SEQ ID N0.4的核苷酸序列。
5.靶向EGFR的重組蛋白光敏劑的制備方法，其步驟為: (1)設(shè)計引物EGFRil和EGFRi2,即序列3和序列4，Iinkerl和linker2,即序列5和序列6，以及PC a I和PC a 2，即序列I和序列8 ； (2)從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆藻藍蛋白a亞基基因 PCa ; (3)以EGFRil和EGFRi2為引物進行重疊延伸PCR擴增，得到EGFRi— Iinkerl核苷酸序列； (4)以Iinkerl和linker2為引物進行重疊延伸PCR擴增，得到linker2_PCaI核苷酸序列； (5)以EGFR1-1inkerl 和 linker2_PC a I 為模版，以 EGFRil 和 linker2 為引物進行 PCR擴增，得到EGFR1-1inker-PCa I核苷酸序列； (6)以EGFR1-1inker-PCaI和PC a為模版，以EGFRil和PC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長600BP ； (7 )將融合基因序列克隆入表達載體pCDF -cpcE-cpcF, ho1-pcyA載體，構(gòu)建pCDF-/?c a -cpcE-cpcF, hol~pcyA 轉(zhuǎn)化 DH5 a ； (8)培養(yǎng)重組菌種8h，誘導(dǎo)表達12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于融合蛋白的核苷酸序列為序列I所示的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，融合蛋白的氨基酸序列為序列2所示的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于由EGFRi— I inker—PC a 一6 X His組合制備的靶向EGFR的重組蛋白光敏劑。
【文檔編號】C12N15/70GK103784955SQ201410018512
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】張偉杰, 王永剛, 馬建忠, 冷非凡, 蒲秀瑛, 陳卓, 張庭瑞 申請人:蘭州理工大學(xué)