楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和使用方法
【專利摘要】楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和使用方法，它涉及一種植物病原真菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和使用方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有的真菌培養(yǎng)基不能很好的滿足楊樹灰斑病菌生長發(fā)育產(chǎn)生孢子的問題。本發(fā)明產(chǎn)孢培養(yǎng)基由馬鈴薯、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、瓊脂和余量蒸餾水制成。本發(fā)明產(chǎn)孢培養(yǎng)基是將馬鈴薯去皮后煮20min～30min后得濾液，再將蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和瓊脂溶解到濾液中，最后用蒸餾水定容至1L，即完成楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基制備。本發(fā)明產(chǎn)孢培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件：在溫度19℃～30℃下培養(yǎng)7d～30d。本發(fā)明應(yīng)用在微生物培養(yǎng)領(lǐng)域。
【專利說明】楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物病原真菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和使用方法，主要涉及楊樹灰斑病菌(Sporocadus populinus Orsenigo, Rodondi&B.Sutton = Coryneum populinumBres.)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]楊樹(Populus spp.)具有生長快、成材早、適應(yīng)性強、易更新、材質(zhì)好和用途廣等特點，因此在北方大面積種植。楊樹是我國北方地區(qū)用材林、防護林和城市綠化的主要樹種。
[0003]楊樹灰斑病(S.populinus)對楊樹育苗和造林威脅很大，是楊樹苗期發(fā)生最為常見和嚴重的病害，主要發(fā)生在一年生苗木和幼樹的葉片、梢和莖上。楊樹灰斑病病原菌(S.populinus)屬于真菌界,子囊菌門，糞殼綱,炭角菌目，圓孢菌科，Sporocadus屬。楊樹灰斑病以田間病葉等為初侵染源，以分生孢子盤分生孢子形式越冬。翌年5-6月分生孢子盤吸水釋放孢子，借雨水反濺、沖洗和風(fēng)傳播。因此，研究楊樹灰斑病菌的分生孢子產(chǎn)孢條件對明確楊樹灰斑病菌的生活史或病害發(fā)生規(guī)律具有重大的作用，為其農(nóng)藥和生物防治菌劑篩選提供實驗材料，為科學(xué)制定控制楊樹灰斑病菌流行危害的技術(shù)措施提供理論依據(jù)。但是目前國內(nèi)尚無關(guān)于楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基研究的報道，現(xiàn)有通用真菌培養(yǎng)基不能很好的滿足該菌生長發(fā)育產(chǎn)生孢子，這極大地限制了對楊樹灰斑病菌、病害發(fā)生規(guī)律和病害防控技術(shù)的深入研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的真菌培養(yǎng)基不能很好的滿足楊樹灰斑病菌生長發(fā)育產(chǎn)生孢子的問題，而提供了`楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和使用方法。
[0005]本發(fā)明的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，每IL楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基是由馬鈴薯200.0g~202.0g、蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g、瓊脂16g~20g和余量蒸餾水制成。
[0006]本發(fā)明的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備方法，按照下述步驟實現(xiàn)的:把馬鈴薯去皮后取200.0g~202.0g放入IL蒸懼水中，煮20min~30min后,過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂L 4g~1.6g和瓊脂16g~20g,調(diào)節(jié)pH為6.5~7.5，再用蒸餾水定容至1L，溶解后，即得到楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基。
[0007]使用本發(fā)明制備得到的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)楊樹灰斑病菌的方法:將楊樹灰斑病菌按楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基重量的10%以內(nèi)接種至楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，在溫度為19°C~30°C的條件下培養(yǎng)7d~30d，即完成使用楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)楊樹灰斑病菌。
[0008]本發(fā)明制備得到的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，綜合利用碳源、氮源配制成適合于楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢。[0009]本發(fā)明的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基為固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基,楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121°C、高壓的條件下，時間20min。
[0010]本發(fā)明楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基中各物質(zhì)性能穩(wěn)定，以馬鈴薯為碳源，以蛋白胨為主要氮源，提供了該菌產(chǎn)孢所需要的碳元素和氮元素，滿足了該菌的營養(yǎng)需要，制備楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的過程簡單，易于實現(xiàn)。
[0011]利用本發(fā)明制備得到的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)楊樹灰斑病菌，培養(yǎng)25d產(chǎn)孢量可達到1.917 X IO6個孢子/毫升培養(yǎng)基~2.293 X IO6個孢子/毫升培養(yǎng)基，可以滿足楊樹灰斑病菌生長發(fā)育并產(chǎn)生孢子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1中楊樹灰斑病菌在楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢圖；
[0013]圖2為實施例1中楊樹灰斑病菌分生孢子堆，放大倍數(shù)為200倍圖；
[0014]圖3為實施例1中楊樹灰斑病菌發(fā)育中的分生孢梗和分生孢子,放大倍數(shù)為600圖；
[0015]圖4為實施例1中楊樹灰斑病菌分生孢子，放大倍數(shù)為600圖。
【具體實施方式】
[0016]【具體實施方式】一:本實施方式中楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，每IL楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基是由馬鈴薯200.0g~202.0g、蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g、瓊脂16g~20g和余量蒸懼水制成。
[0017]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一的不同之處是，所述的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的pH為6.5~7.5。其他與【具體實施方式】一相同。
[0018]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二的不同之處是，每IL楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基是由馬鈴薯201g、蛋白胨0.5g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.53g、瓊脂20g和余量蒸餾水制成。其他與【具體實施方式】一或二相同。
[0019]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一的不同之處是，每IL楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基是由馬鈴薯200g、蛋白胨0.49g、磷酸氫二鉀3.lg、硫酸鎂1.5g、瓊脂20g和余量蒸餾水制成。其他與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0020]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一的不同之處是，每IL楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基是由馬鈴薯202g、蛋白胨0.57g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.55g、瓊脂20g和余量蒸餾水制成。其他與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0021]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一的不同之處是，楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備方法，按照下述步驟實現(xiàn)的:把馬鈴薯去皮后稱取200.0g~202.0g放入IL蒸懼水中，煮20min~30min后,過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g和瓊脂16g~20g,溶解后,調(diào)節(jié)pH為
6.5~7.5,再用蒸懼水定容至1L,即完成楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備。其他與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0022]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一的不同之處是，使用楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)楊樹灰斑病菌的方法:將楊樹灰斑病菌按楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基重量的10%以內(nèi)接種至楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，在溫度為19°C~30°C的條件下培養(yǎng)7d~30d,即完成使用楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)楊樹灰斑病菌。其他與【具體實施方式】一至六之一相同。
[0023]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一的不同之處是，楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)楊樹灰斑病菌的培養(yǎng)條件:在溫度為22°C的條件下培養(yǎng)25d。其他與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0024]通過以下實施例對本發(fā)明的有益效果進行驗證:
[0025]實施例1:本實施例中楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基
[0026]楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備方法，按照下述步驟實現(xiàn)的:把馬鈴薯去皮，取201放入IL蒸餾水中，煮30min后，過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.5g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.53g和瓊脂20g,溶解后,用蒸懼水定容至1L,即完成楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備。
[0027]本實施例制備得到的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的pH為6.5~7.5。
[0028]本實施例中的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基為固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基,楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121°C、高壓的條件下，時間20min。
[0029]本實施例中楊樹灰斑病菌是按下述方法得到的:采取楊樹灰斑病的發(fā)病葉片(2013年從東北林業(yè)大學(xué)院內(nèi)楊樹發(fā)病葉片上采集)，對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化，并經(jīng)柯氏法則驗證，鏡檢分離得到的菌株為楊樹灰斑病的病原菌，并將楊樹灰斑病的病原菌貯存在4°C的環(huán)境中；其中，所述的對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化是按如下步驟進行:在無菌超凈工作臺中用無菌的毛筆，將采集到的楊樹病葉上的孢子刷下，刷到水瓊脂培養(yǎng)基上，在解剖鏡下，用毛細玻璃針挑起后，接種到PDA培養(yǎng)基上，得到的菌株即為楊樹灰斑病病原菌。將儲存在4°C冰箱的楊樹灰斑病菌取出，轉(zhuǎn)接在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上活化10d，即得到活化好的楊樹灰斑病的病`原菌；其中，所述的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)的配制方法如下:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,加入蒸懼水煮30min,濾去馬鈴薯,用蒸餾水將濾液定容至1L，然后在溫度121°C、高壓的條件下滅菌20min后，待用。
[0030]本實施例中是將活化好的楊樹灰斑病菌用直徑為7mm滅菌后的打孔器打成菌餅，將菌餅接到已冷卻凝固的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，再在溫度為22°C的條件下黑暗培養(yǎng)25d后,在已產(chǎn)孢的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上取2cmX lcmX0.4cm瓊脂塊,水洗研磨瓊脂塊計算產(chǎn)孢量，培養(yǎng)25d產(chǎn)孢量2.293 X IO6個孢子/毫升培養(yǎng)基。
[0031]圖1為實施例1中楊樹灰斑病菌在楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢,從圖1中可以看出楊樹灰斑病原菌在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量的分生孢子堆(小黑點)。
[0032]圖2為實施例1中楊樹灰斑病菌分生孢子堆，放大倍數(shù)為200倍。
[0033]圖3為實施例1中楊樹灰斑病菌發(fā)育中的分生孢梗和分生孢子,放大倍數(shù)為600圖。
[0034]圖4為實施例1中楊樹灰斑病菌分生孢子,放大倍數(shù)為600圖。
[0035]實施例2:本實施例中楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基
[0036]楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備方法，按照下述步驟實現(xiàn)的:把馬鈴薯去皮，取200放入IL蒸餾水中，煮30min后，過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.49g、磷酸氫二鉀
3.lg、硫酸鎂1.5g和瓊脂20g,溶解后,用蒸懼水定容至1L,即完成楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備。
[0037]本實施例制備得到的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的pH為6.5~7.5。
[0038]本實施例中的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基為固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基,楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121°C、高壓的條件下，時間20min。
[0039]本實施例中楊樹灰斑病菌時按下述方法得到的:采取楊樹灰斑病的發(fā)病葉片(2013年從東北林業(yè)大學(xué)院內(nèi)楊樹發(fā)病葉片上采集)，對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化，并經(jīng)柯氏法則驗證，鏡檢分離得到的菌株為楊樹灰斑病的病原菌，并將楊樹灰斑病的病原菌貯存在4°C的環(huán)境中；其中，所述的對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化是按如下步驟進行:在無菌超凈工作臺中用無菌的毛筆，將采集到的楊樹病葉上的孢子刷下，刷到水瓊脂培養(yǎng)基上，在解剖鏡下，用毛細玻璃針挑起后，接種到PDA培養(yǎng)基上，得到的菌株即為楊樹灰斑病病原菌。將儲存在4°C冰箱的楊樹灰斑病菌取出，轉(zhuǎn)接在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上活化10d，即得到活化好的楊樹灰斑病的病原菌；其中，所述的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)的配制方法如下:馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂20g，加入蒸餾水煮30min，濾去馬鈴薯，用蒸餾水將濾液定容至1L，然后在溫度121°C、高壓的條件下滅菌20min后，待用。
[0040]本實施例中是將活化好的楊樹灰斑病菌用直徑為7mm滅菌后的打孔器打成菌餅，將菌餅接到已冷卻凝固的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，再在溫度為22°C的條件下黑暗培養(yǎng)25d后,在已產(chǎn)孢的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上取2cmX lcmX0.4cm瓊脂塊,水洗研磨瓊脂塊計算產(chǎn)孢量，培養(yǎng)25d產(chǎn)孢量1.917 X IO6個孢子/毫升培養(yǎng)基。[0041]實施例3:本實施例中楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基
[0042]楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備方法，按照下述步驟實現(xiàn)的:把馬鈴薯去皮，取202放入IL蒸餾水中，煮30min后，過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.57g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.55g和瓊脂20g,溶解后,用蒸懼水定容至1L,即完成楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備。
[0043]本實施例制備得到的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的pH為6.5~7.5。
[0044]本實施例中的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基為固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基,楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121°C、高壓的條件下，時間20min。
[0045]本實施例中楊樹灰斑病菌時按下述方法得到的:采取楊樹灰斑病的發(fā)病葉片(2013年從東北林業(yè)大學(xué)院內(nèi)楊樹發(fā)病葉片上采集)，對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化，并經(jīng)柯氏法則驗證，鏡檢分離得到的菌株為楊樹灰斑病的病原菌，并將楊樹灰斑病的病原菌貯存在4°C的環(huán)境中；其中，所述的對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化是按如下步驟進行:在無菌超凈工作臺中用無菌的毛筆，將采集到的楊樹病葉上的孢子刷下，刷到水瓊脂培養(yǎng)基上，在解剖鏡下，用毛細玻璃針挑起后，接種到PDA培養(yǎng)基上，得到的菌株即為楊樹灰斑病病原菌。將儲存在4°C冰箱的楊樹灰斑病菌取出，轉(zhuǎn)接在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上活化10d，即得到活化好的楊樹灰斑病的病原菌；其中，所述的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)的配制方法如下:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,加入蒸懼水煮30min,濾去馬鈴薯,用蒸餾水將濾液定容至1L，然后在溫度121°C、高壓的條件下滅菌20min后，待用。
[0046]本實施例中是將活化好的楊樹灰斑病菌用直徑為7mm滅菌后的打孔器打成菌餅，將菌餅接到已冷卻凝固的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，再在溫度為22°C的條件下黑暗培養(yǎng)25d后,在已產(chǎn)孢的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上取2cmX lcmX0.4cm瓊脂塊,水洗研磨瓊脂塊計算產(chǎn)孢量，培養(yǎng)25d產(chǎn)孢量2.267 X IO6個孢子/毫升培養(yǎng)基。
【權(quán)利要求】
1.楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其特征在于每IL楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基是由馬鈴薯200.0g~202.0g、蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g、瓊脂16g~20g和余量蒸餾水制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其特征在于所述的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的pH為6.5~7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其特征在于每IL楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基是由馬鈴薯201g、蛋白胨0.5g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.53g、瓊脂20g和余量蒸懼水制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其特征在于每IL楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基是由馬鈴薯200g、蛋白胨0.49g、磷酸氫二鉀3.lg、硫酸鎂1.5g、瓊脂20g和余量蒸餾水制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其特征在于每IL楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基是由馬鈴薯202g、蛋白胨0.57g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.55g、瓊脂20g和余量蒸懼水制成。
6.如權(quán)利要求1所述的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備方法，按照下述步驟實現(xiàn):把馬鈴薯去皮后稱取200.0g~202.0g放入IL蒸懼水中，煮20min~30min后,過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g和瓊脂16g~20g,溶解后,調(diào)節(jié)pH為6.5~7.5,再用蒸餾水定容至1L，即完成楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備。
7.使用如權(quán)利要求1所述的楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的方法，其特征在于使用楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢的方法如下:將楊樹灰斑病菌按楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基重量的10%以內(nèi)接種至楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，在溫度為19°C~30°C的條件下培養(yǎng)7d~30d,即完成使用楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)楊樹灰斑病菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的使用楊樹灰斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的方法，其特征在于所述的在溫度為22°C的條件下培養(yǎng)25d。
【文檔編號】C12R1/645GK103725640SQ201410018545
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】馬玲, 劉雪英, 劉雪峰, 沙依拉·帕那西, 晁開瑞 申請人:東北林業(yè)大學(xué)