一株高溫纖維素降解菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株高溫纖維素降解菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的耐高溫纖維素降解菌，能在60-80℃溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，且在70℃時(shí)生長(zhǎng)最快；具有穩(wěn)定的纖維素降解功能，能較快的適應(yīng)高溫堆肥環(huán)境，快速降解纖維素等難降解有機(jī)物，加快堆肥腐熟進(jìn)程。利用由該菌株制備得到的固態(tài)菌劑對(duì)園林廢棄物進(jìn)行堆肥相對(duì)于未接種的纖維素總降解率提高了42.2%，具有成本低、性能好等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一株高溫纖維素降解菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域，具體涉及一株能在70°C快速增長(zhǎng)的纖維素降解菌及其在園林廢棄物高溫堆肥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]堆肥化是實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢物無(wú)害化、減量化和資源化的常用技術(shù)之一。目前堆肥仍存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、有機(jī)物質(zhì)降解不完全、物料穩(wěn)定度程度和腐熟度低的問(wèn)題。為此，人們將從環(huán)境中分離出高溫菌、中溫菌、放線菌以及真菌等制成接種劑并應(yīng)用于堆肥體系中，以達(dá)到縮短堆肥發(fā)酵時(shí)間、提高堆肥腐熟度等目的。園林廢棄物包括枯枝落葉、草坪修剪物、雜草和殘花等，是常見(jiàn)的堆肥物料，纖維素是其主要成分。由于纖維素本身結(jié)構(gòu)致密而不易降解，導(dǎo)致其難以被微生物加以利用，因此，提高纖維素的降解程度有助于解決園林廢棄物堆肥存在的上述問(wèn)題。
[0003]堆肥過(guò)程中纖維素降解主要發(fā)生在高溫階段，然而，目前高溫好氧堆肥過(guò)程中接種的微生物菌劑主要成分為中溫菌。隨著堆肥溫度升高，堆體中微生物的種類(lèi)和數(shù)量逐步減少，接種的嗜溫性微生物的活性也大大降低，這無(wú)疑限制了纖維素的快速降解。高溫菌是一類(lèi)在高溫條件下仍能生長(zhǎng)并可以保持生物降解活性的微生物菌群，接種高溫菌，特別是以其制成的纖維素降解菌劑，可以加快堆肥中纖維素的分解，從而提高堆肥效率。最近，耐高溫纖維素降解菌的篩選已成為促進(jìn)堆肥技術(shù)發(fā)展的主要議題之一。張楠等(2010)從牛糞堆肥中分離出6株能降解纖維素的高溫細(xì)菌，其中活性最高的為一株枯草芽孢桿菌。薛橋麗等(2012)從堆肥中分離獲得20株耐高溫纖維素分解菌，其產(chǎn)生的纖維素分解酶在50°C具有良好的熱穩(wěn)定性，但隨著溫度增加，熱穩(wěn)定性呈下降趨勢(shì)。
[0004]地芽孢桿菌屬{Genus Geobacillus)是一類(lèi)在表型特征上相似、系統(tǒng)發(fā)育上相近的耐高溫菌群，多數(shù)能夠在55°C以上的高溫中生長(zhǎng)。利用具有高溫降解纖維素功能的地芽孢桿菌，并將其作為接種劑應(yīng)用于有機(jī)廢物的堆肥化處理過(guò)程中，將有助于彌補(bǔ)堆肥高溫期土著菌纖維素降解能力的不足，同時(shí)也可以促進(jìn)其他有機(jī)物的降解，從而加快堆肥腐熟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種具有耐高溫、高效降解纖維素特性的地芽孢桿菌，并將其作為微生物接種劑應(yīng)用于高溫堆肥體系中。
[0006]本發(fā)明的高溫纖維素降解菌(feo如ci77i/5.kaustophilus.HCDM5),是從園林廢棄物高溫堆肥樣品中分離篩選得到的一株能夠在70°C條件下，降解纖維素的地芽孢桿菌菌株，于2013年11月7日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC NO:8441o
[0007]本發(fā)明菌株性質(zhì)如下:
菌株具有纖維素降解酶活性，在有輔助碳源存在下可降解纖維素?？稍?0-85°C溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)pH值范圍為5.5-8.0，最適pH為6.5，在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h后，其菌落特征是:淡黃色，圓形，直徑約2 mm，表面干燥，中央稍突起，不透明，邊緣完整。其菌體細(xì)胞特征為:桿菌，長(zhǎng)度約2-3 革蘭氏染色呈陽(yáng)性。利用引物為(27f):5' -AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3' (SEQ ID ^:1^^(1492^0:5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3/ (SEQ ID NO: 2)經(jīng)PCR擴(kuò)增該菌株的 16S rRNA基因序列(SEQ ID NO: 3)，經(jīng)與EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)((http://www.eztaxon.0rg/))比對(duì)，結(jié)果顯不與種 Geobacillus kaustophilusNCIMB8547 (T)的同源性最高，為99.43%。綜上性質(zhì)及特性，將該菌株鑒定為Geobacilluskaus tophiIus,GeobaciIlus kaus tophiIus.HCDM5。
[0008]利用該菌株制備固態(tài)菌劑的方法是:
(1)斜面活化:取菌種斜面，在65-75°C下活化培養(yǎng)16-32h ；
(2)制備種子液:將步驟(1)已活化的菌接種至1-2L的無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基中，在水浴搖床上以60-70°C溫度、50-200 rpm轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)24-36 h得種子液；
(3)發(fā)酵種子液的制備:取步驟(2)中種子液按5%-20%(v/v)的接種量接種至已滅菌的發(fā)酵罐中，進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度為60-70°C，轉(zhuǎn)速為100-200 rpm，培養(yǎng)時(shí)間 36-60 h ；
(4)制備固體菌劑:將麥麩與玉米面混合后，接種上述發(fā)酵種子液，接種量為培養(yǎng)基總重量的0.5%-3.5%，調(diào)節(jié)含水率至45%-55%范圍內(nèi)，自然堆置一至兩周后，將堆體攤開(kāi)陳化使含水率下降至30%以下，即得固態(tài)菌劑。
[0009]利用上述制備得到的固態(tài)菌劑進(jìn)行堆肥，方法如下:
將上述制備的固體菌劑按干重比5%-10%與堆肥主料即園林廢棄物混合，并添加適量的新鮮雞糞作為輔料，使得混合物料碳氮比為25-35:1、含水率55-60%，即可開(kāi)始高溫堆肥過(guò)程。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明所提供的耐高溫纖維素降解菌，能在60-80°C溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，且在70°C時(shí)生長(zhǎng)最快；具有穩(wěn)定的纖維素降解功能，能較快的適應(yīng)高溫堆肥環(huán)境，快速降解纖維素等難降解有機(jī)物，加快堆肥腐熟進(jìn)程。同時(shí)，以有機(jī)廢物作為本發(fā)明菌株的載體，具有成本低、性能好等優(yōu)點(diǎn)。接種了本發(fā)明所提供的固態(tài)微生物接種劑的堆肥相對(duì)于未接種的纖維素總降解率提高了 42.2%，堆肥高溫期(≥50°C )達(dá)到10d，在第7天達(dá)到最高溫度67 V，而未接種菌劑的堆肥高溫持續(xù)時(shí)間僅為7d，在第8天才達(dá)到最高溫度60°C。與未接種菌劑對(duì)比，接種微生物菌劑的堆肥提早IOd達(dá)到腐熟(發(fā)芽指數(shù)> 80%)，在發(fā)酵30d之后堆肥物料發(fā)芽指數(shù)達(dá)到了 85%以上，而未接種堆肥則在發(fā)酵40d以后才達(dá)到腐熟。接種后的堆肥比未接種的堆肥從第20d起，發(fā)芽指數(shù)均提高在10%以上，最高達(dá)17%。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1:堆肥溫度變化曲線；
圖2:堆肥過(guò)程中纖維素降解率變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。[0013]實(shí)施例1:耐高溫纖維素降解菌的篩選與鑒定
稱取10 g高溫期園林廢棄物堆肥樣品置于裝有10粒玻璃珠、盛有90 ml無(wú)菌水的錐形瓶中，在200 rpm的搖床上搖30 min，使樣品充分散開(kāi)，70°C下靜置富集培養(yǎng)12h。用無(wú)菌吸管吸取I ml上清液轉(zhuǎn)至赫其遜培養(yǎng)液中，70°C靜置培養(yǎng)約30天。取10 ml馴化液轉(zhuǎn)接至新的赫其遜培養(yǎng)液中，繼續(xù)馴化培養(yǎng)，如此傳代3次。
[0014]上述赫其遜培養(yǎng)基成分為:磷酸二氫鉀1.0g，氯化鈉0.lg，硝酸鈉2.5g，硫酸鎂
0.3g,三氯化鐵0.01g,氯化鈣0.1g,無(wú)淀粉濾紙條IOg,去離子水1000ml, pH 7.2。
[0015]分別取馴化后的菌懸液I mL，加入到9 mL無(wú)菌水中，以梯度稀釋法制成Κ1，10-2，IO-3,10Λ IO-5, IO-6, IO-7的稀釋度，取0.1mL平板涂布到纖維素-剛果紅培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行樣。取ImL的無(wú)菌水進(jìn)行同樣的操作，作為對(duì)照處理。在70°C下恒溫培養(yǎng)2天，選擇菌落分散較好、菌落周?chē)霈F(xiàn)明顯降解圈的平板，挑取生長(zhǎng)旺盛的單菌落，反復(fù)劃線分離純化3次，再將形態(tài)一致的菌落制片，進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，在油鏡多視野下觀察菌體細(xì)胞形態(tài)，確認(rèn)菌體形態(tài)一致后，接種至LB斜面培養(yǎng)至豐厚，在4°C下保存，備用。
[0016]菌株在LB平板上的菌落特征是:單菌落為淡黃色，圓形，直徑約2 _，表面干燥，中央稍突起，不透明，邊緣完整。菌體細(xì)胞特征為:桿菌，長(zhǎng)度約2-3 μ m。革蘭氏染色呈陽(yáng)性。
[0017]將分離得到的純菌在LB斜面上活化培養(yǎng)12h后，點(diǎn)接于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，在70°C下培養(yǎng)至菌落豐厚，觀察有無(wú)降解圈及降解圈的大小，并用游標(biāo)卡尺測(cè)定降解圈直徑(D)和菌落直徑(d)。降 解能力大小按公式Up= (D/d)2來(lái)判斷,單位為毫米(mm), Up越大，表示水解能力越大。在降解培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)4代，計(jì)算與分析每代菌的Up情況，淘汰降解能力不穩(wěn)定菌株，得到降解能力大且穩(wěn)定的菌株，從中選出Up值較大的10株菌，并編號(hào)為 HCDMl- HCDM10。
[0018]上述LB培養(yǎng)基成分為:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，植物凝膠 10g，蒸餾水 1000ml, pH 7.2-7.4。
[0019]上述纖維素剛果紅培養(yǎng)基的配方是:磷酸二氫鉀0.5g，硫酸銨0.25g，羧甲基纖維素鈉1.88g，剛果紅0.2g，明膠2g，瓊脂15g，植物凝膠10g，去離子水1000ml, pH值為7.0。
[0020]將上述操作得到的HCDM1-HCDM10菌株分別接種至纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，70°C培養(yǎng)3d后，取發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，取上清液即為待測(cè)粗酶液，用DNS法測(cè)定菌株的纖維素酶活性。得到纖維素酶活較高的五株菌HCDM5、HCDM4、HCDM7、HCDM1、HCDM10。
[0021]上述纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:磷酸二氫鉀3g，硫酸銨2g，七水合硫酸鎂0.5g，七水合硫酸亞鐵0.01g,玉米面2g,麩皮0.5g,蛋白胨5g,碳酸鈣0.5g,去離子水1000ml,pH值為7.0
將HCDM5、HCDM4、HCDM7、HCDMl、HCDM10五株菌分別接種到赫其遜培養(yǎng)液中，用錫箔紙封口，70°C靜置培養(yǎng)14d后，用稀鹽酸與稀硝酸混合液及去離子水反復(fù)洗滌濾紙條數(shù)次，于70°C烘至恒重，稱量，計(jì)算濾紙條降解率。計(jì)算公式如下:
降解率(%)=(濾紙?jiān)?烘干濾紙重量)/濾紙?jiān)豖 100
上述赫其遜培養(yǎng)基成分為:磷酸二氫鉀1.0g，氯化鈉0.lg，硝酸鈉2.5g，硫酸鎂0.3g，三氯化鐵0.01g,氯化鈣0.1g,無(wú)淀粉濾紙條IOg,去離子水1000ml, pH 7.2。
[0022]纖維素酶活測(cè)定結(jié)果和濾紙降解率結(jié)果見(jiàn)表1。[0023]表1纖維素酶活測(cè)定結(jié)果和濾紙降解率結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一株高溫纖維素降解菌，名稱為kaustophilus.HCDM5,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO:8441。
2.權(quán)利要求1所述的高溫纖維素降解菌在降解纖維素中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的高溫纖維素降解菌在制備堆肥中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述堆肥的主料為園林廢棄物。
5.一種用于降解纖維素的固體菌劑，由權(quán)利要求1所述的保藏編號(hào)為CGMCC NO:8441的高溫纖維素降解菌制備得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的固體菌劑，其特征在于，制備方法如下: (1)斜面活化:取菌種斜面，在65-75°C下活化培養(yǎng)16-32h ； (2)制備種子液:將步驟(1)已活化的菌接種至無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基中，在水浴搖床上以60-70°C溫度、50-200 rpm轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)24-36 h得種子液； (3)發(fā)酵種子液的制備:取步驟(2)中種子液按5%-20%(v/v)的接種量接種至已滅菌的發(fā)酵罐中，進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度為60-70°C，轉(zhuǎn)速為100-200 rpm，培養(yǎng)時(shí)間 36-60 h ； (4)制備固體菌劑:將麥麩與玉米面混合后，接種上述發(fā)酵種子液，接種量為培養(yǎng)基總重量的0.5%-3.5%，調(diào)節(jié)含水率至45%-55%范圍內(nèi)，自然堆置一至兩周后，將堆體攤開(kāi)陳化使含水率下降至30%以下，即得固態(tài)菌劑。
7.權(quán)利要求5或6所述的固體菌劑在制作堆肥中應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)`用，其特征在于，所述堆肥的主料為園林廢棄物。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103820361SQ201410018582
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】于光輝, 翟曉峰, 張英, 嚴(yán)建平, 余震, 喻薇, 田軍建, 高強(qiáng) 申請(qǐng)人:深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司