一種用于丙型肝炎病毒核酸檢測和基因分型的多重熒光pcr檢測試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于丙型肝炎病毒核酸檢測和基因分型的多重熒光PCR檢測試劑盒及其應用。所述試劑盒包括RT-PCR反應液、酶混合液、HCV反應液Ⅰ、HCV反應液Ⅱ、HCV反應液Ⅲ，優(yōu)選的，還包括HCV分型陰性對照、HCV分型陽性對照及使用說明書。本發(fā)明對提取的HCV?RNA，采用三管多重熒光PCR，通過一步法RT-PCR，快速檢測樣本中丙型肝炎病毒RNA及其亞型。本發(fā)明的試劑盒擴增方法簡單、操作簡便，檢測結果靈敏度高、特異性好，可用于人血清或血漿中HCV?RNA的檢測和基因分型，有助于判斷治療的難易程度、制定個體化抗病毒治療方案，具有臨床推廣應用價值。
【專利說明】—種用于丙型肝炎病毒核酸檢測和基因分型的多重熒光PCR檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測試劑盒，尤其涉及一種采用多重熒光PCR檢測方法，制備丙型肝炎病毒及其基因分型檢測的試劑盒，用于快速準確檢測臨床血清或血漿樣品中丙型肝炎病毒及國內主要流行亞型lb，2a，3a，3b，6a的感染。本發(fā)明屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起丙型肝炎的病原體,嚴重危害人類健康。它主要通過輸血、靜脈注射、母嬰垂直等方式感染致病，可引起慢性肝炎，肝硬化，甚至肝癌。據世界衛(wèi)生組織報道，目前全球約有2億人感染HCV (至少包括130個國家)，約占全球人口的3%，其中80%急性肝炎患者成為慢性肝炎，其中20%發(fā)展為肝硬化，1%-5%肝硬化患者可發(fā)展為肝癌。
[0003]HCV的基因組為單股正鏈RNA，長約9.6kb。根據其核苷酸序列的差異性，可將HCV分為6個主要的基因型，每個基因型又可分為多個亞型。HCV基因型的分布具有明顯的地域差異，1-3型呈全球性流行，4-6型呈地方性流行。我國主要有1、2、3和6型4種HCV流行基因型，其中流行最廣泛的亞型為Ib和2a，其次為6a、3b和3a。HCV基因型與干擾素抗病毒治療的應答密切相關，是決定丙型肝炎患者干擾素治療效果的重要因素。不同基因型HCV感染者接受干擾素治療后，持續(xù)病毒學應答(SVR)率有所不同，從而有助于預測治療效果，為調整用藥劑量及治療時間，制定個體化抗病毒治療方案提供指導。因此HCV基因型在臨床上常作為藥物療效的預測指標。
[0004]HCV基因分型的方法主要有分子生物學和血清學兩大類。在分子生物學分型法中，核苷酸測序法被認為是“金標 準”，但由于測序設備的限制，廣泛的臨床應用存在一定困難。PCR-限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)法利用限制性內切酶可將6種基因型分開，但酶切位點易受到基因變異的影響。線性探針雜交(Line probe hybridization assay, LiPA)法操作較為繁瑣，HCV RNA低載量患者的檢測效果較差。實時熒光PCR法既可檢測主要基因型，同時還能區(qū)分亞型。此外，還有型特異探針雜交、反向斑點雜交等分型方法。血清學基因分型主要是檢測NS4區(qū)和核心區(qū)編碼的抗原，常用的方法有重組免疫印跡試驗(Recombinant Immunoblot Assay, RIBA)和酶免疫試驗(Enzyme Immunoassay, EIA)。這兩種方法對1、2、3基因型的辨別有96%的一致性,且操作簡便。但用于檢測HCV基因型特異性抗原的ELISA方法雖可以識別6種基因型，卻不能識別亞型。而且一些研究表明，血清學分型可能在特異性和靈敏度方面有局限。近年國內外文獻報道的HCV RNA基因分型的研究方法主要有HPLC酶切法、引物特異性電泳分型法、熔點曲線法、分管引物測序等方法，這幾種方法均存在操作復雜、結果鑒定開放式或分管多步等缺陷，因此也沒有成為臨床常規(guī)開展的技術。本發(fā)明采用多重熒光PCR檢測方法，可用于快速準確檢測臨床血清或血漿樣品中丙型肝炎病毒及國內主要流行亞型lb，2a，3a，3b，6a的感染，具有操作簡便、重復性強、檢測結果快速客觀等優(yōu)點，在臨床診斷、疾病治療等領域有極大的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種采用多重熒光探針技術進行丙型肝炎病毒核酸及其基因型檢測的試劑盒，通過該試劑盒的使用，能夠快速、簡便、敏感地檢測HCVRNA及HCV基因型，從而為丙型肝炎的臨床診斷和抗病毒治療提供參考依據。
[0006]為了達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術手段為在HCV5’非編碼區(qū)設計進行HCV通用型檢測的引物和探針，同時分別針對HCV的各亞型(HCVlb、HCV2a，HCV6a、HCV3b和HCV3a)的NS5B基因區(qū)段設計用于HCV基因分型的引物和探針。在HCV核酸提取后，配制RT-PCR反應體系進行多重熒光PCR擴增，根據三個反應管的擴增結果判斷HCV感染及其感染亞型。本發(fā)明擴增程序簡單、操作簡便、靈敏度高、特異性好、結果清晰，容易判斷。
[0007]本發(fā)明是一種用于丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核酸檢測和基因分型的多重熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下成分=RT-PCR反應液、酶混合液、HCV反應液1、HCV反應液II以及HCV反應液III ；
[0008]其中，HCV反應液I用于檢測HCV通用型和Ib亞型，其包括以下引物序列和探針:
[0009]用于HCV通用型檢測的引物序列是:
[0010]HCV-F:5，-AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’ (SEQ ID N0.1 所示)；
[0011]HCV-R:5’ -CRACCCAACRCTACTCGGCT-3’ (SEQ ID N0.2 所示)；
[0012]對應的探針序列是`:
[0013]HCV-P:5’ -AGTACACCGGAATYGCCRGGAHGAC-3’ (SEQ ID N0.3 所示)；及
[0014]用于HCVlb亞型檢測的引物序列是:
[0015]HCVlb-F:5’ -GCCCAGGAGCAACTTGAAAA-3’ (SEQ ID N0.4 所示)；
[0016]HCVlb-R:5’ -GAGAGTAACTATGGAGTGAA-3’ (SEQ ID N0.5 所示)；
[0017]對應的探針序列是:
[0018]HCVlb-P:5，-CTCCATTGAGCCACTTGACCTACCT-3，(SEQ ID N0.6 所示)；
[0019]其中，HCV反應液II用于檢測HCV2a和6a亞型，其包括以下引物序列和探針:
[0020]用于HCV2a亞型檢測的引物序列是:
[0021]HCV2a-F:5，-CGGAGGCTATGACCAGGTATTC-3，(SEQ ID N0.7 所示)；
[0022]HCV2a-R:5，-GGCATCACGGGTGAGGTAATAG-3，(SEQ ID N0.8 所示)；
[0023]對應的探針序列是:
[0024]HCV2a-P:5，-ACCTCCTCCCCTTGTCGTCCCGT-3，(SEQ ID N0.9 所示)；及
[0025]用于HCV6a亞型檢測的引物序列是:
[0026]HCV6a-F:5，-CTTGCCTCAGGAAACTTGGG-3’ (SEQ ID N0.10 所示)；
[0027]HCV6a-R:5，-TAGCTTGGTCTTCACTGCCC-3’ (SEQ ID N0.11 所示)；
[0028]對應的探針序列是:
[0029]HCV6a-P:5’ -TGCGAGCCTGGAGACATCGAGCCA-3’ (SEQ ID N0.12 所示)；
[0030]其中，HCV反應液III用于檢測HCV3a和3b亞型，其包括以下引物序列和探針:
[0031]用于HCV3a亞型檢測的引物序列是:[0032]HCV3a-F:5’ -CCTTGACTTTGAAATGTACG-3’ (SEQ ID N0.13 所示)；
[0033]HCV3a-R:5，-GCTCTACTGGAGAGTAACTG-3，(SEQ ID N0.14 所示)；
[0034]對應的探針序列是:
[0035]HCV3a-P:5，-ACTCTGTCACTCCGCTGGATTTACC-3’ (SEQ ID N0.15 所示)；及
[0036]用于HCV3b亞型檢測的引物序列是:
[0037]HCV3b-F:5’ -GCACCAAAACCAAACTCACT-3’ (SEQ ID N0.16 所示)；
[0038]HCV3b-R:5’ -GAGTAGGCAAAGCAGCAAAT-3，(SEQ ID N0.17 所示)；
[0039]對應的探針序列是:
[0040]HCV3b-P:5，-CTGCGGGCCAGCTAGATCTTTC-3’ (SEQ ID N0.18 所示)。
[0041]根據本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的試劑盒中還包括HCV分型陰性對照、HCV分型陽性對照及使用說明書，更優(yōu)選的，所述的HCV分型陰性對照為無HCV RNA的正常人血清樣本；所述的HCV分型陽性對照為含有HCVlb亞型基因片段的非轉染性體外轉錄RNA的人血清樣本。
[0042]根據本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的RT-PCR反應液中含有pH=8.0的Tris-HC120mM、KCllOOmM, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 0.4mM、MgCl26mM。
[0043]根據本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的酶混合液中含有200U/μ L逆轉錄酶、40U/ μ L RNA酶抑制劑和2U/` μ L Taq酶。
[0044]根據本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的HCV反應液1、HCV反應液II或HCV反應液III中所含有的探針序列的5’端分別采用不同的熒光報告基團進行標記。
[0045]根據本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的PCR反應液中還包括內參系統(tǒng)，所述的內參系統(tǒng)為人GAPDH基因參照系統(tǒng)，包括:
[0046]用于擴增人GAPDH基因的引物序列:
[0047]GAPDH-F:5’ -CCGTCTAGAAAAACCTGCCAAA-3’ (SEQ ID N0.19 所示)；
[0048]GAPDH-R:5，-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3，(SEQ ID N0.20 所示)；及
[0049]內參探針:
[0050]GAPDH-P:5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’ (SEQ ID N0.21 所示)，內參探針 5’端用CY5標記，3’端用BHQl標記。
[0051]根據本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，HCV反應液I中含有的用于檢測HCV通用型和Ib亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:0.3-0.5 μ M，用TE緩沖液溶解；HCV反應液II中含有的用于檢測2a和6a亞型的引物序列和探針,其濃度分別為:0.2-0.4 μ M，用TE緩沖液溶解；HCV反應液III中含有的用于檢測3a和3b亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:
0.3-0.5 μ M，用TE緩沖液溶解。
[0052]根據本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，RT-PCR反應體系的配制和擴增程序如下:
[0053]RT-PCR反應體系的配制:
[0054]將RT-PCR反應液、酶混合液、HCV反應液1、HCV反應液II或HCV反應液III分別按照體積比15:10:5的比例混合，反應體系為50 μ L ;
[0055]RT-PCR反應程序設置如下:
[0056](I) 5CTC, 30min, I 個循環(huán)；
[0057](2)95°C，5min，l 個循環(huán)；[0058](3) 95°C, IOs ；
[0059](4) 60。。，40s;
[0060](5)重復步驟(3)和(4)，共進行45次循環(huán)
[0061]步驟(4)中60°C時進行熒光檢測，檢測通道為FAM、VIC和CY5。
[0062]在本發(fā)明的一個具體實施例中，本發(fā)明試劑盒進行HCV基因分型的設計思路如下表1所示:
[0063]表1、三管多重熒光PCR檢測HCV基因型方案
【權利要求】
1.一種用于丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核酸檢測和基因分型的多重突光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下成分=RT-PCR反應液、酶混合液、HCV反應液1、HCV反應液II以及HCV反應液III ； 其中，HCV反應液I用于檢測HCV通用型和Ib亞型，其包括以下引物序列和探針: 用于HCV通用型檢測的引物序列是:
HCV-F:5’ -AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’ ；
HCV-R:5’ -CRACCCAACRCTACTCGGCT-3’ ； 對應的探針序列是:
HCV-P:5’ -AGTACACCGGAATYGCCRGGAHGAC-3’ ；及
用于HCVlb亞型檢測的引物序列是:
HCVlb-F:5，-GCCCAGGAGCAACTTGAAAA-3，；
HCVlb-R:5，-GAGAGTAACTATGGAGTGAA-3，； 對應的探針序列是:
HCVlb-P:5’ -CTCCATTGAGCCACTTGACCTACCT-3’ ； 其中，HCV反應液II用于檢測HCV2a和6a亞型，其包括以下引物序列和探針: 用于HCV2a亞型檢測的引物序列是:
HCV2a-F:5’ -CGGAGGCTATGACCAGGTATTC-3’ ；
HCV2a-R:5， -GGCATCACGGGTGAGGTAATAG-3，； 對應的探針序列是:
HCV2a-P:5， -ACCTCCTCCCCTTGTCGTCCCGT-3，；及
用于HCV6a亞型檢測的引物序列是:
HCV6a-F:5’ -CTTGCCTCAGGAAACTTGGG-3’ ；
HCV6a-R:5’ -TAGCTTGGTCTTCACTGCCC-3’ ； 對應的探針序列是:
HCV6a-P:5’ -TGCGAGCCTGGAGACATCGAGCCA-3’ ； 其中，HCV反應液III用于檢測HCV3a和3b亞型，其包括以下引物序列和探針: 用于HCV3a亞型檢測的引物序列是:
HCV3a-F:5’ -CCTTGACTTTGAAATGTACG-3’ ；
HCV3a-R:5’ -GCTCTACTGGAGAGTAACTG-3’ ； 對應的探針序列是:
HCV3a-P:5’ -ACTCTGTCACTCCGCTGGATTTACC-3’ ；及
用于HCV3b亞型檢測的引物序列是:
HCV3b-F:5，-GCACCAAAACCAAACTCACT-3，；
HCV3b-R:5， -GAGTAGGCAAAGCAGCAAAT-3，； 對應的探針序列是:
HCV3b-P:5’ -CTGCGGGCCAGCTAGATCTTTC-3’。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括HCV分型陰性對照、HCV分型陽性對照及使用說明書，優(yōu)選的，所述的HCV分型陰性對照為無HCV RNA的正常人血清樣本； 所述的HCV分型陽性對照為含有HCVlb亞型基因片段的非轉染性體外轉錄RNA的人血清樣本。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的RT-PCR反應液中含有pH=8.0的Tris-HC120mM、KC1100mM、dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 0.4mM、MgCl26mM。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶混合液中含有200U/i!L逆轉錄酶、40U/ u L RNA酶抑制劑和2U/ U L Taq酶。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于HCV反應液1、HCV反應液II或HCV反應液III中所含有的探針序列的5’端分別采用不同的熒光報告基團進行標記。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，PCR反應液中還包括內參系統(tǒng)，所述的內參系統(tǒng)為人GAPDH基因參照系統(tǒng)，包括: 用于擴增人GAPDH基因的引物序列:
GAPDH-F:5’ -CCGTCTAGAAAAACCTGCCAAA-3’ ；
GAPDH-R:5’ -TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3’ ；及 內參探針: GAPDH-P:5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’，內參探針 5’端用 CY5 標記，3’端用 BHQl標記 O
7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，HCV反應液I中含有的用于檢測HCV通用型和Ib亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:0.3-0.5 ii M，用TE緩沖液溶解；HCV反應液II中含有的用于檢測2a和6a亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:0.2_0.4yM，用TE緩沖液溶解；HCV反應液III中含有的用于檢測3a和3b亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:0.3-0.5 ii M，用TE緩沖液溶解。
8.根據權利要求1-7任一項所述的試劑盒，其特征在于，RT-PCR反應體系的配制和擴增程序如下: RT-PCR反應體系的配制: 將RT-PCR反應液、酶混合液、HCV反應液1、HCV反應液II或HCV反應液III分別按照體積比15:10:5的比例混合，反應體系為50 ii L ; RT-PCR反應程序設置如下: (1)50°C，30min，l 個循環(huán)； (2)95°C，5min，l個循環(huán)；
(3)95。。，IOs ；
(4)60°C,40s ； (5 )重復步驟(3 )和(4 )，共進行45次循環(huán) 步驟(4)中60°C時進行熒光檢測，檢測通道為FAM、VIC和CY5。
9.權利要求1-8任一項所述的試劑盒在制備檢測丙型肝炎病毒試劑中的應用。
10.權利要求1-8任一項所述的試劑盒在制備對丙型肝炎病毒進行基因分型的試劑中的應用。
【文檔編號】C12Q1/70GK103773897SQ201410020086
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權日:2014年1月16日
【發(fā)明者】李榮宇, 祁寅樂, 王國強, 劉中華, 李秀林, 張旭 申請人:江蘇碩世生物科技有限公司