一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法，該方法包括平板活化培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、由菌體提取脂肪與由發(fā)酵上清液提取脂肪等步驟。本發(fā)明使用吐溫-80乳化劑與二價鋅離子，控制發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值，采用變溫培養(yǎng)模式，能夠非常顯著地提高了t10，c12-CLA產(chǎn)量，因此，本發(fā)明使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的應用前景。
【專利說明】一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法
[0001]【【技術領域】】
[0002]本發(fā)明屬于微生物【技術領域】，更具體地，本發(fā)明涉及一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
【【背景技術】】
[0003]共軛亞油酸(Conjugatedlinoleicacid,CLA)即共軛十八碳二烯酸,是一組具有共軛不飽和雙鍵的亞油酸(LA)的位置和結構異構體。CLA的雙鍵在碳鏈上有多種位置排列方式，每個雙鍵可以以順式或反式構型存在，其異構體十分豐富。其中cis-9, trans-11-CLA(c9，tll-CLA)、trans-10, cis-12-CLA (tlO, cl2_CLA)兩種異構體是含量最多并且確認具有生理活性功能的共軛亞油酸單體。近30年來，由于CLA具有包括抗癌、抗動脈粥樣硬化、免疫系統(tǒng)的調制以及抑制脂肪的積累等對人類健康有益的效果，而被廣泛的研究。
[0004]因為CLA具有多種獨特的生理功能，被譽為“21世紀的新型營養(yǎng)素”，越來越多的引起了世界各國政府及科研工作者的重視，CLA正成為藥物、食品、飼料等研究領域的一個熱點。由于天然CLA主要存在于反芻動物乳制品中，含量非常低；而通過堿催化異構化等化學方法合成的CLA是多種異構體的混合物，較難分離純化具有活性功能的異構體；所以，研究生物轉化法獲得成分單一的功能CLA具有重要的現(xiàn)實意義。
[0005]到目前為止，c9, tll-CLA生物合成的最高量是Delacroixia coronata菌株通過delta-9脫飽和酶作用將t-亞油酸轉化成CLA，濃度最高達到10.5mg/ml，其中c9，tll-CLA的純度高達98% ;而tlO，C12-CLA生物合成的最高產(chǎn)量是江南大學食品生物技術中心陳衛(wèi)研究小組構建的重組耶氏解脂酵母菌株(CCFM-JU277-9)，通過添加20g/L的大豆油，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵38.5h得到CLA的最高產(chǎn)量為4g/L，其中全部為tlO，cl2_CLA。由于CCFM-JU277-9能夠在胞內合成`亞油酸異構酶(PAI)，并能夠分泌脂肪酶Lip2使培養(yǎng)基中以甘三酯形式存在的LA變?yōu)橛坞x的形式進入細胞，作為底物被PAI催化成專一的tlO，C12-CLA單體形式，因此提高相關酶活性將有助于tlO，cl2-CLA產(chǎn)量的提高。CCFM-JU277-9合成tlO，C12-CLA的產(chǎn)量仍具有提升空間。
[0006]所以本發(fā)明希望通過控制發(fā)酵過程，確定影響tlO，C12-CLA產(chǎn)量的發(fā)酵條件，從而實現(xiàn)提高tio，C12-CLA產(chǎn)量的目標。
【
【發(fā)明內容】
】
[0007][要解決的技術問題]
[0008]本發(fā)明的目的是提供一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[0009][技術方案]
[0010]本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。
[0011]本發(fā)明涉及一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[0012]所述生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法的步驟如下:
[0013]A、平板活化培養(yǎng)
[0014]使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20~32°C的條件下平板活化培養(yǎng)2~6天，得到斜面培養(yǎng)物；
[0015]B、種子培養(yǎng)
[0016]使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下培養(yǎng)40~52小時；
[0017]C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0018]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計0.5%~2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉接到pH4.5~8.5的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20°C _25°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)35-40小時，當重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進入生長穩(wěn)定期，再添加終濃度為30g/L的乳化紅花籽油與IOmM 二價金屬離子溶液，該乳化紅花籽油含有以所述紅花籽油重量計0.1~1.0%乳化劑，接著在溫度28-32°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)48~100小時，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500~8500rpm的條件下離心分離10~18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液；
[0019]所述的菌體使用以重量計`0.70~1.00%NaCl水溶液洗滌2~3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進行凍干；
[0020]D、由菌體提取脂肪
[0021]按照以mg計凍干菌體與以ml計8~12%鹽酸-甲醇溶液之比為20~50:0.5~
1.5，讓步驟C所得到的凍干菌體與8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~-65°C的條件下進行甲酯化2.5~3.5小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在5000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘,在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯；
[0022]E、由發(fā)酵上清液提取脂肪
[0023]按照以ml計發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0~12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液2~4次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~65°C的條件下進行甲酯化0.5~3小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在3000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述的平板固體培養(yǎng)基制備方法如下:
[0025]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20mino[0026]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下:
[0027]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下:
[0029]按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調節(jié)至4.5-5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的無機酸選自硫酸或鹽酸；所述的無機堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述無機酸或無機堿水溶液的濃度是2.0~4.0moI/Lο
[0031]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的紅花籽油乳化液制備方法如下:
[0032]把紅花籽油添加到以重量計0.6%乳化劑水溶液中，直到紅花籽油的濃度達到150~250g/L，接著使用超聲設備在功率200W的條件下進行超聲處理4~6分鐘，再使用
0.22 um無菌濾膜過濾除菌。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的二價金屬離子是Zn2+。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的乳化劑是吐溫-80。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的洗滌菌體在溫度-10°C~-30°C與真空度1.0~10.0Pa的條件下進行凍干。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟D中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2_CLA含量分別是3.0g/L~7.2g/L ;在步驟E中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2_CLA含量分別是
3.7g/L ~7.8g/L。
[0037]下面將更詳細地描述本發(fā)明。
[0038]本發(fā)明涉及一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[0039]所述生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法的步驟如下:
[0040]A、平板活化培養(yǎng)
[0041]使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20~32°C的條件下平板活化培養(yǎng)2~6天，得到平板培養(yǎng)物。
[0042]重組耶氏解脂酵母菌株(Yarrowialipolytica)CCFM-JU277-9已于 2013 年 3 月 06日在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCCN0.7284，具體參見CN103233036A。
[0043]所述的平板固體培養(yǎng)基制備方法如下: [0044]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸水溶液或無機堿水溶液，將所得到溶液的PH調節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0045]在這個步驟中，使用的恒溫培養(yǎng)箱是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由上海森信實驗儀器有限公司以商品名隔水式恒溫培養(yǎng)箱銷售的產(chǎn)品。[0046]在這個步驟以及后續(xù)步驟中，所述的無機酸選自硫酸或鹽酸。在本發(fā)明中使用的是無機酸水溶液。所述的無機堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀。使用的是無機堿水溶液。所述無機酸或無機堿水溶液的濃度是2.0-4.0moI/Lο
[0047]B、種子培養(yǎng)
[0048]使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下培養(yǎng)40~52小時；
[0049]所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下:
[0050]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0051]在這個步驟中，所述的種子培養(yǎng)是在培養(yǎng)搖床中進行的，本發(fā)明使用的培養(yǎng)搖床是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由上海智誠分析儀器制造有限公司以商品名恒溫培養(yǎng)振蕩器銷售的產(chǎn)品。
[0052]C、發(fā)酵培養(yǎng)[0053]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計0.5%~2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉接到pH4.5~8.5的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20°C _25°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)35-40小時，當重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進入生長穩(wěn)定期，再添加終濃度為30g/L的乳化紅花籽油與IOmM 二價金屬離子溶液，該乳化紅花籽油含有以所述紅花籽油重量計0.1~1.0%乳化劑，接著在溫度28-32 V與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)48~100小時，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500~8500rpm的條件下離心分離10~18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液；
[0054]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下:
[0055]按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調節(jié)至4.5-5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0056]在這個步驟中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)是在震蕩培養(yǎng)箱中進行的，本發(fā)明使用的震蕩培養(yǎng)箱是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由上海智誠分析儀器制造有限公司以商品名恒溫培養(yǎng)振蕩器銷售的產(chǎn)品。
[0057]本發(fā)明人就發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH問題進行了研究，結果表明液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH在4.5~8.5范圍內都有利于生物量的合成，優(yōu)選地是pH為4.5，其tlO，cl2_CLA
的廣量最聞。
[0058]當培養(yǎng)基中含有疏水性物質存在時，耶氏解脂酵母自身能夠分泌一種乳化劑，但是分泌的量有限，需要額外添加。
[0059]本發(fā)明人就乳化劑問題進行了研究，結果表明陽離子型乳化劑(例如十六烷基三甲基溴化銨，CTMAB)效果不佳。陰離子型乳化劑(例如十二烷基磺酸鈉，SDS)、非離子型乳化劑(例如吐溫-80和曲拉通-100)效果好。優(yōu)選地是吐溫-80。
[0060]因此，制備紅花籽油乳化液使用非離子型乳化劑吐溫-80，其制備方法如下:
[0061]把紅花籽油添加到以重量計0.6%乳化劑水溶液中，直到紅花籽油的濃度達到150~250g/L，接著使用超聲設備在功率200W的條件下進行超聲處理4~6分鐘，再使用0.22 μ m無菌濾膜過濾除菌。
[0062]所述的乳化劑選自陰離子乳化劑十二烷基磺酸鈉(SDS)、陽離子乳化劑十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)、非離子型乳化劑吐溫-80或曲拉通-100。這些乳化劑都是在本【技術領域】里通常使用的、在目前市場上銷售的產(chǎn)品。
[0063]在這個步驟中，使用的超聲設備是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由美國SONICS公司以商品名超聲波細胞粉碎機銷售的產(chǎn)品。
[0064]在這個步驟中，使用的0.22 μ m無菌濾膜是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由上海興亞凈化材料廠公司以商品名微孔濾膜銷售的產(chǎn)品。
[0065]金屬離子不僅能夠影響細胞的正常代謝活動，對酶的活性也具有很大的影響。為此，本發(fā)明人對金屬離子的影響也進行了研究。在本發(fā)明中，所述的二價金屬離子選自Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+或Ca2+金屬離子。研究結果表明在穩(wěn)定期后添加金屬離子時，添加Zn2+時tlO，C12-CLA產(chǎn)量比不添加金屬離子時高得多。
[0066]優(yōu)選地，所述的二價金屬離子是Zn2+金屬離子。
[0067]溫度對微生物細胞生長、產(chǎn)物合成及代謝的影響是多方面的，不僅可以改變培養(yǎng)基的性質，而且會影響細胞代謝過程中各種關鍵酶的活性。為此，本發(fā)明人對溫度的影響也進行了研究，研究結果表明重組耶氏解脂酵母菌株先在22°C培養(yǎng)溫度下生長，進入穩(wěn)定期后添加紅花籽油，調整培養(yǎng)溫度為30°C的條件下，tlO，C12-CLA產(chǎn)量比恒溫培養(yǎng)時高。
[0068]所述的菌體使用以重量計0.70~1.00%NaCl水溶液洗滌2~3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進行凍干；
[0069]NaCl水溶液洗滌的`目的在于洗掉菌體細胞表面附著的脂肪酸所述的凍干是讓所述的洗滌菌體在溫度-10°C~-30°c與真空度1.0~10.0Pa的條件下進行冷凍干燥。
[0070]在這個步驟中，進行凍干所使用的設備是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由美國LABC0NC0.公司以商品名凍干機銷售的產(chǎn)品。
[0071]D、由菌體提取脂肪
[0072]按照以mg計凍干菌體與以ml計8~12%鹽酸-甲醇溶液之比為20~50:0.5~
1.5，讓步驟C所得到的凍干菌體與8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~-65°C的條件下進行甲酯化2.5~3.5小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在5000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘,在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
[0073]在本發(fā)明中，采用常規(guī)氣相色譜定量分析方法(參見文獻BaixiZhang, ChunchiRongect.Denovosynthesisoftrans-10, cis_12conjugatedlinoleicacidinοIeaginousyeastYarrowia Lipolytica.MicrobialCellFactoriesj 2012, 11:51))分析了在所述脂肪酸甲酯中的共軛亞油酸t(yī)lO，C12-CLA含量。
[0074]在這個步驟中，所述脂肪酸甲酯中共軛亞油酸t(yī)lO，C12-CLA的含量分別是3.0g/L ~7.2g/L。
[0075]E、由發(fā)酵上清液提取脂肪
[0076]按照以ml計發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0~12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液2~4次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~65°C的條件下進行甲酯化0.5~3小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在3000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
[0077]采用上述常規(guī)氣相色譜定量分析方法分析，所述脂肪酸甲酯中共軛亞油酸t(yī)lO，cl2-CLA的含量分別是3.7g/L~7.8g/L。
[0078]在本發(fā)明中，共軛亞油酸t(yī)lO與C12-CLA得率是共軛亞油酸t(yī)lO，cl2_CLA的含量(g/L)與添加紅花籽油量(g/L)的比值。
[0079]通過前面描述與實施例可以清楚地知道，采用本發(fā)明方法制備的脂肪酸甲酯中共軛亞油酸t(yī)lO，C12-CLA的含量遠高于現(xiàn)有技術所達到的含量。 [0080][有益效果]
[0081]本發(fā)明的有益效果是:在使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9與紅花籽油生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯時，使用吐溫-80乳化劑與二價鋅離子，控制發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值，控制培養(yǎng)溫度，采用變溫培養(yǎng)能夠非常顯著地提高了 tlO，cl2-CLA產(chǎn)量，因此，本發(fā)明使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的應用前景。
【【具體實施方式】】
[0082]通過下述實施例將能夠更好地理解本發(fā)明。
[0083]實施例1:使用不同乳化劑制備含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯
[0084]該實施例的實施步驟如下:
[0085]A、平板活化培養(yǎng)
[0086]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用2.0mol/L硫酸或氫氧化鈉水溶液將所得到溶液的pH調節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min，得到平板固體培養(yǎng)基。
[0087]使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的平板固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28°C的條件下平板活化培養(yǎng)4天，得到所述的平板培養(yǎng)物；
[0088]B、種子培養(yǎng)
[0089]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用2.0mol/L硫酸或氫氧化鈉水溶液將所得到溶液的PH調節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min，得到種子培養(yǎng)基。
[0090]使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度28°C與200rpm的條件下培養(yǎng)46小時；
[0091]C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0092]按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用2.0mol/L硫酸或氫氧化鈉水溶液將所得到溶液的pH調節(jié)至6.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0093]把紅花籽油植物油添加到以重量計0.6%乳化劑水溶液中，所述的乳化劑是十二烷基磺酸鈉(SDS )、十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB )、吐溫-80或曲拉通-100，直到所述植物油的濃度達到200g/L，接著使用超聲設備在功率200W的條件下進行超聲處理5分鐘，再使用0.22 μ m無菌濾膜過濾除菌，得到相應的乳化植物油。
[0094]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計1.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度28°C與200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在菌株進入穩(wěn)定期后添加終濃度為30g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)48小時，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在8000rpm的條件下離心分離15分鐘,得到菌體與發(fā)酵上清液。
[0095]所述的菌體使用以重量計0.85%NaCl水溶液洗滌2次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著在溫度_20°C與真空度
5.0Pa的條件下進行凍干。
[0096]D、由菌體提取脂肪
[0097]按照以mg計凍干菌體與以ml計10%鹽酸-甲醇溶液之比為35:1.0,讓步驟C所得到的凍干菌體與10%鹽酸-甲醇溶液在溫度50°C的條件下進行甲酯化3.0小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取10分鐘，接著在6000rpm的條件下離心分離3分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作I次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
[0098]E、由發(fā)酵上清液提取脂肪
[0099]按照以ml計發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:10.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液3次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的10%鹽酸-甲醇溶液在溫度50°C的條件下進行甲酯化I小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取10分鐘，接著在6000rpm的條件下離心分離3分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作I次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
[0100]采用本說明書描述的氣相色譜定量分析方法測定了本實施例制備所得到的脂肪酸甲酯中的lot，12c -CLA含量，其結果列于表1中。
[0101]表1:不同乳化劑對CLA產(chǎn)量的影響
[0102]
【權利要求】
1.一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于該方法的步驟如下: A、平板活化培養(yǎng) 使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20~32°C的條件下平板活化培養(yǎng)2~6天，得到平板培養(yǎng)物； B、種子培養(yǎng) 使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下培養(yǎng)40~52小時； C、發(fā)酵培養(yǎng) 按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計0.5%~2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉接到PH4.5~8.5的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20°C -25°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)35-40小時，當重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進入生長穩(wěn)定期，再添加終濃度為30g/L的乳化紅花籽油與IOmM二價金屬離子溶液，該乳化紅花籽油含有以所述紅花籽油重量計0.1~1.0%乳化劑，接著在溫度28-32°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)48~100小時，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500~8500rpm的條件下離心分離10~18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液； 所述的菌體使用以重量計0.70~1.00%NaCl水溶液洗滌2~3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進行凍干； D、由菌體提取脂肪 按照以mg計凍干菌體與以ml計8~12%鹽酸-甲醇溶液之比為20~50:0.5~1.5,讓步驟C所得到的凍干菌體與8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~-65°C的條件下進行甲酯化2.5~3.5小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在5000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯； E、由發(fā)酵上清液提取脂肪 按照以ml計發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0~12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液2~4次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~65°C的條件下進行甲酯化0.5~3小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在3000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的平板固體培養(yǎng)基制備方法如下: 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20mino
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下:按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的pH調節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下: 按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調節(jié)至4.5-5.5，然后在溫度115 °C的條件下滅菌20min。
5.根據(jù)權利要求2-4中任一項權利要求所述的方法，其特征在于所述的無機酸選自硫酸或鹽酸；所述的無機堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述無機酸或無機堿水溶液的濃度是 2.0 ~4.0mol/Lo
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的紅花籽油乳化液制備方法如下: 把紅花籽油添加到以重量計0.6%乳化劑水溶液中，直到紅花籽油的濃度達到150~250g/L，接著使用超聲設備在功率200W的條件下進行超聲處理4~6分鐘，再使用0.22 μ m無菌濾膜過濾除菌。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的二價金屬離子是Zn2+。
8.根據(jù)權利要求1或6所述的方法，其特征在于所述在于的乳化劑是吐溫-80。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗滌菌體在溫度-10°C~_30°C與真空度1.0~10.0Pa的條件下進行凍干。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟D中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2-CLA含量分別是3.0g/L~7.2g/L ;在步驟E中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2_CLA含量分別是 3.7g/L ~7.8g/L。
【文檔編號】C12R1/645GK103710401SQ201410021562
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權日:2014年1月17日
【發(fā)明者】陳衛(wèi), 李敏, 張白曦, 陳海琴, 趙建新, 顧震南, 田豐偉, 王剛, 張灝, 陳永泉 申請人:江南大學