一種快速提取魚卵dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種快速提取魚卵DNA的方法。所述方法按下列步驟進行：（1）使用蛋白酶k消化魚卵；（2）將EP管及澄清液放入水浴鍋或烘箱中，在溫度為85-90℃條件下，溫浴1小時，完成對魚卵DNA的提取。本發(fā)明具有操作簡單、快速、無DNA損失、費用低廉等優(yōu)點，提供一種從魚卵中制備DNA，用作一般PCR擴增的模板。
【專利說明】一種快速提取魚卵DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到生物工程領(lǐng)域，特別涉及到一種快速提取魚卵DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脫氧核糖核酸(DNA)是一類帶有遺傳信息的生物大分子，主要由4種的脫氧核苷酸(dAP、dGP、dCT和dTP)排列組成。不同物種的DNA的4種脫氧核苷酸在組成和排列上存在差異，據(jù)此可以作為區(qū)分物種的分子標記。
[0003]對河流、湖泊、海洋等魚類產(chǎn)卵場位置和規(guī)模的確定是環(huán)境生態(tài)學(xué)的重要內(nèi)容，其方法一般是采集魚卵，鑒定魚卵的發(fā)育期，再根據(jù)水文條件，如水文、流速等推算產(chǎn)卵場位置和規(guī)模。由于在自然環(huán)境中有多個魚類同期同地產(chǎn)卵，因此還需要鑒別采集到魚卵的種類。以往，鑒別魚卵種類的方法一般根據(jù)卵苗的外觀，如卵徑徑大小和形狀、色素等來判斷這種方法常常依賴于經(jīng)驗，并且有不少魚類無法鑒定到品種，因此可靠性比較差。另一種方法是將魚卵苗培養(yǎng)至成魚后再判斷，此種方法耗時長，并且存在有的種類不易養(yǎng)活，以及采集的受精卵因損傷不能孵化等的缺點，因此不利于研究。
[0004]近年來，分子標記技術(shù)在鑒定魚卵種類上具有快速、準確的優(yōu)點，越來越多的研究人員使用分子標記技術(shù)來研究魚卵種類。分子標記技術(shù)分析魚卵種類的基本步驟是:1)提取采集到魚卵的DNA ;2)采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)，結(jié)合靶位點引物，擴增靶位點DNA片段；3)對靶位點DNA片段進行DNA測序或電泳分型；4)根據(jù)DNA序列或電泳分型的結(jié)果，對照已知種類的DNA序列或分型，判定魚卵的種類。目前提取動物DNA的主要方法有:I)酚-氯仿法(薩姆布魯克，拉塞爾著，`黃培堂等譯《分子克隆實驗指南》，2005);2)高鹽法(Aljanabi and Martinez (1997) );3)各種商業(yè)公司提供的DNA提取試劑盒法等。這些方法的步驟是首先裂解組織并消化其中蛋白，其次是使蛋白質(zhì)變性或把DNA結(jié)合到某種介質(zhì)，然后通過離心分離蛋白和DNA，獲取DNA。這些方法通常情況下也可以用于提取魚卵的DNA，但存在一些缺陷如:1、耗時較長；2、使用一些對人及環(huán)境有害的化學(xué)藥品，如酚、氯仿等；3、在離心分離蛋白和DNA過程時會損失一些DNA，這一點對于魚卵這樣微量樣本顯得非常重要，需要具備有一定的實驗經(jīng)驗等。這些目前提取DNA方法的不足之處對于僅需獲取用于分子標記鑒定種類的DNA為目的而言，顯得尤為突出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快速提取魚卵DNA的方法，該方法獲取的DNA可以滿足一般PCR擴增的要求。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
一種快速提取魚卵DNA的方法，所述方法按下列步驟進行:
(I)使用蛋白酶k消化魚卵:將保存在乙醇中的魚卵放入1.5mL規(guī)格的EP管中，加入ImL滅菌蒸餾水浸泡I小時，以除去魚卵中殘留的乙醇，倒去蒸餾水，然后加入30-50mL標準配制的TE緩沖液和2-5mL濃度為20mg/mL的蛋白酶k溶液，用滅菌移液器吸頭或牙簽將魚卵搗碎后，將EP管移到溫度為45-55°C的水浴鍋或烘箱內(nèi)，消化1-3小時至溶液澄清；
(2)將EP管及澄清液放入水浴鍋或烘箱中，在溫度為85-90°C條件下，溫浴I小時，完成對魚卵DNA的提取。
[0007]本發(fā)明的積極效果為:
1、該方法操作簡單，無需有害藥品和復(fù)雜步驟，普通實驗室和一般人員均可操作；
2、快速，一般2-4小時即可完成；
3、DNA無丟失，整個步驟均在一個EP管內(nèi)完成，不存在DNA丟失的可能；
4、費用低，由于沒有使用過多的藥品和耗材，相對目前常用DNA提取的方法，費用降低80%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為草魚線粒體DNA控制區(qū)(1-10)和細胞色素b (11-20)的PCR擴增結(jié)果。M為DNA分子量標準，大小從上而下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp ；
圖2為黃顙魚(/^7fulvidraco)線粒體DNA控制區(qū)(1_10)和細胞色素b (11-20)的PCR擴增結(jié)果。M為DNA分子量標準，大小從上而下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp ；
圖3為鱖^似化乃魚卵線粒體口嫩控制區(qū)^^和細胞色素匕(6-11)的PCR擴增結(jié)果。M為DNA分子量標準，大小從上而下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp ；圖4為日本鰻鱺線粒體DNA控制區(qū)(1-10)和細胞色素b( 11-20)的PCR擴增結(jié)果。M為DNA分子量標準，大小從上而下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp。
【具體實施方式】
[0009]下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的【具體實施方式】。
[0010]實施例一
從乙醇保存的草魚idellus)魚卵中提取DNA,并用于線粒體DNA控制區(qū)及細胞色素b基因的PCR擴增。
[0011]1、將野外獲得并用無水乙醇保存的草魚魚卵帶回實驗室。
[0012]2、使用鑷子將魚卵卵膜挑破，將胚胎放入1.5 mL的EP管中，加入I mL滅菌蒸餾水浸泡I小時，倒去蒸餾水，加入50 ML TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH=8.0)和3 ML濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液。
[0013]3、用移液器吸頭或剪刀將魚卵胚胎搗碎后，將EP管移入溫度為50°C烘箱里消化2小時至溶液澄清。
[0014]4、將EP管及澄清液放入90°C水浴鍋水浴中溫浴I小時，完成后取出EP管靜置待溫度降至室溫，然后放入冰箱中備用。
[0015]5、采用線粒體DNA控制區(qū)通用引物(黃志堅，等.中山大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版，2009)及細胞色素 b 基因通用引物(Xiao et al.Molecular Phylogenetics andEvolution, 2001, 18(2): 163-173)，對提取的 DNA 進行 PCR 擴增。擴增體系包括 10 XPCRBuffer 5 ML、10 mmol/L dNTP 0.5 ML、Taq DNA 聚合酶 2 UUO MmoI/L 引物個 2 ML、DNA溶液1ML，補充滅菌雙蒸水至50 ML。擴增反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性30秒、54°C退火30秒、72°C延伸I分鐘共30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸8分鐘。
[0016]6、取2 ML PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖1。圖1中顯示，無論控制區(qū)還是細胞色素b基因，PCR均能擴增得到預(yù)期大小的DNA片段。
[0017]實施例二
從乙醇保存的黃顙魚iPelteobagrus /WnWraco )魚卵中提取DNA,并用于線粒體DNA控制區(qū)及細胞色素b基因的PCR擴增。
[0018]1、將野外獲得并用無水乙醇保存的黃顙魚魚卵帶回實驗室。
[0019]2、使用鑷子將魚卵卵膜挑破，將胚胎放入1.5 mL的EP管中，加入I mL滅菌蒸餾水浸泡I小時，倒去蒸餾水，加入30 ML TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH=8.0)和2 ML濃度為20mg/ml的蛋白酶K溶液。
[0020]3、用移液器吸頭或剪刀將魚卵胚胎搗碎后，將EP管移入溫度為45°C烘箱里消化3小時至溶液澄清。
[0021]4、將EP管及澄清液放入85°C水浴鍋水浴中溫浴I小時，完成后取出EP管靜置待溫度降至室溫，然后放入冰箱中備用。
[0022]5、采用線粒體DNA控制區(qū)通用引物(黃志堅，等.中山大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版，2009)及細胞色素 b 基因通用引物(Xiao et al.Molecular Phylogenetics andEvolution, 2001, 18(2): 163-173)，對提取的 DNA 進行 PCR 擴增。擴增體系包括 10XPCRBuffer 5 ML、10 mmol/L` dNTP 0.5 ML、Taq DNA 聚合酶 2 UUO Mmol/L 引物個 2 ML、DNA溶液1ML，補充滅菌雙蒸水至50 ML。擴增反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性30秒、54°C退火30秒、72°C延伸I分鐘共30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸8分鐘。
[0023]6、取2 ML PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖2。圖2中顯示，無論控制區(qū)還是細胞色素b基因，PCR均能擴增得到預(yù)期大小的DNA片段。
[0024]實施例三
從新鮮鱖chua tsi )魚卵中提取DNA,并用于線粒體DNA控制區(qū)及細胞色素b基因的PCR擴增。
[0025]1、將野外獲得并用無水乙醇保存的鱖魚魚卵帶回實驗室。
[0026]2、使用鑷子將魚卵卵膜挑破，將胚胎放入1.5 mL的EP管中，加入I mL滅菌蒸餾水浸泡I小時，倒去蒸餾水，加入40 ML TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH=8.0)和4ML濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液。
[0027]3、用移液器吸頭或剪刀將魚卵胚胎搗碎后，將EP管移入溫度為55°C烘箱里消化I小時至溶液澄清。
[0028]4、將EP管及澄清液放入90°C水浴鍋水浴中溫浴I小時，完成后取出EP管靜置待溫度降至室溫，然后放入冰箱中備用。
[0029]5、采用線粒體DNA控制區(qū)通用引物(黃志堅，等.中山大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版，2009)及細胞色素 b 基因通用引物(Xiao et al.Molecular Phylogenetics andEvolution, 2001, 18(2): 163-173)，對提取的 DNA 進行 PCR 擴增。擴增體系包括 10XPCRBuffer 5 ML、10 mmol/L dNTP 0.5 ML、Taq DNA 聚合酶 2 UUO Mmol/L 引物個 2 ML、DNA溶液1ML，補充滅菌雙蒸水至50 ML。擴增反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性30秒、54°C退火30秒、72°C延伸I分鐘共30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸8分鐘。
[0030]6、取2 ML PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖3。圖3中顯示，控制區(qū)及細胞色素b基因，PCR均能擴增得到預(yù)期大小的DNA片段。
[0031]實施例四
從新鮮日本鰻鱺(Anguilla Japonica )魚卵中提取DNA,并用于線粒體DNA控制區(qū)及細胞色素b基因的PCR擴增。
[0032]1、將野外獲得并用無水乙醇保存的日本鰻鱺魚魚卵帶回實驗室。
[0033]2、使用鑷子將魚卵卵膜挑破，將胚胎放入1.5 mL的EP管中，加入I mL滅菌蒸餾水浸泡I小時，倒去蒸餾水，加入50 ML TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH=8.0)和3 ML濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液。
[0034]3、用移液器吸頭或剪刀將魚卵胚胎搗碎后，將EP管移入溫度為50°C烘箱里消化2小時至溶液澄清。
[0035]4、將EP管及澄清液放入90°C水浴鍋水浴中溫浴I小時，完成后取出EP管靜置待降至室溫，然后放入冰箱中備用。
[0036]5、采用線粒體DNA控制區(qū)通用引物(黃志堅，等.中山大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版，2009)及細胞色素 b 基因通用引物(Xiao et al.Molecular Phylogenetics andEvolution, 2001, 18(2): 163-173)，對提取的 DNA 進行 PCR 擴增。擴增體系包括 10XPCRBuffer 5 ML、10 mmol/L dNTP 0.5 ML、Taq DNA 聚合酶 2 UUO Mmol/L 引物個 2 ML、DNA溶液1ML，補充滅菌雙蒸水至50 ML。擴增反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性30秒、54°C退火30秒、72°C延伸I分鐘共30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸8分鐘。
[0037]6、取2 ML PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖4。圖4中顯示，無論控制區(qū)還是細胞色素b基因，PCR均能擴增得到預(yù)期大小的DNA片段。
[0038]以上所述僅是本發(fā)明的非限定實施方式，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思和不作出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種快速提取魚卵DNA的方法，其特征在于:所述方法按下列步驟進行: (1)使用蛋白酶k消化魚卵:將保存在乙醇中的魚卵放入1.5mL規(guī)格的EP管中，加入ImL滅菌蒸餾水浸泡I小時，以除去魚卵中殘留的乙醇，倒去蒸餾水，然后加入30-50mL標準配制的TE緩沖液和2-5mL濃度為20mg/mL的蛋白酶k溶液，用滅菌移液器吸頭或牙簽將魚卵搗碎后，將EP管移到溫度為45-55°C的水浴鍋或烘箱內(nèi)，消化1-3小時至溶液澄清； (2)將EP管及澄清液放入水浴鍋或烘箱中，在溫度為85-90°C條件下，溫浴I小時，完成對魚卵DNA的提取。
【文檔編號】C12N15/10GK103710339SQ201410021659
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】汪登強, 蔣菁菁, 段辛斌, 劉紹平, 陳大慶, 劉明典, 王珂, 李小芳 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所