一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶及其表達載體和工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶及其表達載體和工程菌。本發(fā)明提供一種重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸序列，如SEQIDNo：1所示。本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏愛性，對ThermusthermophilusHB27來源的錳過氧化氫酶基因序列進行密碼子優(yōu)化，當(dāng)優(yōu)化后的錳過氧化氫酶在大腸桿菌中表達時，搖瓶發(fā)酵液中最高可檢測到過氧化氫酶酶活為120U/mL；而當(dāng)該錳過氧化氫酶與Mn離子轉(zhuǎn)運蛋白MntH共表達時，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液中過氧化氫酶發(fā)酵酶活可達1300U/mL。
【專利說明】一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶及其表達載體和工程菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶及其表達載體和工程菌。
【背景技術(shù)】
[0002]過氧化氫酶(Catalase，簡稱CAT)，催化分解過氧化氫為水和氧氣。CAT廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙和醫(yī)藥等行業(yè)，其中在紡織工業(yè)中主要用于布料漂白后殘余H2O2的消除。與傳統(tǒng)工藝的水洗或化學(xué)助劑相比，CAT具有減少污染、提高后續(xù)印染質(zhì)量等優(yōu)點；但值得關(guān)注的是，印染工序通常是在高溫(T>70°C)堿性(pH>9)環(huán)境中進行的，這就需要CAT具備嗜熱嗜堿的應(yīng)用特性。盡管CAT來源豐富，幾乎存在于所有的需氧微生物中，但市場上目前仍缺乏具備優(yōu)良紡織應(yīng)用特性的CAT。[0003]過氧化氫酶按催化中心結(jié)構(gòu)差異可分為兩類:(1)含鐵卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)CAT，又稱鐵過氧化氫酶(FeCAT) ; (2)由錳離子代替鐵離子的卟啉結(jié)構(gòu)，又稱錳過氧化氫酶(MnCAT)，目前已發(fā)現(xiàn)約280種FeCAT和30種MnCAT。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)個別來源于高溫堿性環(huán)境中的古細菌可以產(chǎn)生具有嗜熱嗜堿特性的MnCAT,例如:Metallosphaera hakonensis來源的MnCAT，在pH8.0-10.0環(huán)境中處理60min酶活損失小于20% ;在70°C下處理50min，酶活殘留率約在 60%(Alkali_tolerant high-activity catalase from a thermophilicbacterium and its overexpression in Escherichia coli，Protein expression andpurification, 2008.57 (2): 255-260.)。但目前這類嗜熱MnCAT的研究仍處于初級階段，國外文獻報道的該類MnCAT最高發(fā)酵酶活力僅約為20U/ml，而國內(nèi)還未見其相關(guān)報道(Non-heme manganese catalase - the ‘other’catalase, Archives of biochemistry andbiophysics, 2012, 525:111-120.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明鑒于上述情況，根據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏愛性，對Thermusthermophilus HB27來源的錳過氧化氫酶基因序列進行密碼子優(yōu)化，提供一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶及其表達載體和工程菌，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0005]為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸，其序列如SEQ ID No:1所示。
[0006]所述多核苷酸序列根據(jù)Thermus thermophilus來源的猛過氧化氫酶基因核苷酸序列，按照大腸桿菌(Escherichia coli)密碼子使用偏愛件(http://gcua.schoedl.de/seqoverall v2.html)優(yōu)化設(shè)計。
[0007]本發(fā)明第二方面提供一種重組含錳過氧化氫酶，由所述的多核苷酸序列編碼。
[0008]本發(fā)明第三方面提供一種重組含錳過氧化氫酶表達載體(pET28a-MnCAT )，包含所述重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸序列。
[0009]優(yōu)選的，所述表達載體為pET系列表達載體。[0010]更優(yōu)選的,所述pET系列表達載體為pET28a(+)。所述pET28a(+)購自Novagen公司。
[0011 ] 本發(fā)明第四方面提供一種工程菌(BL21 (DE3) /pET28a_MnCAT )，所述工程菌由所述重組含錳過氧化氫酶表達載體(pET28a-MnCAT)轉(zhuǎn)化獲得。
[0012]優(yōu)選的，所述工程菌由所述重組含錳過氧化氫酶表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得。
[0013]更優(yōu)選的，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0014]本發(fā)明第五方面提供所述重組含錳過氧化氫酶的制備方法，包括如下步驟:
[0015]將所述工程菌在LB培養(yǎng)基中活化過夜后，轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌濃0D600達到
0.7-0.8時，添加MnCl2和IPTG，再誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0016]所得培養(yǎng)液的菌體破碎上清液中的酶活力可達120U/ml。
[0017]進一步的，由于pET28a(+)上含有6_His純化標(biāo)簽，因此選擇常用的N1-NTA樹脂親和層析法進行蛋白純化。
[0018]優(yōu)選的，轉(zhuǎn)接時按1%轉(zhuǎn)接。
[0019]優(yōu)選的，轉(zhuǎn)接至含有50 μ g/ml Kan的TB培養(yǎng)基中。
[0020]優(yōu)選的，所述IPTG的終濃度為0.2mmol/L,所述MnCl2的終濃度14mmol/L。優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的具體條件為:在42°C條件下誘導(dǎo)2h。
[0021]本發(fā)明第六方面提供 錳離子轉(zhuǎn)運蛋白Mnt H (ACCESSIONU00096REG10N:2509490..2510728)在提高重組含錳過氧化氫酶的誘導(dǎo)表達中的用途。
[0022]優(yōu)選的，所述重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0023]本發(fā)明第七方面提供一種工程菌，所述工程菌(BL21 (DE3) /pET28a_MnCAT/pACYC-Mnt H)由所述重組含錳過氧化氫酶表達載體(pET28a-MnCAT)和錳離子轉(zhuǎn)運蛋白MntH表達載體(pACYC-Mnt H)轉(zhuǎn)化獲得。
[0024]優(yōu)選的，所述猛離子轉(zhuǎn)運蛋白Mnt H表達載體采用pACY⑶uet-1。
[0025]優(yōu)選的，所述工程菌由所述重組含錳過氧化氫酶表達載體和錳離子轉(zhuǎn)運蛋白MntH表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得。所述錳離子轉(zhuǎn)運蛋白Mnt H表達載體可與pET系列載體共存于一個原核細胞中。
[0026]更優(yōu)選的，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0027]本發(fā)明第八方面提供所述重組含錳過氧化氫酶的另一種誘導(dǎo)表達方法，包括如下步驟:
[0028]將所述工程菌在LB培養(yǎng)基中活化過夜后，轉(zhuǎn)接至含有Kan和Cm的TB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌濃0D600達到0.7-0.8時，添加IPTG，同時添加MnCl2，再誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0029]所得培養(yǎng)液的菌體破碎上清液中的過氧化氫酶酶活可達約1300U/ml。
[0030]進一步的，由于pET28a(+)上含有6_His純化標(biāo)簽，因此選擇常用的N1-NTA樹脂親和層析法進行蛋白純化。
[0031]優(yōu)選的，轉(zhuǎn)接時按1%轉(zhuǎn)接。
[0032]優(yōu)選的，轉(zhuǎn)接至含有30-35 μ g/ml Kan和18-20 μ g/ml Cm的TB培養(yǎng)基中。
[0033]優(yōu)選的，所述IPTG的終濃度為0.2mmol/L,所述Mncl2的終濃度2mmol/L。
[0034]優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的具體條件為:37°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)30_32h。
[0035]本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏愛性，對Thermus thermophilus HB27來源的錳過氧化氫酶基因序列進行密碼子優(yōu)化，當(dāng)優(yōu)化后的MnCAT在大腸桿菌中表達時，搖瓶發(fā)酵液中最高可檢測到CAT酶活為120U/mL ;而當(dāng)該MnCAT與Mn離子轉(zhuǎn)運蛋白Mnt H共表達時，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液中CAT發(fā)酵酶活可達1300U/mL，本發(fā)明不僅通過基因密碼子優(yōu)化及發(fā)酵優(yōu)化首次實現(xiàn)了 Thermus thermophilus HB27來源的MnCAT在大腸桿菌中的活性表達，且其發(fā)酵酶活值達到約1300U/mL，遠高于文獻報道的此類酶發(fā)酵最高酶活力約20U/ml，為該酶的進一步應(yīng)用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1表達載體pET28a_MnCAT的物理圖譜；
[0037]圖2表達載體pET28a_MnCAT的酶切鑒定；
[0038]M:DNA Mark DL5000 ；1~2:Nco I 和 Hind III 雙酶切后的 DNA 片段；
[0039]圖3重組大腸桿菌E.coli PB-Ol的SDS-PAGE圖；
[0040]M:Protein Marker PR1600 ； 1-3:PB_01 ；
[0041 ]圖4表達載體pACYC-Mnt H物理圖譜；
[0042]圖5表達載體pACYC-Mnt H的酶切鑒定；
[0043]M:DNA Mark DL5000 ；1~2:Nde I 和 Xho I 雙酶切后的 DNA 片段；
[0044]圖6重組大腸桿菌E.coli PB-02的SDS-PAGE圖；
[0045]M:Protein Marker PR1600；1-3:PB_02。
【具體實施方式】
[0046]以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的【具體實施方式】加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0047]在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。
[0048]當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。
[0049]除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition, 2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press, San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119，Chromatin Protocols (P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0050]所述重組含錳過氧化氫酶表達載體(pET28a_MnCAT)的構(gòu)建方法為:將所述重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸序列兩端設(shè)計限制性內(nèi)切酶Nco I和Hind III酶切位點，重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸序列經(jīng)Nco I和Hind III雙酶切后克隆至經(jīng)相同酶切后的胞內(nèi)表達載體pET28a ( + )上，構(gòu)建重組含錳過氧化氫酶表達載體。所述表達載體經(jīng)測序驗證后保存在大腸桿菌DH5a中。
[0051]重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸序列中不具備但載體pET28a ( + )多克隆位點上具有限制性內(nèi)切酶Nco I和Hind III酶切位點。
[0052]所述表達載體pET28a_MnCAT的物理圖譜如圖1。
[0053]所述表達載體pET28a_MnCAT的Nco I和Hind III雙酶切圖譜如圖2所示。
[0054]所述工程菌(BL21(DE3)/pET28a-MnCAT)的構(gòu)建方法為:將重組含錳過氧化氫酶表達載體化學(xué)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素(Kan)的LB平板，于37°C培養(yǎng)至出現(xiàn)重組單菌落，挑取單菌落，驗證正確后即得所述工程菌，標(biāo)記為工程菌PB-Ol。所述卡那霉素(Kan)的LB平板優(yōu)選為50 μ g/ml。
[0055]工程菌Ε.coli PB-Ol (BL21 (DE3)/pET28a_MnCAT)在 LB 培養(yǎng)基中活化過夜后，按1%轉(zhuǎn)接至含有50 μ g/ml K·an的TB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌濃0D600達到0.7-0.8時，添加終濃度14mmol/L的Mncl2和0.2mmol/L的IPTG，在42°C條件下誘導(dǎo)2h的情況下，菌體破碎上清液中的酶活力可達120U/ml。
[0056]所述錳離子轉(zhuǎn)運蛋白Mnt H表達載體(pACYC-Mnt H)的構(gòu)建方法為:以E.coliW3110 (E.coli Genetic Stock Center, Yale University)的基因組為模板,在基因 mnt H兩端設(shè)計mnt H基因中不具備但載體pACY⑶uet-Ι多克隆位點上具有的限制性內(nèi)切酶Nde
I和Xho I酶切位點，通過PCR擴增mnt H基因。擴增得到的mnt H基因片段經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切后克隆至經(jīng)相同酶切后的胞內(nèi)表達載體pACY⑶uet-Ι上，構(gòu)建重組表達載體pACYC-Mnt H。所述表達載體經(jīng)測序驗證后保存在大腸桿菌DH5 α中。
[0057]所述表達載體pACYC-Mnt H的物理圖譜如圖4。
[0058]所述表達載體pACYC-Mnt H的Nde I和Xho I雙酶切圖譜如圖5所示。
[0059]所述工程菌(BL21(DE3)/pET28a-MnCAT/pACYC-Mnt H)的構(gòu)建方法為:重組表達載體pACYC-Mnt H化轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a_MnCAT感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素(Kan)和氯霉素(Cm)的LB平板，于37°C培養(yǎng)至出現(xiàn)重組單菌落，挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行Nde I和Xho I雙酶切驗證正確后，驗證正確后即得所述工程菌，標(biāo)記為工程菌PB-02。優(yōu)選的，涂布于含30-35 μ g/ml卡那霉素(Kan)和18-20 μ g/ml氯霉素(Cm)的LB平板。
[0060]工程菌E.coli PB-02 (BL21 (DE3)/pET28a-MnCAT/pACYC_Mnt H)在 LB 培養(yǎng)基中活化過夜后，按1%轉(zhuǎn)接至含有30-35 μ g/ml Kan和18-20 μ g/ml Cm的TB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌濃0D600達到0.7-0.8時，添加終濃度0.2mmol/L IPTG，同時添加終濃度2mmol/L Mncl2,37°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)30-32h的情況下，菌體破碎上清液中的過氧化氫酶酶活可達約1300U/ml。錳過氧化氫酶酶活的測定方法具體如下:采用分光光度法37°C測定CAT的酶活力，反應(yīng)體積為 3mL,包括 0.1mL 的酶液樣品和 2.9mL 含 IOmmoI/L H2O2 的 50mmol/L ρΗ8.0Tris-HCl緩沖液，H2O2的分解速率用紫外分光光度計在240nm下測定。酶活活力單位(U/mL)的定義為:在37°C、pH8.0的條件下每分鐘分解I μ mo I H2O2所需的CAT酶量為一個酶活單位。
[0061]實施例1錳過氧化氫酶MnCAT原核表達基因工程菌的構(gòu)建
[0062]1.1基于大腸桿菌密碼子使用偏愛性優(yōu)化設(shè)計的MnCAT基因
[0063]根據(jù)大腸桿菌(Escherichia coli )密碼子使用的偏愛件(http: //gcua.schoedl.de/seaoverall v2.html)優(yōu)化設(shè)計，所得密碼子優(yōu)化后的MnCAT基因具有如序列SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列。 [0064]1.2MnCAT原核表達載體pET28a_MnCAT的構(gòu)建
[0065]在MnCAT基因的5’ -端和3’ -端分別設(shè)計該基因中不具備但載體pET28a(+)多克隆位點上具有的限制性內(nèi)切酶Nco I和Hind III酶切位點(由于直接在基因N末端添加內(nèi)切酶Nco I核苷酸序列CCATGG，會造成MnCAT基因翻譯時發(fā)生移碼突變，因此為了防止移碼突變，在Nco I的核苷酸序列CCATGG后加了 GT兩個核苷酸，即在原基因序列起始密碼子ATG后面添加了一個甘氨酸的密碼子GGT序列；另外在基因的C末端，為純化方便去掉了終止密碼子TAA，后再加上內(nèi)切酶Hind III核苷酸序列AAGCTT)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司直接合成，MnCAT基因片段經(jīng)Nco I和Hind III雙酶切后克隆至經(jīng)相同酶切后的表達載體pET28a ( + )上，構(gòu)建重組表達載體pET28a-MnCAT (圖1 )，經(jīng)測序驗證后保存在大腸桿菌DH5 α中。
[0066]1.3 重組表達菌株 BL21 (DE3) /pET28a_MnCAT 的構(gòu)建
[0067]重組表達質(zhì)粒pET28a_MnCAT轉(zhuǎn)化經(jīng)氯化鈣制備大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，涂布于LB平板(Kan，50 μ g/ml )，倒置、于37°C培養(yǎng)至出現(xiàn)重組單菌落，挑取重組單菌落，LB液體培養(yǎng)基(Kan，50y g/ml)中培養(yǎng)10-12h后，提取質(zhì)粒進行Nco I和Hind III雙酶切驗證正確后(圖2)，獲得重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-MnCAT，標(biāo)記為基因工程菌PB-Ol。
[0068]實施例2錳過氧化氫酶MnCAT的誘導(dǎo)表達
[0069]2.1種子培養(yǎng)
[0070]將基因工程菌PB-Ol，接入含50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，50ml培養(yǎng)基放入250ml的培養(yǎng)瓶中，37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時間為10~12小時，培養(yǎng)后0D600吸光值在4~5之間。
[0071]注:LB培養(yǎng)基(g/L)組分為:蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。
[0072]2.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):
[0073]將種子培養(yǎng)液按1%轉(zhuǎn)接至含有50mg/L卡那霉素(Kan)的TB培養(yǎng)基中，當(dāng)重組菌E.coli PB-Ol生長至OD6tltl0.7-0.8時，添加終濃度0.2mmol/L IPTG,同時添加終濃度14mmol/L MnCl2,42°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)2h，收集菌體、破碎細胞后對上清液進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)在33Kda處存在明顯的蛋白條帶，與文獻報道的MnCAT蛋白分子量一致(圖3)，對所獲蛋白進行N端測序，結(jié)果符合預(yù)期。酶活測定結(jié)果顯示，破碎上清液中CAT酶活力達到120U/ml ο[0074]注:TB培養(yǎng)基(g/L)組分為:甘油5，蛋白胨12，酵母粉24，K2HP0412.54，ΚΗ2Ρ042.31。
[0075]實施例3錳過氧化氫酶MnCAT與Mnt H共表達基因工程菌的構(gòu)建
[0076]3.1猛離子轉(zhuǎn)運蛋白Mnt H原核表達載體pACY⑶uet-Mnt H的構(gòu)建
[0077]以 E.coli W3110 (E.coli Genetic Stock Center, Yale University)的基因組為模板，設(shè)計引物PCR擴增得到錳離子轉(zhuǎn)運蛋白Mnt H的基因DNA片段。所用的上游引物為:
[0078]Pl:5? -CATATGACGAACTATCGCGTTGAGAGTAGC-3> (下劃線 Nde I 酶切位點)。
[0079]下游引物為:
[0080]P2:5’ -CTCGAGCTACAATCCCAGCGCCGTC-3’ (下劃線 Xho I 酶切位點)。
[0081]PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、Pstl/PvuII雙酶切后，克隆至經(jīng)相同酶切后的胞內(nèi)表達載體pACY⑶uet-Ι上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pACY⑶uet-Mnt H，經(jīng)測序驗證后保存在大腸桿菌DH5a 中(圖 4，圖 5)。
[0082]3.2 重組表達菌株 BL21 (DE3) /pET28a-MnCAT/pACYCDuet_Mnt H 的構(gòu)建
[0083]重組表達質(zhì)粒pACY⑶uet-Mnt H轉(zhuǎn)化經(jīng)氯化鈣制備大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-MnCAT 感受態(tài)細胞，涂布于 LB 平板(Kan，35 μ g/ml ；Cm, 18 μ g/ml )，倒置、于 37°C培養(yǎng)至出現(xiàn)重組單菌落，挑取重組單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行Nde I和XhoI雙酶切驗證正確后，得到重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-MnCAT/pACYC-Mnt H，標(biāo)記為工程菌PB-02。
[0084]實施例4錳過氧化氫酶MnCAT和Mnt H的誘導(dǎo)表達
[0085]4.1種子培養(yǎng)
[0086]將基因工程菌PB-02，接入含35 μ g/ml Kan和18 μ g/ml Cm的LB培養(yǎng)基中，50ml培養(yǎng)基放入250ml的培養(yǎng)瓶中，37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時間為10~12小時，培養(yǎng)后0D600吸光值在4~5之間。
[0087]注:LB培養(yǎng)基(g/L)組分為:蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。
[0088]4.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):
[0089]將種子培養(yǎng)液按1%轉(zhuǎn)接至含有Kan，35 μ g/ml和Cm，18 μ g/ml的TB培養(yǎng)基中，當(dāng)重組菌E.coli PB-02生長至OD6J).7-0.8時，添加終濃度0.2mmol/L IPTG,同時添加終濃度2mmol/L MnCl2, 37°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)30_32h，收集菌體、破碎細胞后對上清液進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)除在33Kda處存在MnCAT的蛋白電泳條帶外，在43.6Kda附近出現(xiàn)與文獻報道的MntH蛋白分子量大小一致電泳條帶(圖6)，對所獲蛋白進行N端測序，結(jié)果符合預(yù)期。酶活測定結(jié)果顯示，破碎上清液中CAT酶活力達到約1300U/ml。
[0090]注:TB培養(yǎng)基(g/L)組分為:甘油5，蛋白胨12，酵母粉24，K2HP0412.54，ΚΗ2Ρ042.31。
[0091]綜上所述，通過本發(fā)明所提供的重組含錳過氧化氫酶的序列所表達的CAT酶活力達到約1300U/ml，遠高于文獻報道的此類酶發(fā)酵最高酶活力約20U/ml，有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值，具備很好的應(yīng)用開發(fā)潛力。
[0092]上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變·，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【權(quán)利要求】
1.一種重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸，其序列如SEQ ID No:l所示。
2.一種重組含錳過氧化氫酶，由權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列編碼。
3.一種重組含錳過氧化氫酶表達載體，包含如權(quán)利要求1所述的重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的重組含錳過氧化氫酶表達載體，其特征在于，所述表達載體為PET系列表達載體。
5.如權(quán)利要求4所述的重組含錳過氧化氫酶表達載體，其特征在于，所述pET系列表達載體為 pET28a(+)。
6.一種工程菌，所述工程菌由權(quán)利要求3-5任一權(quán)利要求所述的重組含錳過氧化氫酶表達載體轉(zhuǎn)化獲得。
7.如權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌由權(quán)利要求3-5任一權(quán)利要求所述的重組含錳過氧化氫酶表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得。
8.如權(quán)利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
9.一種重組含錳過氧化氫酶的制備方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求6-8任一權(quán)利要求所述的工程菌在LB培養(yǎng)基中活化過夜后，轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基中，添加MnCl2和IPTG，再誘導(dǎo)培養(yǎng)。
10.一種工程菌，所述工程菌由權(quán)利要求3-5任一權(quán)利要求所述的重組含錳過氧化氫酶表達載體和錳離子轉(zhuǎn)運蛋白Mnt H表達載體轉(zhuǎn)化獲得。
11.如權(quán)利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述錳離子轉(zhuǎn)運蛋白MntH表達載體采用 pACYCDuet-1。
12.如權(quán)利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌由權(quán)利要求3-5任一權(quán)利要求所述的重組含錳過氧化氫酶表達載體和錳離子轉(zhuǎn)運蛋白Mnt H表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得。
13 .如權(quán)利要求12所述的工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
14.一種重組含錳過氧化氫酶的制備方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求10-13任一權(quán)利要求所述的工程菌在LB培養(yǎng)基中活化過夜后，轉(zhuǎn)接至含有Kan和Cm的TB培養(yǎng)基中，添加IPTG，同時添加MnCl2，再誘導(dǎo)培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N1/21GK103725699SQ201410023123
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】趙志軍, 史吉平, 孫俊孫, 何曉娟 申請人:中國科學(xué)院上海高等研究院