一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法及培養(yǎng)基的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，以及所用的發(fā)酵培養(yǎng)基。所述方法包括：將毒三素鏈霉菌（Streptomyces?toxytricini）接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加Mg2+、Co2+和Zn2+的終濃度分別為10～15mmol/L、0.5～2.0mmol/L和0.1～0.5mmol/L，在28℃、220r/min下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵培養(yǎng)第4天添加亮氨酸至其終濃度為40～50mmol/L、第6天添加正辛酸至其終濃度為30～40mmol/L，總發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為150～180h，發(fā)酵結(jié)束后，于發(fā)酵液中獲得所述利普司他??；本發(fā)明對(duì)影響利普司他汀發(fā)酵合成的前體物以及金屬離子的添加組合進(jìn)行了優(yōu)化，找到了最佳的前體物和金屬離子的組合，顯著提高了利普司他汀的產(chǎn)量，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)利普司他汀可以顯著提高效價(jià)，降低成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法及培養(yǎng)基
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，以及所用的發(fā)酵培養(yǎng)基。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]利普司他汀(Lipstatin)是由毒三素鏈霉菌(Streptomyces toxytricini)經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其四氫衍生物為奧利司他(olistat)是羅氏公司(Roche)成功開(kāi)發(fā)的減肥藥(賽尼可)，奧利斯他是第一個(gè)胃腸道脂肪酶抑制劑，它通過(guò)與胃和小腸腔內(nèi)胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價(jià)鍵使酶失活，減少脂肪的分解和吸收，從而達(dá)到控制體重的作用。奧利斯他是目前唯一的不進(jìn)入血液、不作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的減肥藥。[0003]奧利司他可以通過(guò)全化學(xué)合成法或先通過(guò)發(fā)酵合成法產(chǎn)生利普司他汀后進(jìn)行氫化合成。由于全合成法生產(chǎn)成本比較高，目前主要由微生物發(fā)酵合成法生產(chǎn),該法成本較低，環(huán)境友好，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
[0004]發(fā)酵法生產(chǎn)中，主要通過(guò)毒三素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)。因此，通過(guò)對(duì)該菌菌株的改良、培養(yǎng)基以及發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化來(lái)提高利普司他汀的發(fā)酵效價(jià)都是研究的目標(biāo)。國(guó)內(nèi)外有不少利普司他汀發(fā)酵生產(chǎn)的相關(guān)專(zhuān)利。美國(guó)專(zhuān)利US4598089、US2005089978A1描述了利用毒三素鏈霉菌菌株NRRL 15443進(jìn)行利普司他汀發(fā)酵生產(chǎn)的工藝。歐洲專(zhuān)利EP0803567描述了發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)添加亞油酸、辛酸和N-甲?；?L-亮氨酸或亮氨酸來(lái)提高利普司他汀的工藝，但是發(fā)酵水平比較低，低于lg/L。國(guó)際專(zhuān)利WO 03/048335描述了用油替代具體脂肪酸生產(chǎn)脂肪酸的方法。國(guó)際專(zhuān)利W02004003212中描述了利用不同淀粉底物的培養(yǎng)基，發(fā)酵水平為1.486g/L。國(guó)際專(zhuān)利W003048335發(fā)酵水平為1.8g/L。美國(guó)最新的美國(guó)專(zhuān)利US8501444 (2013年8月)描述了亞油酸和ω-9脂肪酸的結(jié)合使用，顯著提高了利普司他汀的產(chǎn)量。中國(guó)專(zhuān)利CN 102268466Β描述了通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中流加亞油酸和亮氨酸以及控制發(fā)酵工藝提高了利普司他汀發(fā)酵效價(jià)的方法，其中利用發(fā)酵罐生產(chǎn)利普司他汀的效價(jià)可以達(dá)到5g/L以上。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供了一種通過(guò)給該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)加微量元素、補(bǔ)加前體物質(zhì)來(lái)提高來(lái)提高利普司他汀發(fā)酵單位的方法，尤其是通過(guò)補(bǔ)加微量元素和前體物質(zhì)的組合優(yōu)化工藝來(lái)顯著提高利普司他汀產(chǎn)量。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，所述方法包括:將毒三素鏈霉菌(Streptomyces toxytricini)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,在28°C、220r/min下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵培養(yǎng)第4天添加亮氨酸至其終濃度為40~50mmol/L、第6天添加正辛酸至其終濃度為30~40mmol/L，總發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為150~180h，發(fā)酵結(jié)束后，于發(fā)酵液中獲得所述利普司他汀；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:黃豆餅粉30~40g/L，玉米蛋白粉5~10g/L，葵花油80~120g/L，大豆卵磷脂20~30g/L，甘油20~30g/L，吐溫-80 0.01~0.lg/L,碳酸鈣 0.1 ~1.0g/L,維生素 Ε0.01 ~0.5g/L,維生素 C0.05 ~0.5g/L, MgSO4IO ~15mmol/L,CoSO4.7Η200.5 ~2.0mmoI/L, ZnSO4.7Η200.I ~0.5mmol/L,溶劑為水，ρΗ7.0 ~7.5。所述毒三素鏈霉菌(Streptomyces toxytricini)菌株為本領(lǐng)域已知可用于生產(chǎn)利普司他汀毒三素鏈霉菌菌株，可市購(gòu)或者從菌種庫(kù)購(gòu)買(mǎi)獲得。
[0008]優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:黃豆餅粉32.5g/L，玉米蛋白粉8g/L，葵花油100g/L，大豆卵磷脂25g/L，甘油22.5g/L，吐溫-80 0.05g/L,碳酸鈣0.8g/L，維生素E0.025g/L,維生素 C0.125g/L, MgS0412mmol/L, CoSO4.7H201mmol/L, ZnSO4.7H200.25mmol/L，溶劑為水，pH7.1。
[0009]優(yōu)選的，所述亮氨酸添加量為45.72mmol/L、正辛酸添加量為31.1985mmol/L。
[0010]在發(fā)酵培養(yǎng)之前，菌株通常需要進(jìn)行常規(guī)種子斜面活化培養(yǎng)和種子擴(kuò)大培養(yǎng)，具體可如下:
[0011]斜面活化培養(yǎng):培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)周期166h~192h，得到活化菌種；斜面培養(yǎng)基組成:可溶性淀粉10g/L，麥粉5g/L，酵母提取物lg/L，干酪素lg/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，ρΗ7.1，121~125°C滅菌20min后制成斜面。
[0012]種子擴(kuò)大培養(yǎng):培養(yǎng)溫度28 °C，1000mL三角瓶裝量IOOmL,搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)時(shí)間30h，得到種子液；種子培養(yǎng)基組成:黃豆餅粉20g/L，甘油20g/L，酵母提取物5g/L，溶劑為水，PH7.1，121~125°C滅菌20min。所得種子液以5~15%體積比接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)即可。
[0013]本發(fā)明還涉及一種用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成如下:黃豆餅粉30~40g/L， 玉米蛋白粉5~10g/L，葵花油80~120g/L，大豆卵磷脂20~30g/L，甘油 20 ~30g/L,吐溫-80 0.01 ~0.lg/L,碳酸鈣 0.1 ~1.0g/L,維生素 E0.01 ~
0.5g/L,維生素 C0.05 ~0.5g/L, MgSO4IO ~15mmol/L, CoSO4.7Η200.5 ~2.0mmoI/L,ZnSO4.7Η200.I ~0.5mmol/L，溶劑為水，ρΗ7.0 ~7.5。
[0014]本發(fā)明培養(yǎng)基與現(xiàn)有培養(yǎng)基相比，增加了金屬離子種類(lèi)和用量，增加了利普司他汀前體物亮氨酸和正辛酸，以及金屬離子和前體物的組合優(yōu)化。利普司他汀的微生物發(fā)酵中，合成途徑相關(guān)的酶起著關(guān)鍵的作用，這些酶的催化作用往往是金屬離子依賴(lài)性的，因此，本發(fā)明通過(guò)篩選不同的金屬離子及濃度來(lái)提高利普司他汀發(fā)酵效價(jià)。發(fā)現(xiàn)同時(shí)加入Mg2+、Co2+和Zn2+能顯著提高利普司他汀發(fā)酵效價(jià)。另外，還發(fā)現(xiàn)Cu2+對(duì)利普司他汀的發(fā)酵有顯著的抑制作用，因此在培養(yǎng)基中應(yīng)避免Cu2+的進(jìn)入。
[0015]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明對(duì)影響利普司他汀發(fā)酵合成的前體物以及金屬離子的添加組合進(jìn)行了優(yōu)化，找到了最佳的前體物和金屬離子的組合，顯著提高了利普司他汀的產(chǎn)量，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)利普司他汀可以顯著提高效價(jià)，降低成本。
(四)【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為發(fā)酵液中補(bǔ)加亮氨酸和正辛酸對(duì)利普司他汀產(chǎn)量的影響；
[0017]圖2為金屬離子對(duì)利普司他汀發(fā)酵合成的影響。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0019]實(shí)施例1:
[0020]1、菌株:
[0021]毒三素鏈霉菌(Stretomyces toxytricini )突變株XC-lp-69 (浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠提供)。
[0022]2、培養(yǎng)基:
[0023]斜面培養(yǎng)基配制:可溶性淀粉10g，麥粉5g，酵母提取物lg，干酪素lg，磷酸二氫鉀
0.5g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，加水定容到1L，pH值調(diào)到7.1,121 ~ 125°C，滅菌20min。該培養(yǎng)基用于菌種活化。
[0024]種子培養(yǎng)基配制:黃豆餅粉20g，甘油20g，酵母提取物5g，加水定容到1L，pH值調(diào)到7.1,121~125°C，滅菌20min。該培養(yǎng)基用于種子液制備。
[0025]初始發(fā)酵培養(yǎng)基:黃豆餅粉32.5g，玉米蛋白粉Sg，葵花油100g，大豆軟磷脂25g，甘油22.5g，吐溫-80 0.05g,碳酸鈣0.8g，維生素E0.025g,維生素C0.125g，加水定容到lL，pH調(diào)到7.1,121~125°C，滅菌20min。該培養(yǎng)基用于發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀。
[0026]3、培養(yǎng)和發(fā)酵條件:
[0027]斜面培養(yǎng):培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)周期166h~192h，得活化菌種；
`[0028]種子培養(yǎng):培養(yǎng)溫度28°C，1000mL三角瓶裝量IOOmL種子培養(yǎng)基，接種活化后的菌種，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)時(shí)間30h，得種子液；
[0029]發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)溫度28°C，500mL三角瓶裝量50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%體積比接種種子液，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，總培養(yǎng)時(shí)間168h，得發(fā)酵液。
[0030]4、利普司他汀的測(cè)定方法
[0031]發(fā)酵液中利普司他汀采用HPLC分析:取發(fā)酵液0.5mL，加丙酮4.5mL，搖勻，超聲20min,浸泡過(guò)夜,取上清液ImL離心(12000r/min) 3min,上清液經(jīng)聚偏氟乙烯微孔濾膜(0.22 μ m)過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定。HPLC波長(zhǎng)210nm分析上清液。流動(dòng)相為乙腈:水=85:15，流速 1.0mT,/mi η η
[0032]5、金屬離子、前體物、發(fā)酵條件研究
[0033]發(fā)酵培養(yǎng)基前體物添加、金屬離子的添加以及發(fā)酵條件的改良和優(yōu)化是在上述發(fā)酵培養(yǎng)基及條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行添加和改變。
[0034]5.1不同前體物對(duì)對(duì)利普司他汀發(fā)酵的影響
[0035]亮氨酸和正辛酸是利普司他汀生物合成的重要前體物質(zhì)，因而在培養(yǎng)基中添加適量的前體物質(zhì)可促使利普司他汀產(chǎn)量的提高。根據(jù)表1設(shè)置分批對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行前體物添加試驗(yàn)，考察其對(duì)利普司他汀產(chǎn)量的影響。
[0036]表1:亮氨酸和正辛酸補(bǔ)加方案
[0037]
m I不同處理方式
I陰性對(duì)照
--第4d補(bǔ)亮氨酸，終濃度15.24mmol/L
【權(quán)利要求】
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，所述方法包括:將毒三素鏈霉菌(Streptomyces toxytricini)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,在28°C、220r/min下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵培養(yǎng)第4天添加亮氨酸至其終濃度為40~50mmol/L、第6天添加正辛酸至其終濃度為30~40mmol/L，總發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為150~180h，發(fā)酵結(jié)束后，于發(fā)酵液中獲得所述利普司他??；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:黃豆餅粉30~40g/L，玉米蛋白粉5~10g/L，葵花油80~120g/L，大豆卵磷脂20~30g/L，甘油20~30g/L，吐溫-800.01~0.lg/L，碳酸鈣 0.1 ~1.0g/L,維生素 E0.01 ~0.5g/L,維生素 C0.05 ~0.5g/L, MgSO4IO ~15mmol/L,CoSO4.7Η200.5 ~2.0mmol/L, ZnSO4.7Η200.I ~0.5mmol/L，溶劑為水，ρΗ7.0 ~7.5。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:黃豆餅粉32.5g/L,玉米蛋白粉8g/L，葵花油100g/L，大豆卵磷脂25g/L，甘油22.5g/L，吐溫-80 0.05g/L,碳酸鈣 0.8g/L，維生素 E0.025g/L，維生素 C0.125g/L, MgS0412mmol/L, CoSO4.7H201mmol/L,ZnSO4.7Η200.25mmol/L，溶劑為水，ρΗ7.1。
3.一種用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的培養(yǎng)基，其組成如下:黃豆餅粉30~40g/L,玉米蛋白粉5~10g/L，葵花油80~120g/L，大豆卵磷脂20~30g/L，甘油20~30g/L，吐溫-80 0.01~0.lg/L,碳酸鈣0.1~1.0g/L,維生素E0.01~0.5g/L，維生素C0.05~.0.5g/L, MgSO4IO ~15mmol/L, CoSO4.7H200.5 ~2.0mmol/L, ZnSO4.7H200.1 ~0.5mmol/L，溶劑為水，pΗ7.0~7.5。
【文檔編號(hào)】C12P17/02GK103820510SQ201410023133
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】朱廷恒, 王凌斐, 吳濤, 汪琨, 崔志峰 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué), 余姚市浙工大技術(shù)轉(zhuǎn)移中心