與常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥發(fā)生相關(guān)的血漿miRNA標志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了與常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥發(fā)生相關(guān)的血漿miRNA標志物及其應(yīng)用。該標志物選自hsa-miR-31、hsa-miR-147和hsa-miR-206中的多種。該標志物對常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥具有特異性和敏感性，可用于制備常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥診斷或監(jiān)測的試劑，可避免侵入性診斷，并可在早期進行篩查和診斷，可反復(fù)檢測并易于動態(tài)監(jiān)測。
【專利說明】與常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥發(fā)生相關(guān)的血漿miRNA標志物及其應(yīng)用
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于基因工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及與常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥發(fā)生相關(guān)的血衆(zhòng)微小核糖核酸(microRNA, miRNA)標志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥(NCA)是小兒外科常見的消化道畸形，在先天性消化道畸形的發(fā)生中僅次于先天性肛門直腸畸形。CA以消化道遠端神經(jīng)節(jié)細胞缺如為主要特征，主要表現(xiàn)為腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中腸神經(jīng)遷移障礙或遷移后發(fā)育異常，從而導(dǎo)致遠端腸管神經(jīng)節(jié)細胞缺如，遠端腸管功能受限，最終以排便困難，腹脹及腸梗阻為主要臨床癥狀。CA根據(jù)其狹窄段的長短主要分為短段型、常見型、長段型及全結(jié)腸型。其中，NCA是指腸管病變段位于肛門口開始至乙狀結(jié)腸遠端?；贜CA的高發(fā)病率，病情相對較輕，良好預(yù)后的基礎(chǔ)，本發(fā)明以此型作為研究對象。目前我國統(tǒng)計NCA發(fā)病率約為1:3000，男女比大約為4:1，即每年有近一萬的新生兒會出現(xiàn)該種出生缺陷。NCA的發(fā)病原因目前尚不完全明了，主要認為:在胚胎發(fā)育過程中，胚胎第5周神經(jīng)母細胞開始沿迷走神經(jīng)干由頭側(cè)向尾側(cè)遷移，于胚胎第12周到達消化道遠端，在此過程中任何原因?qū)е律窠?jīng)母細胞遷移發(fā)生停頓即可造成遠端腸管腸壁神經(jīng)節(jié)細胞缺如。病理解剖提示直腸及遠端結(jié)腸狹窄，近端腸管擴張，狹窄段腸壁黏膜下層及黏膜肌層神經(jīng)節(jié)細胞缺如。狹窄段腸壁膽堿能受體及腎上腺能β受體含量較正常腸段減少，導(dǎo)致腸管及內(nèi)括約肌痙攣，并且缺乏正常的腸蠕動，因此會形成功能性腸梗阻。長期慢性腸梗阻導(dǎo)致患兒食欲下降、營養(yǎng)吸收障礙、生長發(fā)育遲緩、貧血等，嚴重者引起小腸結(jié)腸炎、腸穿孔及多器官功能衰竭，危及患兒生命，給患兒及其家庭帶來嚴重后果。
[0003]NCA患兒治療多`需手術(shù)，并且就目前來說手術(shù)是解決患兒臨床癥狀的根治辦法。但在臨床工作中仍然會面臨很多困難，特別是手術(shù)時機如何選擇等。而新生兒常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥的診斷相當困難，結(jié)合其臨床表現(xiàn):不排胎便及胎便排出延遲合并腹脹、梗阻、嘔吐，直腸指檢伴有氣便排出，需考慮該疾病診斷，同時需對患兒進行一系列輔助檢查如:χ線，鋇劑灌腸檢查，肛門直腸測壓，酶組織化學(xué)檢查及活檢等。以上輔助檢查可以幫助診斷該疾病，但尚存在一些缺陷，如檢查價格昂貴、射線輻射危險，操作繁瑣且有一定的創(chuàng)傷性及風(fēng)險。這都給患兒帶來極大的痛苦并且給家庭帶來嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。更為重要的是，這類檢查均基于不排胎便及胎便排出延遲等臨床癥狀，而出現(xiàn)此類癥狀往往已在患病后數(shù)日常錯過了最佳的早期手術(shù)時機，并給患兒帶來了相當長時間的痛苦，尋找一種簡單、準確、微創(chuàng)的早期常見型先天性腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥診斷方法意義重大。
[0004]微小核糖核酸(microRNA,即miRNA)是近年剛剛興起的研究熱點，它是一類長約19-23個核苷酸的單鏈RNA分子，多位于基因組非編碼區(qū)，進化上高度保守，可在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)節(jié)，并與動物的許多正常生理活動，如生物個體發(fā)育、組織分化、細胞凋亡以及能量代謝等密切相關(guān)，同時也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。自參與調(diào)控線蟲時序發(fā)育的lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)以來，miRNA已逐漸成為調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和蛋白翻譯的研究熱點，分別在2002年和2003年兩度入選Science雜志年度十大科技突破?，F(xiàn)在預(yù)測miRNA至少能調(diào)控數(shù)千個人類基因，占所有基因的30%以上。隨著研究的深入，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)。目前，miRNA與腫瘤的關(guān)系已成為研究的重點，已發(fā)現(xiàn)若干miRNA通過負調(diào)控基因的表達與慢性淋巴細胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌高度相關(guān)。然而，血漿miRNA與常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥等人類出生缺陷的相互關(guān)系尚未見報道。
[0005]最新的研究成果發(fā)現(xiàn)血漿中存在上百種的miRNA，性質(zhì)穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性，在肺癌、結(jié)腸癌中已經(jīng)證實血漿miRNA的表達譜可作為早期診斷的潛在生物標志物。這一發(fā)現(xiàn)令人振奮，血漿miRNA作為一類非編碼調(diào)節(jié)性的小分子RNA有可能取代傳統(tǒng)的特異蛋白為代表的生物標志物，開拓了生物標志物的新境界。該研究迅速引起國際媒體的廣泛關(guān)注，路透社、合眾社、《科學(xué)的美國人》、美國《技術(shù)評論》等都對該研究成果進行了專門報道，《Nature》雜志也在其網(wǎng)站首頁的“最新研究進展”專欄中展示了這一最新研究進展。然而血漿中miRNA在常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥早期診斷監(jiān)測中的應(yīng)用還未 得到相應(yīng)的關(guān)注，若能發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的與常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥發(fā)病相關(guān)的特異血漿miRNA作為生物標志物，并研發(fā)相應(yīng)疾病的診斷、監(jiān)測試劑盒，不僅能創(chuàng)造令人矚目的經(jīng)濟效益，對我國出生缺陷的防治也將是一次強有力的推動。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥發(fā)生提供相關(guān)的血漿microRNA標志物。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是為上述血漿microRNA標志物提供引物。
[0008]本發(fā)明還有一個目的是為含有上述血漿提供microRNA標志物或其引物的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明再有一個目的是為含有上述血提供漿microRNA標志物或其引物的用于常見型腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥診斷或監(jiān)測的試劑盒。
[0010]本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的:
[0011]與常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥相關(guān)的血漿microRNA標志物，選自hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 中的多種。
[0012]所述的血衆(zhòng)microRNA 標志物由 hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 構(gòu)成。
[0013]所述的血漿microRNA標志物，其中hsa-miR-31 的序列為 AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU(SEQ ID N0.1), hsa-miR-147 的序列為 GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC (SEQ ID N0.2),hsa-miR-206 的序列為 UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG (SEQ ID N0.3)。
[0014]所述的血漿microRNA標志物的引物，其中序列為SEQ ID N0.1的標志物的上游引物為SEQ ID N0.4，下游引物為SEQ ID N0.5 ;序列為SEQ ID N0.2的標志物的上游引物為SEQ ID N0.6，下游引物為SEQ ID N0.7 ;序列為SEQ ID N0.3的標志物的上游引物為SEQID N0.8，下游引物為 SEQ ID N0.9。
[0015]所述的血漿microRNA標志物或其引物在制備常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥診斷或監(jiān)測試劑中的應(yīng)用。所述試劑是能夠測定這些血漿microRNA標志物在血漿中表達量的試劑。
[0016]一種常見型腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥診斷或監(jiān)測試劑盒，該試劑盒含有上述血漿microRNA 標志物(hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 中的多種)的引物。
[0017]所述的診斷或監(jiān)測試劑盒，該試劑盒含有上述引物(SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9)中的多對。
[0018]所述的診斷或監(jiān)測試劑盒，該試劑盒含有下列3對引物SEQ ID N0.4和SEQ IDN0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9。
[0019]試劑盒中除引物外的其他試劑可采用現(xiàn)有技術(shù)中相應(yīng)檢測技術(shù)的常用試劑。
[0020]本發(fā)明詳細描述如下:
[0021]本發(fā)明人以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人群基礎(chǔ)信息和臨床資料，并米用了 RT-PCR方法、Taqman miRNA Array>Real-time PCRCTaqman探針和染料法)方法的一種或幾種進行檢測。
[0022]具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分:
[0023]一、研究對象選擇和分組依據(jù)
[0024]A組:健康對照組(n=100，20人芯片篩選，40人一期驗證，40人獨立人群驗證):
[0025]1.年齡在O至6月間；
[0026]2.無消化系統(tǒng)疾病；
[0027]3.無其它先天`畸形；
[0028]4.無其他全身性重大疾病。
[0029]B組:常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥組(n=100，20人芯片篩選，40人一期驗證，40人獨立人群驗證):
[0030]1.年齡在O至6月間；
[0031]2.經(jīng)鋇劑灌腸、結(jié)腸測壓、術(shù)后病理證實病變段位于從肛門口至乙狀結(jié)腸遠端；
[0032]3.排除短段型，長段型及全結(jié)腸型病變的患兒；
[0033]4.無其他伴隨先天畸形；
[0034]5.無其它消化系統(tǒng)疾病；
[0035]6.無其他全身性重大疾病。
[0036]二、血液血漿分離及前處理
[0037](I)新鮮肝素抗凝血5ml于離心機3000rpm離心5min,取上清每100 μ I分裝至潔凈1.5ml EP管中。
[0038](2)向EP管中加入900 μ I Trizol，充分混勻后，12000轉(zhuǎn)離心15min，立即取上清至一潔凈1.5ml EP管中。
[0039](3)向EP管中加入1.5倍上清水相體積的無水乙醇，充分混勻后轉(zhuǎn)移至離心柱，1000Orpm離心15秒,棄下層廢液。
[0040](4)在離心柱上加入700 μ I RffT緩沖液，1000Orpm離心15秒，棄下層廢液。
[0041](5)在離心柱上加入500 μ I RPE緩沖液，1000Orpm離心15秒，棄下層液。重復(fù)一遍。
[0042](6)將離心柱加入一個新的2ml的管子，1000Orpm離心I分鐘，用于去除RPE緩沖液。
[0043](7)將離心柱裝在一個新的1.5ml的離心管中，并在柱子上加入50 μ IDEPC處理的水，離心I分鐘。[0044](8)_70°C保存處理后的樣本。
[0045]本發(fā)明實驗中使用的離心柱和配套試劑(RWT緩沖液、RPE緩沖液)均來自QiagenmiRNeasy Mini Kit (貨號217004)這個試劑盒,下同。
[0046]三、Real-time PCR方法測量血漿miRNAs表達量
[0047]1.取經(jīng)前處理的血漿，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品。
[0048]按下表所示配制反轉(zhuǎn)錄體系:
[0049]
【權(quán)利要求】
1.與常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥發(fā)生相關(guān)的血漿micix)RNA標志物，選自hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 中的多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血衆(zhòng)microRNA標志物，其特征在于由hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的血衆(zhòng)microRNA標志物,其特征在于hsa-miR-31的序列為 SEQ ID N0.1，hsa-miR-147 的序列為 SEQ ID N0.2，hsa-miR-206 的序列為 SEQ ID N0.3。
4.權(quán)利要求3所述的血漿microRNA標志物的引物，其特征在于序列為SEQID N0.1的標志物的上游引物為SEQ ID N0.4，下游引物為SEQ ID N0.5 ;序列為SEQ ID N0.2的標志物的上游引物為SEQ ID N0.6，下游引物為SEQ ID N0.7 ;序列為SEQ ID N0.3的標志物的上游引物為SEQ ID N0.8，下游引物為SEQ ID N0.9。
5.權(quán)利要求1或2所述的血漿microRNA標志物在制備常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥的診斷或監(jiān)測試劑中的 應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述的引物在制備常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥診斷或監(jiān)測試劑中的應(yīng)用。
7.—種常見型先天腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥診斷或監(jiān)測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求1或2所述的血漿microRNA標志物的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷或監(jiān)測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求4所述引物中的多對。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的診斷或監(jiān)測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有下列3對引物SEQ ID N0.4和 SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8和 SEQ ID N0.9。
【文檔編號】C12N15/113GK103805603SQ201410025928
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】唐維兵, 唐俊偉, 陸春城, 吳煒, 秦晶晶, 李波, 周志剛, 劉康 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院