一種人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法，該人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法包括以下步驟：選擇用于獲得病原菌的新鮮材料，裝入潔凈的自封袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室在15℃下放置12h～24h，制備添加鏈霉素或孟加拉紅的清水瓊脂；在體視顯微鏡下觀察病部的真菌結(jié)構(gòu)，找到優(yōu)勢(shì)類群并挑取孢子，轉(zhuǎn)移到清水瓊脂小方塊上，按照單孢分離方法獲得粘有單個(gè)孢子的瓊脂塊3個(gè)～5個(gè)；將瓊脂塊轉(zhuǎn)移到添加適量抗細(xì)菌物質(zhì)的PDA上培養(yǎng)直到長(zhǎng)出菌落，得到一個(gè)確定形態(tài)的孢子對(duì)應(yīng)的相應(yīng)菌落；然后將這種培養(yǎng)物接種驗(yàn)證，通過(guò)發(fā)病部位的病原形態(tài)+分子數(shù)據(jù)信息（如ITS序列）共同鑒定病原物的種類。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，操作方便，提高了診斷植物真菌病害的效率和準(zhǔn)確性。
【專利說(shuō)明】一種人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病害診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法。
【背景技術(shù)】
[0002]正確診斷病害是開(kāi)展病害防治的關(guān)鍵，研究任何一種新病害都是從診斷開(kāi)始，只有明確了病原種類才能開(kāi)展進(jìn)一步的工作。診斷植物上的一種未知或新出現(xiàn)的病害，一般采用柯赫氏證病律(或稱柯赫法則)。對(duì)于一般易培養(yǎng)易產(chǎn)孢的真菌病害，通常采用組織塊分離方法后，選擇獲得的菌絲塊或孢子再進(jìn)行人工接種，觀察其新的癥狀是否與原來(lái)的一致。然后再對(duì)病原真菌進(jìn)行鑒定即可。
[0003]實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)常遇到一些難以準(zhǔn)確診斷的病害，這些病害有一個(gè)共性，即在病部可見(jiàn)大量的孢子，這些孢子是不是致病真菌產(chǎn)生的？要弄清這個(gè)問(wèn)題一般采用常規(guī)組織塊法分離即可，如玉米大、小斑病、玉米彎孢菌葉斑病、各種植物炭疽病等，在一般通用培養(yǎng)基(如PDA)上輕松就能培養(yǎng)并產(chǎn)孢。但有些植物真菌病害用組織塊法分離時(shí)，會(huì)長(zhǎng)出不同特征的菌落。真正的病原菌是否在其中，取決于所用的培養(yǎng)條件是否能滿足其生長(zhǎng)？病原菌是否能競(jìng)爭(zhēng)過(guò)腐生菌？病原菌能否產(chǎn)生繁殖體？如果病原菌不適宜這種培養(yǎng)條件或生長(zhǎng)速度較慢，則它的生長(zhǎng)會(huì)被病斑上的其它菌先行占領(lǐng)空間而導(dǎo)致分離失??；另一種可能是病原菌長(zhǎng)出來(lái)了，但由于不產(chǎn)孢且人們不熟悉它而無(wú)法與病部的結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來(lái)，從而達(dá)不到有效診斷。盡管人們?cè)缇陀惺褂面咦臃蛛x的方法來(lái)獲得病原菌以開(kāi)展進(jìn)一步科學(xué)研究用，但很少有從病部直接挑孢子來(lái)完成診斷的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法，旨在解決現(xiàn)有的植物真菌病害方法存在的效率低，準(zhǔn)確性低的問(wèn)題。
[0005]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法，該人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法包括以下步驟:
[0006]步驟一，選擇用于獲得病原菌的新鮮材料，從田間采取具有典型癥狀的病樣，裝入潔凈的自封袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室在15°C下放置12h~24h，制備添加鏈霉素或孟加拉紅，鏈霉素終濃度為30 μ g/mL,孟加拉紅終濃度為33ug/mL的清水瓊脂；
[0007]步驟二，在體視顯微鏡下觀察典型癥狀部位的真菌結(jié)構(gòu)，找到優(yōu)勢(shì)類群并挑取孢子，轉(zhuǎn)移少量孢子到清水瓊脂小方塊上，然后用無(wú)菌的長(zhǎng)針灸針或用細(xì)長(zhǎng)的縫衣針制作的解剖針挑取單個(gè)孢子，按照單孢分離方法獲得粘有單個(gè)孢子的瓊脂塊3個(gè)~5個(gè)；
[0008]步驟三，將瓊脂塊轉(zhuǎn)移到添加抗細(xì)菌物質(zhì)的PDA上培養(yǎng)直到長(zhǎng)出菌落，得到一個(gè)確定形態(tài)的孢子對(duì)應(yīng)的相應(yīng) 菌落，盡管不產(chǎn)孢，但這種孢子的培養(yǎng)物特征就明確了 ；
[0009]步驟四，然后將這種培養(yǎng)物接種驗(yàn)證，通過(guò)發(fā)病部位的病原形態(tài)+分子數(shù)據(jù)信息(如ITS序列)共同鑒定病原物的種類。[0010]進(jìn)一步，在步驟一中，放置時(shí)間不超過(guò)48h。
[0011]進(jìn)一步，在步驟二中，觀察真菌結(jié)構(gòu)還可以選擇直接剪取病斑在光學(xué)顯微鏡低倍視野下。
[0012]進(jìn)一步，該人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法的診斷程序?yàn)榘Y狀觀察，鏡檢病部，確定優(yōu)勢(shì)真菌，單孢子法分離，用單孢子對(duì)應(yīng)的菌落進(jìn)行致病性測(cè)定，完成柯赫法則，對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定，確定病害的真正病原菌。
[0013]本發(fā)明提供的人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法，通過(guò)典型癥狀觀察，鏡檢確定病部?jī)?yōu)勢(shì)真菌，直接挑取單孢，獲得對(duì)應(yīng)的菌落(不產(chǎn)孢)，菌塊接種，確定致病菌，誘導(dǎo)產(chǎn)孢或根據(jù)病部孢子的形態(tài)初步鑒定，提取病原菌DNA，rDNA的PCR擴(kuò)增，ITS序列分析，結(jié)合形態(tài)和分子的信息鑒定病原菌；本發(fā)明在遵循柯赫法則的基礎(chǔ)上，采用直接從病部獲取優(yōu)勢(shì)菌的孢子進(jìn)行人工培養(yǎng)后，在排除其它雜菌的前提下快速準(zhǔn)確地確定病原菌，方法簡(jiǎn)單，操作方便，提高了植物真菌病害方法的效率和準(zhǔn)確性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng) 理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0016]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0017]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法包括以下步驟:
[0018]SlOl:選擇用于獲得病原菌的新鮮材料，從田間采取具有典型癥狀的病樣，裝入潔凈的自封袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室在15°C下放置12h~24h，但不超過(guò)48h，否則易被雜菌污染，制備添加鏈霉素或孟加拉紅的清水瓊脂；
[0019]S102:在體視顯微鏡下觀察病部的真菌結(jié)構(gòu)，或者直接剪取病斑在光學(xué)顯微鏡低倍視野下觀察真菌結(jié)構(gòu)，找到優(yōu)勢(shì)類群并挑取孢子，轉(zhuǎn)移到WA小方塊上(約IcmX Icm)，按照單孢分離方法獲得粘有單個(gè)孢子的瓊脂塊3個(gè)~5個(gè)；
[0020]S103:將瓊脂塊轉(zhuǎn)移到添加適量抗細(xì)菌物質(zhì)的PDA上培養(yǎng)直到長(zhǎng)出菌落，這樣，得到一個(gè)確定形態(tài)的孢子對(duì)應(yīng)的相應(yīng)菌落，盡管不產(chǎn)孢，但這種孢子的培養(yǎng)物特征就明確了 ；
[0021]S104:然后將這種培養(yǎng)物接種驗(yàn)證，通過(guò)發(fā)病部位的病原形態(tài)+分子數(shù)據(jù)信息(如ITS序列)共同鑒定病原物的種類。
[0022]本發(fā)明的具體步驟為:
[0023]步驟一，選擇用于獲得病原菌的新鮮材料，從田間采取具有典型癥狀的病樣，裝入潔凈的自封袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室在15攝氏度下放置12h~24h，放置時(shí)間不大于48h，制備添加鏈霉素或孟加拉紅，鏈霉素終濃度為30 μ g/mL，孟加拉紅終濃度為33ug/mL的清水瓊脂；[0024]步驟二，在體視顯微鏡下觀察典型癥狀部位的真菌結(jié)構(gòu)，觀察真菌結(jié)構(gòu)還可以選擇直接剪取病斑在光學(xué)顯微鏡低倍視野下，找到優(yōu)勢(shì)類群并挑取孢子，轉(zhuǎn)移少量孢子到清水瓊脂小方塊上，然后用無(wú)菌的長(zhǎng)針灸針或用細(xì)長(zhǎng)的縫衣針制作的解剖針挑取單個(gè)孢子，按照單孢分離方法獲得粘有單個(gè)孢子的瓊脂塊3個(gè)~5個(gè)；
[0025]步驟三，將瓊脂塊轉(zhuǎn)移到添加抗細(xì)菌物質(zhì)的PDA上培養(yǎng)直到長(zhǎng)出菌落，得到一個(gè)確定形態(tài)的孢子對(duì)應(yīng)的相應(yīng)菌落，盡管不產(chǎn)孢，但這種孢子的培養(yǎng)物特征就明確了 ；
[0026]步驟四，然后將這種培養(yǎng)物接種驗(yàn)證，通過(guò)發(fā)病部位的病原形態(tài)+分子數(shù)據(jù)信息(如ITS序列)共同鑒定病原物的種類。
[0027]本發(fā)明的診斷程序?yàn)榘Y狀觀察，鏡檢病部，確定優(yōu)勢(shì)真菌，單孢子法分離，用單孢子對(duì)應(yīng)的菌落進(jìn)行致病性測(cè)定，完成柯赫法則，對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定，確定病害的真正病原菌。
[0028]結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明:
[0029]本發(fā)明的診斷程序:癥狀觀察一鏡檢病部，確定優(yōu)勢(shì)真菌一單孢子法分離一用單孢子對(duì)應(yīng)的菌落進(jìn)行致病性測(cè)定，完成柯赫法則一對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定一確定病害的真正病原菌；
[0030]1.試驗(yàn)方法
[0031]1.1培養(yǎng)基
[0032]PDA ；
[0033]1.2分離方法
[0034]組織塊分離法:參照方中達(dá)《植病研究法》(第三版)，單孢分離法:參照龔國(guó)淑等；
[0035]1.3致病性測(cè)定
[0036]用菌絲塊接種健康寄主葉片,將直徑5mm菌絲塊貼于葉片上，保濕24_48h，第3d起觀察致病反應(yīng)；
[0037]1.4病原真菌的鑒定
[0038]形態(tài)鑒定根據(jù)《植物病原真菌學(xué)》、《真菌鑒定手冊(cè)》等進(jìn)行，DNA提取用CTAB法，弓丨物為 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )和 ITS4 (5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )，PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序；
[0039]1.5供測(cè)病害獼猴桃褐斑病、大蒜葉枯病、玉米灰斑?。?br> [0040]實(shí)施例1，獼猴桃褐斑病，褐斑病主要為害幼嫩葉片，病斑圓形，暗褐色，邊緣有褪綠暈圈，在葉背形成大量灰黑色霉層，潮濕時(shí)正面也有，根據(jù)鏡檢情況，病部有很多棒狀的分生孢子，取其單孢培養(yǎng)獲得一種不產(chǎn)孢的藍(lán)灰色菌落，通過(guò)組織塊法分離，再經(jīng)純化后獲得多種真菌，有鏈格孢(Alternariaspp.)、青霉(PeniciIIiumspp.)、炭疽菌(Colletotrichumsp.)和不產(chǎn)孢的藍(lán)灰色菌落,兩種方法獲得的相同菌為一種不產(chǎn)孢的藍(lán)灰色菌落，將這幾種菌同時(shí)進(jìn)行致病性測(cè)定，只有那種不產(chǎn)孢的藍(lán)灰色菌落能引起相同癥狀，最終通過(guò)形態(tài)和分子特征，稱猴桃褐斑病的病原鑒定為Corynesporacassiicola,可見(jiàn)，用本發(fā)明的步驟能快速簡(jiǎn)便地找出目標(biāo)病原菌。
[0041]實(shí)施例2，大 蒜葉枯病，癥狀:主要發(fā)生在葉中上部，產(chǎn)生黃白色至灰白色，近圓形、梭形或不規(guī)則形病斑，邊緣常黃綠相嵌，潮濕時(shí)病部可形成大量的黑色霉?fàn)钗?，取病組織塊消毒后培養(yǎng)，在病部長(zhǎng)出一種灰白色絨毛狀菌落，但在一般PDA上不產(chǎn)孢，通過(guò)鏡檢，發(fā)現(xiàn)病部的優(yōu)勢(shì)菌是一種匍柄霉，通過(guò)挑取單孢培養(yǎng)獲得一種灰白色菌落，用常規(guī)的組織塊法分離，經(jīng)純化后得到鏈格孢(Alternariaspp.)、灰霉(Botrytissp.)、青霉(Penicilliumspp.)和一種不產(chǎn)孢菌(灰白色菌落)，這種不產(chǎn)孢菌為優(yōu)勢(shì)菌，與直接用單孢法獲得的菌一致，選用上述4種菌進(jìn)行致病性測(cè)定，只有那種不產(chǎn)孢菌能引起與原來(lái)相同的癥狀，雖然灰霉也能致病，但癥狀不同，并不是大蒜葉枯病的真正病原菌，從這兩種程序來(lái)看，都能找到病原菌，但后者需要測(cè)試多種分離物才能篩選出來(lái)，即使找到了，由于不產(chǎn)孢也不能與病部相應(yīng)的繁殖體聯(lián)系起來(lái)，要徹底鑒定該真菌還需要篩選大量的產(chǎn)孢培養(yǎng)基，許多事例中誘導(dǎo)產(chǎn)孢不成功，最終可能只好放棄了，或者誤診了，可見(jiàn)，用本發(fā)明的步驟能快速簡(jiǎn)便地找出目標(biāo)病原菌，最終通過(guò)形態(tài)和分子特征，大蒜葉枯病的病原鑒定為Stemphyliumsolani。
[0042]實(shí)施例3，玉米灰斑病，癥狀:主要在葉片上產(chǎn)生與葉脈平行的灰白色長(zhǎng)矩形條斑，且與葉脈平行的邊緣如直線一般規(guī)則，潮濕時(shí)葉片兩面尤其葉背病部有灰黑色霉層，通過(guò)常規(guī)病組織塊法分離，在培養(yǎng)基上長(zhǎng)有青霉(Penicilliumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)、鐮刀菌(Fusariumspp.)等，純化后用它們接種進(jìn)行致病性測(cè)定,均不能獲得相似的癥狀，采用本發(fā)明的程序，取病部的優(yōu)勢(shì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該菌很難人工培養(yǎng)，在PDA+玉米葉汁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)很慢，但用它測(cè)定致病性證明能產(chǎn)生原有的癥狀，由此表明，常規(guī)方法很難分離成功，因?yàn)樯L(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)常被其它腐生或附生菌快速將其覆蓋了，病原菌根本沒(méi)法長(zhǎng)出來(lái)，但本發(fā)明的程序能快速簡(jiǎn)便地確定其致病菌，最終通過(guò)形態(tài)和分子特征，玉米灰斑病的病原鑒定為Cercosporazeae-maydis。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),使用本發(fā)明還能快速獲得一些難培養(yǎng)真菌的純培養(yǎng)，以便開(kāi)展其它科學(xué)研究用。
[0043]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法，其特征在于，該人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法包括以下步驟: 步驟一，選擇用于獲得病原菌的材料，從田間采取具有典型癥狀的病樣，裝入潔凈的自封袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室在15°c下放置12h~24h，制備添加鏈霉素或孟加拉紅，鏈霉素終濃度為30 μ g/mL,孟加拉紅終濃度為33ug/mL的清水瓊脂； 步驟二，在體視顯微鏡下觀察典型癥狀部位的真菌結(jié)構(gòu)，找到優(yōu)勢(shì)類群并挑取孢子，轉(zhuǎn)移少量孢子到清水瓊脂小方塊上，然后用無(wú)菌的長(zhǎng)針灸針或用細(xì)長(zhǎng)的縫衣針制作的解剖針挑取單個(gè)孢子，按照單孢分離方法獲得粘有單個(gè)孢子的瓊脂塊3個(gè)~5個(gè)； 步驟三，將瓊脂塊轉(zhuǎn)移到添加抗細(xì)菌物質(zhì)的PDA上培養(yǎng)直到長(zhǎng)出菌落，得到一個(gè)確定形態(tài)的孢子對(duì)應(yīng)的相應(yīng)菌落； 步驟四，然后將培養(yǎng)物接種驗(yàn)證，通過(guò)發(fā)病部位的病原形態(tài)+分子數(shù)據(jù)信息(如ITS序列)共同鑒定病原物的種類。
2.如權(quán)利要求1所述的人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法，其特征在于，在步驟一中，放置時(shí)間不大于48h。
3.如權(quán)利要求1所述的人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法，其特征在于，在步驟二中，觀察真菌結(jié)構(gòu)還可以選擇直接剪取病斑在光學(xué)顯微鏡低倍視野下。
4.如權(quán)利要求1所述的人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法，其特征在于，該人工培養(yǎng)難產(chǎn)孢病原真菌病害的簡(jiǎn)易診斷方法的診斷程序?yàn)榘Y狀觀察，鏡檢病部，確定優(yōu)勢(shì)真菌，單孢子法分離，用單孢子對(duì)應(yīng)的菌落進(jìn)行致病性測(cè)定，完成柯赫法則，對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定，確定病害的真正病原菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103789217SQ201410027123
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】龔國(guó)淑, 周游, 張敏, 陳華保, 崔永亮, 孫小芳, 祁小波, 劉娜, 李沛利, 楊繼芝 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)