革蘭陽性菌實(shí)時熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種革蘭陽性菌的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，由革蘭陽性菌DNA抽提液、定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品、陰性對照品、說明書和盒體組成，其中定量PCR反應(yīng)液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物和革蘭陽性菌熒光探針。本發(fā)明以革蘭陽性菌16SrRNA基因?yàn)榘谢蜷_發(fā)的實(shí)時熒光定量PCR試劑盒，能簡便、快速、通用檢測所有革蘭陽性菌，并能對檢測結(jié)果陽性的革蘭陽性菌進(jìn)行準(zhǔn)確定量，提高了革蘭陽性菌鑒定檢測的通用性和敏感性，可為臨床所有革蘭陽性菌感染的早期診斷提供依據(jù)。
【專利說明】革蘭陽性菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及熒光定量PCR檢測試劑盒，具體涉及一種實(shí)時熒光定量PCR檢測患者血液、腦脊液、胸水、腹水等樣本中革蘭陽性菌的診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]革蘭陽性菌是社區(qū)和醫(yī)院感染的重要病原菌。近年來，革蘭陽性菌感染呈逐年增多趨勢，如院內(nèi)獲得性敗血癥等感染性疾病的病原菌中革蘭陽性菌逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。隨著抗生素廣泛、不合理的應(yīng)用，對多種抗生素耐藥的革蘭陽性菌也迅速增加，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)等。對革蘭陽性菌作出早期、準(zhǔn)確的檢測鑒定，能及時為臨床醫(yī)生提供可靠的病原學(xué)信息，對患者合理的抗菌治療、減少耐藥株的發(fā)生具有重要意義。目前臨床診斷革蘭陽性菌感染的方法包括血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白、血培養(yǎng)、病灶分泌物涂片及培養(yǎng)、病原菌抗原或抗體檢測等，但存在需時長、易污染、陽性率低、特異性差、不能定量等缺點(diǎn)，無法滿足臨床早期、快速、準(zhǔn)確診斷革蘭陽性菌感染的需要。
[0003]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction, PCR)技術(shù)，特別是近幾年興起的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)為病原微生物的檢測提供了新方向。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的基本原理是利用Taq酶的5’ -3’外切酶核酸活性，在普通PCR基礎(chǔ)上設(shè)計熒光雙標(biāo)記探針，兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)(R)和淬滅基團(tuán)(Q)；探針保持完整時R基團(tuán)的熒光信號被Q基團(tuán)抑制，一旦探針被切斷，Q基團(tuán)的抑制作用消失，R基團(tuán)的熒光信號就可被檢測到。該技術(shù)通過對熒光信號的檢測實(shí)現(xiàn)對PCR過程中產(chǎn)物量的實(shí)時監(jiān)測，并可精確計算初始模板量，除具有定量準(zhǔn)確、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)外，最大的優(yōu)勢是采用完全閉管檢測，省去了對PCR產(chǎn)物的后處理，避免了交叉污染。
[0004]細(xì)菌16S rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，該基因具有兩大特點(diǎn):⑴多拷貝:16S rRNA基因以3 — 7個拷貝的多拷貝形式存在于所有細(xì)菌染色體基因組中，使得對該基因的檢測具有較高的敏感性#)多信息:16S rRNA基因由可變區(qū)和保守區(qū)組成，保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，可變區(qū)可用于不同細(xì)菌的分型。目前幾乎所有病原菌的16S rRNA基因測序已經(jīng)完成，選擇16S rRNA基因作為細(xì)菌基因分類的靶序列正逐漸成為細(xì)菌鑒別、分類的金標(biāo)準(zhǔn)。
[0005]本發(fā)明基于上述研究背景，以革蘭陽性菌16S rRNA基因中的共同保守序列設(shè)計PCR擴(kuò)增引物和熒光探針，開發(fā)了能用于所有革蘭陽性菌檢測的實(shí)時熒光定量PCR試劑盒。該試劑盒不僅能針對性地檢測所有的革蘭陽性菌，而且能對感染的革蘭陽性菌進(jìn)行準(zhǔn)確定量，具有簡便、快捷、高效等特點(diǎn)，適用于臨床所有革蘭陽性菌感染的早期、快速診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種革蘭陽性菌 的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，由革蘭陽性菌DNA抽提液、定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品、陰性對照品、說明書和盒體組成，其中定量PCR反應(yīng)液含有PCR緩沖液、MgC12、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物和革蘭陽性菌熒光探針。
[0007]PCR擴(kuò)增弓丨物序列為:
[0008]上游擴(kuò)增引物(SEQID No:1):5’ -CAACGCGAAGAACCTTACC-3’ ；
[0009]下游擴(kuò)增引物(SEQID No:2):5’ -ACGTCATCCCCACCTTCC-3’。
[0010]突光探針和突光標(biāo)記物為:
[0011]革蘭陽性菌熒光探針(SEQID No:3):5’-FAM-TGACGACAACCATGCACCACC-BHQ-1-3’
0
[0012]標(biāo)準(zhǔn)品序列為(SEQID No:4):CAACGCGAAG AACCTTACCA MTCTTGACA TC CTTTGACAACTCTAGAGA TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGG TGC ATGGTTGTCG TCAGCTCGTGTCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AG CGCAACCC TTAAGCTTAG TTGCCATCAT TAAGTTGGGCACTCTAAGTT GACTGCC GGT GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGT。
[0013]革蘭陽性菌DNA抽提液含有10mmol/L Tr1-HCl、5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(pH7.6)和0.5%十二烷基硫酸鈉。
[0014]陽性對照品為金黃色葡萄球菌滅活DNA樣品，陰性對照品為無菌注射用水樣品。
[0015]本發(fā)明試劑 盒應(yīng)保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0016]本發(fā)明試劑盒使用方法:
[0017]每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照，標(biāo)準(zhǔn)品用無菌去離子水稀釋為IXlO2 -
1X IO9 拷貝 /ml。
[0018]革蘭陽性菌DNA的提取:采集新鮮全血Iml置枸櫞酸鈉抗凝的無菌真空采血管中，混勻后取全血50 μ I加等量DNA抽提液置100°C煮沸10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取5 μ I上清作為PCR模板。細(xì)菌培養(yǎng)液、腦脊液、胸水、腹水等樣本中革蘭陽性菌DNA的提取方法同上。
[0019]PCR擴(kuò)增檢測:在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每個PCR反應(yīng)體系總體積為50μ 1，其中包括45 μ I PCR反應(yīng)液和5μ I模板(提取的革蘭陽性菌DNA、標(biāo)準(zhǔn)品、陽性或陰性對照)。PCR反應(yīng)條件:94°C 5分鐘預(yù)變性，94°C 20秒一60°C 60秒，共40個循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序。
[0020]熒光定量結(jié)果報告:①檢測樣品的擴(kuò)增曲線無對數(shù)增長期或CT (thresholdcycle，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定域值所需的循環(huán)數(shù))值> 40為革蘭陽性菌陰性；②檢測樣品CT值< 35且擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)增長期為革蘭陽性菌陽性；③檢測樣品35< CT值< 40，需對樣品重新進(jìn)行DNA提取和PCR檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣品中的革蘭陽性菌數(shù)量(拷貝/ml)。
[0021]本發(fā)明以革蘭陽性菌16S rRNA基因?yàn)榘谢蜷_發(fā)的實(shí)時熒光定量PCR試劑盒，能簡便、快速、通用檢測所有革蘭陽性菌，并能對檢測結(jié)果陽性的革蘭陽性菌進(jìn)行準(zhǔn)確定量，提高了革蘭陽性菌鑒定檢測的通用性和敏感性，可為臨床所有革蘭陽性菌感染的早期診斷提供依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。[0023]圖2為標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌片段序列。
【具體實(shí)施方式】
[0024]本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0025]實(shí)施例1
[0026]參見圖1，本發(fā)明提供的革蘭陽性菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，由革蘭陽性菌DNA抽提液(I)、定量PCR反應(yīng)液(2)、標(biāo)準(zhǔn)品(3)、陽性對照品(4)、陰性對照品(5)、說明書
(6)和盒體(7)組成，定量PCR反應(yīng)液單管分裝，矩陣排列。
[0027]其中定量PCR反應(yīng)液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物和革蘭陽性菌熒光探針。
[0028]PCR擴(kuò)增弓丨物序列為:
[0029]上游擴(kuò)增引物(SEQID No:1):5’ -CAACGCGAAGAACCTTACC-3’ ；
[0030]下游擴(kuò)增引物(SEQID No:2):5’ -ACGTCATCCCCACCTTCC-3’。
[0031]突光探針和突光標(biāo)記物為:
[0032]革蘭陽性菌熒光探針(SEQID No:3):5’-FAM-TGACGACAACCATGCACCACC-BHQ-1-3’
O
[0033]標(biāo)準(zhǔn)品序列為(SEQID No:4):CAACGCGAAG AACCTTACCA MTCTTGACA TC CTTTGACAACTCTAGAGA TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGG TGC ATGGTTGTCG TCAGCTCGTGTCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AG CGCAACCC TTAAGCTTAG TTGCCATCAT TAAGTTGGGCACTCTAAGTT GACTGCC GGT GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGT。
[0034]革蘭陽性菌DNA抽提液含有l(wèi)Ommol/L Tr1-HCl、5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(pH7.6)和0.5%十二烷基硫酸鈉。
[0035]陽性對照品為金黃色葡萄球菌滅活DNA樣品，陰性對照品為無菌注射用水樣品。
[0036]本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0037]實(shí)施例2革蘭陽性菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒檢測臨床常見革蘭陽性菌分離培養(yǎng)株
[0038](一)材料:
[0039]選擇病原微生物包括:實(shí)驗(yàn)組:臨床引起敗血癥和化膿性腦膜炎的常見革蘭陽性菌5個菌屬25個菌株；對照組:臨床引起敗血癥和化膿性腦膜炎的常見革蘭陰性菌17個菌屬25個菌株、人巨細(xì)胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、新型隱球菌、白色念珠菌和人類基因組DNA。以上材料均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院細(xì)菌室和感染實(shí)驗(yàn)室提供。
[0040](二)引物及探針的設(shè)計與合成:
[0041]從GenBank中篩選不同革蘭陽性菌的16S rRNA基因序列，應(yīng)用MegAlign軟件分析這些序列，尋找不同革蘭陽性菌種屬間的保守片段，分析生物進(jìn)化樹的規(guī)律，在革蘭陽性菌保守區(qū)域篩選通用引物和通用探針，委托上海生工生物有限公司合成。
[0042]上游擴(kuò)增引物序列為:5，-CAACGCGAAGAACCTTACC-3’；
[0043]下游擴(kuò)增引物序列為:5，-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’；
[0044]革蘭陽性菌熒光探針序列為:5’-FAM-TGACGACAACCATGCACCACC-BHQ-1-3’。[0045](三)檢測標(biāo)準(zhǔn)品的制備:
[0046]用上述引物擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌，PCR產(chǎn)物長度為229bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)鑒定和純化后用克隆系統(tǒng)插入PGEM-T-Easy克隆載體，抽提重組克隆質(zhì)粒，用載體引物M13R對重組的陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證、測定濃度并換算成拷貝數(shù)/體積。
[0047]結(jié)果:經(jīng)測序，上述設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)品完全與預(yù)期相符，標(biāo)準(zhǔn)品片段序列為金黃色葡萄球菌，參見圖2。
[0048](四)臨床常見革蘭陽性菌分離培養(yǎng)株的實(shí)時熒光定量PCR檢測:
[0049]對實(shí)驗(yàn)組25株革蘭陽性菌臨床分離培養(yǎng)株進(jìn)行單管實(shí)時熒光定量PCR檢測，結(jié)果均為陽性，CT值在14 - 23之間(參見表1);對照組25株革蘭陰性菌臨床分離培養(yǎng)株、人巨細(xì)胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、新型隱球菌、白色念珠菌和人類基因組DNA檢測結(jié)果均為陰性(參見表2)。
[0050]表1革蘭陽性菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒檢測常見革蘭陽性菌結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種革蘭陽性菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，由革蘭陽性菌DNA抽提液(I)、定量PCR反應(yīng)液(2)、標(biāo)準(zhǔn)品(3)、陽性對照品(4)、陰性對照品(5)、說明書(6)和盒體(7)組成，定量PCR反應(yīng)液單管分裝，矩陣排列，其中定量PCR反應(yīng)液含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物和革蘭陽性菌熒光探針； PCR擴(kuò)增引物序列為: 上游擴(kuò)增引物:5’ -CAACGCGAAGAACCTTACC-3’ ； 下游擴(kuò)增引物:5，-ACGTCATCCCCACCTTCC-3，； 革蘭陽性菌熒光探針:5’ -FAM-TGACGACAACCATGCACCACC-BHQ-1-3’ ； 標(biāo)準(zhǔn)品序列為:CAACGCGAAG AACCTTACCA AATCTTGACA TCCTTTGACA ACTCTAGAGATAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC TTAAGCTTAG TTGCCATCAT TAAGTTGGGC ACTCTAAGTTGACTGCCGGT GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種革蘭陽性菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，革蘭陽性菌DNA抽提液含有10mmol/L Tr1-HCl, pH 7.6的5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和.0.5%十二烷基硫酸納。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種革蘭陽性菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，陽性對照品為金黃色葡萄球菌滅活DNA樣品，陰性對照品為無菌注射用水樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種革蘭陽性菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789426SQ201410027285
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】杜立中, 尚世強(qiáng), 舒強(qiáng), 陶然, 李偉 申請人:浙江大學(xué)