一種與人類胎兒生長受限發(fā)生相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與人類胎兒生長受限發(fā)生相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p中的多種。該標(biāo)志物對(duì)胎兒生長受限具有特異性和敏感性，可用于制備胎兒生長受限診斷或監(jiān)測(cè)的試劑，可反復(fù)檢測(cè)，且易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)胎兒生長受限的程度。
【專利說明】一種與人類胎兒生長受限發(fā)生相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物及其應(yīng)用
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于基因工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及與人類胎兒生長受限發(fā)生相關(guān)的血清微小核糖核酸(microRNA, miRNA)標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]胎兒生長受限(fetal growth restriction, FGR)是指胎兒出生體重低于同孕齡平均體重的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，或低于同齡正常體重的第10百分位數(shù)。FGR是圍生期的重要并發(fā)癥，居圍生兒死亡原因第2位，其圍生兒死亡率為正常兒的6-10倍，在死亡中約占圍生兒的30%，產(chǎn)時(shí)宮內(nèi)缺氧圍生兒中50%為FGR，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國的發(fā)病率平均為6.39%。FGR會(huì)引起新生兒呼吸困難、紅細(xì)胞增多癥、低血糖、腦室出血、低溫等并發(fā)癥。FGR不僅直接影響胎兒的發(fā)育，遠(yuǎn)期也影響兒童期及青春期的體能與智能發(fā)育，以及增加成人對(duì)冠心病、2型糖尿病、高血壓等心血管疾病和代謝性疾病的易感性。
[0003]FGR的病因迄今尚未完全闡明，其發(fā)生與孕婦、胎兒因素、胎盤、環(huán)境等多方面的因素密切相關(guān)。明確FGR的病因?qū)υ缙谠\斷和治療有重要的作用。30%~40%的FGR發(fā)生于孕母有各種疾患及妊娠合并癥者，如子癇前期、妊娠合并高血壓或高血壓合并妊娠、妊娠期糖尿病等，此外母體血管疾病和血栓形成會(huì)導(dǎo)致子宮胎盤灌注不足而引起胎兒生長受限。10%由于多胎，多胎加重了子宮胎盤動(dòng)脈的壓力。10%由于胎兒?jiǎn)栴}一感染或畸形，約有40%發(fā)生于正常妊娠，其發(fā)病原因迄今仍未闡明，稱為“特發(fā)性胎兒生長受限”。
[0004]有時(shí)即便孕婦和胎兒均無異常因素，胎盤及其附屬物的變化亦可導(dǎo)致FGR。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞參與激活代謝、產(chǎn)生激素、吸收營養(yǎng)和排除代謝廢物等，廣泛的證據(jù)表明在FGR的發(fā)生中胎盤功能不足。導(dǎo)致胎兒生長受限的最主`要最直接的原因是胎盤發(fā)育異常及循環(huán)功能障礙，造成胎兒營養(yǎng)物質(zhì)供給和利用障礙。研究發(fā)現(xiàn)不同的胎盤因素參與疾病的發(fā)生，如解剖、血管、染色體和/或形態(tài)異常等。FGR組與正常對(duì)照組相比，胎盤絨毛數(shù)目、絨毛血管數(shù)目、胎盤體重和胎兒-胎盤重量比均明顯下降。增厚的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞基底膜、絨毛梗死的發(fā)病率、血栓形成和血腫的存在和發(fā)生在FGR組中較常見。子宮-胎盤血管、胎兒-胎盤血管重構(gòu)異常也發(fā)生于FGR。絨毛血管的生成障礙導(dǎo)致胎兒與母體間血運(yùn)減少、營養(yǎng)物質(zhì)的輸送能力下降。同時(shí)絨毛間隙纖維素沉積可導(dǎo)致絨毛間血流減少，合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜表面的Na(+)/K(+)ATPase活性明顯降低，導(dǎo)致Na(+)_偶聯(lián)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能削弱，母胎間的交換面積和效率均降低。已知許多生長因子，包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PIGF)、轉(zhuǎn)化生長因子P (TGF P )、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等在絨毛細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，經(jīng)其受體在局部起作用，控制胎盤血管的生成、遷移、入侵等能力。此外，MMP-9是滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的有效水解酶，選擇性水解子宮內(nèi)膜成分及基底膜，在胎盤的植入中發(fā)揮重要作用，其分泌的減少使滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮肌層的浸潤和螺旋動(dòng)脈的形成發(fā)生變化，限制胎盤血供，使絨毛間隙含氧量減少，造成絨毛細(xì)胞缺氧。但是FGR的病因迄今尚未完全闡明。
[0005]微小核糖核酸(microRNA,即miRNA)是近年剛剛興起的研究熱點(diǎn)，它是一類長約19-25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，多位于基因組非編碼區(qū)。它在生物進(jìn)化過程中高度保守，在細(xì)胞中具有時(shí)空特異性表達(dá)模式，可在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，并與動(dòng)物的許多正常生理活動(dòng)，同時(shí)也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。這些小分子RNA是從60~200nt的具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的前體中被切割出來而成熟，在動(dòng)物細(xì)胞中，miRNA的轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物(pr1-miRNA)很快被一種核糖核酸酶III Drosha加工成miRNA前體(pre-miRNA)，然后由細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)另一種核糖核酸酶III Dicer識(shí)別剪切為成熟miRNA。隨后，這個(gè)單鏈與輔酶因子TRBP及PACT形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，再與mRNA的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)結(jié)合，從而發(fā)揮其調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白翻譯的總開關(guān)作用。miRNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象是通過直接切割或阻礙基因的轉(zhuǎn)錄。多數(shù)的miRNA與一個(gè)特定的mRNA不是完全互補(bǔ)的，因此相同的mi RNA可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因。另外，不同的mi RNAs也可以靶向調(diào)控相同的mRNA，并且有相似的生物學(xué)功能。大約30%的人類基因表達(dá)可能受miRNAs調(diào)控。第一個(gè)ncRNA于1965年在面包酵母中被發(fā)現(xiàn)，但是它的生理功能直到1993年才被認(rèn)識(shí)，在線蟲體內(nèi)時(shí)序性調(diào)控生長發(fā)育，所以叫做“小時(shí)空RNA”。直到20世紀(jì)初,才被稱為miRNA，它在細(xì)胞內(nèi)的RNA干擾機(jī)制開始被認(rèn)識(shí)。最近的十幾年，在人類中已發(fā)現(xiàn)了1000多種miRNAs，作為21世紀(jì)生命科學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究顯示，其參與的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞胞增殖、分化、代謝和凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。目前，已發(fā)現(xiàn)血清miRNA可作為多種腫瘤發(fā)生與預(yù)后的良好生物標(biāo)志物。
[0006]最新的研究成果發(fā)現(xiàn)血清中存在數(shù)百種的miRNA，性質(zhì)穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測(cè)，且存在顯著的疾病特異性，在肺癌、乳腺癌中已經(jīng)證實(shí)血清miRNA的表達(dá)譜可作為早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。這一發(fā)現(xiàn)令人振奮，血清miRNA作為一類非編碼調(diào)節(jié)性的小分子RNA有可能取代傳統(tǒng)的特異蛋白為代表的生物標(biāo)志物，開拓了生物標(biāo)志物的新境界。該研究迅速引起國際媒體的廣泛關(guān)注，路透社、合眾社、《科學(xué)的美國人》、美國《技術(shù)評(píng)論》等都對(duì)該研究成果進(jìn)行了專門報(bào)道，《Nature》雜志也在其網(wǎng)站首頁的“最新研究進(jìn)展”專欄中展示了這一最新研究進(jìn)展。然而孕婦血清中miRNA在胎兒生長受限早期診斷監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用還未得到相應(yīng)的關(guān)注，若能發(fā)現(xiàn)與胎兒生長受限發(fā)病相關(guān)的特異且穩(wěn)定的血清miRNA作為生物標(biāo)志物，并研發(fā)相應(yīng)疾病的`診斷、監(jiān)測(cè)試劑盒，不僅能創(chuàng)造令人矚目的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)我國胎兒生長受限的防治也將是一次強(qiáng)有力的推動(dòng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供與人類胎兒生長受限發(fā)生相關(guān)的血清microRNA標(biāo)志物。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述血清microRNA標(biāo)志物的引物。
[0009]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供含有上述血清microRNA標(biāo)志物或其引物的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供含有上述血清microRNA標(biāo)志物的引物的用于人類胎兒生長受限診斷或監(jiān)測(cè)的試劑盒。
[0011]本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的:
[0012]與人類胎兒生長受限相關(guān)的血清microRNA標(biāo)志物，選自hsaniR-lOa、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p、hsa-miR-675_5p 中的多種。
[0013]所述的血清microRNA 標(biāo)志物由 hsa-miR-lOa、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p 和 hsa-miR-675_5p 構(gòu)成。所述的血清 microRNA標(biāo)志物，其中 hsa-miR-lOa 的序列為 uacccuguagauccgaauuugug (SEQ ID N0.1),hsa_miR-320b 的序列為 aaaagcuggguugagagggcaa (SEQ ID N0.2), hsa-miR-409_3p的序列為 gaauguugcucggugaaccccu (SEQ ID N0.3), hsa-miR-483_3p 的序列為 ucacuccucuccucccgucuu (SEQ ID N0.4), hsa-miR-675_5p 的序列為uggugcggagagggcccacagug (SEQ ID N0.5)。
[0014]所述的血清microRNA標(biāo)志物的引物，其中序列為SEQ ID N0.1的標(biāo)志物的上游引物為SEQ ID N0.6，下游引物為SEQ ID N0.7 ;序列為SEQ ID N0.2的標(biāo)志物的上游引物為SEQ ID N0.8，下游引物為SEQ ID N0.9 ;序列為SEQ ID N0.3的標(biāo)志物的上游引物為SEQ ID N0.10，下游引物為SEQ ID N0.11 ;序列為SEQ ID N0.4的標(biāo)志物的上游引物為SEQID N0.12，下游引物為SEQ ID N0.13 ;序列為SEQ ID N0.5的標(biāo)志物的上游引物為SEQ IDN0.14，下游引物為 SEQ ID N0.15。
[0015]所述的血清microRNA標(biāo)志物或其引物在制備胎兒生長受限診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。所述試劑是能夠測(cè)定這些血清microRNA標(biāo)志物在血清中表達(dá)量的試劑。
[0016]一種人類胎兒生長受限診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，該試劑盒含有上述血清microRNA標(biāo)志物(hsa-miR-10a、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p 和 hsa-miR-675_5p中的多種)的引物。
[0017]所述的診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，該試劑盒含有上述引物(SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.1,SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11，SEQ ID N0.12 和 SEQ IDN0.13，SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.15)中的多對(duì)。
[0018]所述的診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，該試劑盒含有下列5對(duì)引物SEQ ID N0.6和SEQ IDN0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11，SEQ ID N0.12 和 SEQID N0.13，SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.15。
[0019]試劑盒中除引物外的其他試劑可采用現(xiàn)有技術(shù)中相應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的常用試劑。
[0020]本發(fā)明詳細(xì)描述如下:
[0021]本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人群基礎(chǔ)信息和臨床資料，并采用了 RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array,Real-time PCRCTaqMan探針和染料法)方法的一種或幾種進(jìn)行檢測(cè)。
[0022]具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分:
[0023]一、研究對(duì)象選擇和分組依據(jù)
[0024]A組:健康對(duì)照組(n=80，10人芯片篩選，30人一期驗(yàn)證，40人獨(dú)立人群驗(yàn)證)，無其
他全身性重大疾病。
[0025]B組:胎兒生長受限組(n=80，10人芯片篩選，30人一期驗(yàn)證，40人獨(dú)立人群驗(yàn)證)，無其他全身性重大疾病。
[0026]二、血液血清分離及miRNA提取
[0027](I)新鮮肝素抗凝血5ml于離心機(jī)3000g離心5min,取上清每100 V-1分裝至潔凈1.5ml EP 管中；
[0028](2)加入60iU裂解液，漩渦震蕩5s，室溫靜置3min ；
[0029](3)加入20 u I蛋白液，漩渦震蕩5s，室溫靜置lmin，IlOOOg離心3min ；
[0030](4)取上清至新的2ml收集管，加入270 U I異丙醇，漩渦震蕩5s ；[0031](5)將microRNA離心柱放在收集管中，將步驟4的液體加入離心柱中，室溫靜置2min, IlOOOg離心30s，倒掉收集管中液體，將離心柱放回收集管；
[0032](6)加入IOOii I洗脫液I至microRNA離心柱，IlOOOg離心30s，倒掉收集管中液體，將離心柱放回收集管；
[0033](7)加入700 ii I洗脫液2至microRNA離心柱，IlOOOg離心30s，倒掉收集管中液體，將離心柱放回收集管；
[0034](8)加入 250 V-1 洗脫液 2 至 microRNA 離心柱，IlOOOg 離心 2min ；
[0035](9)將microRNA離心柱放置在新的1.5ml收集管中，加入25 U I去核糖核酸酶水至microRNA離心柱膜上,室溫靜置lmin, IlOOOg離心Imin ；
[0036](10)重復(fù)步驟9 一次，_70°C保存收集管中的樣本。
[0037]本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用的離心柱和配套試劑(裂解液、蛋白液、洗脫液I和洗脫液2)均來自 Exiqon mi RCURY RNA isolation kit (貨號(hào) 300112)試劑盒,下同。
[0038]三、Real-time PCR方法測(cè)量血清miRNAs表達(dá)量
[0039]1.取經(jīng)前處理的血清，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品。
[0040]按下表所示配制反轉(zhuǎn)錄體系:
[0041]
【權(quán)利要求】
1.人類胎兒生長受限相關(guān)的血清microRNA標(biāo)志物,選自hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p、hsa-miR-675_5p 中的多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清microRNA標(biāo)志物，其特征在于由hsa_miR-10a、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p 和 hsa-miR-675_5p 構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的血清microRNA標(biāo)志物,其特征在于hsa_miR-10a的序列為 SEQ ID N0.1，hsa-miR-320b 的序列為 SEQ ID N0.2，hsa-miR-409_3p 的序列為 SEQ IDN0.3，hsa-miR-483-3p 的序列為 SEQ ID N0.4，hsa-miR-675_5p 的序列為 SEQ ID N0.5。
4.權(quán)利要求3所述的血清microRNA標(biāo)志物的引物，其特征在于序列為SEQID N0.1的標(biāo)志物的上游引物為SEQ ID N0.6，下游引物為SEQ ID N0.7 ;序列為SEQ ID N0.2的標(biāo)志物的上游引物為SEQ ID N0.8，下游引物為SEQ ID N0.9 ;序列為SEQ ID N0.3的標(biāo)志物的上游引物為SEQ ID N0.10，下游引物為SEQ ID N0.11 ;序列為SEQ ID N0.4的標(biāo)志物的上游引物為SEQ ID N0.12，下游引物為SEQ ID N0.13 ;序列為SEQ ID N0.5的標(biāo)志物的上游引物為SEQ ID N0.14，下游引物為SEQ ID N0.15。
5.權(quán)利要求1或2所述的血清microRNA標(biāo)志物在制備人類胎兒生長受限輔助診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述的引物在制備人類胎兒生長受限輔助診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。
7.一種人類胎兒生長受限輔助診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求1或2所述的血清microRNA標(biāo)志物的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的輔助診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求4所述引物中的多對(duì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的輔助診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有引物SEQID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11，SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.1`3，以及 SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.15。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103757017SQ201410028086
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】吳煒, 湯秋勤, 丁虹娟, 陳敏, 夏彥愷, 陸春城, 王心如 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)