一株重組大腸桿菌及其在制備抗o157:h7的n-糖蛋白疫苗中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株重組大腸桿菌，命名為重組大腸桿菌CBEB，是將構(gòu)建的重組質(zhì)粒p-pglB-malEM和p-rfb共轉(zhuǎn)化大腸桿菌CLM24中獲得，其基因型是W3110?Δwaal/p-pglB-malEM+p-rfb。利用本發(fā)明所述重組大腸桿菌發(fā)酵制備抗O157:H7?N-糖蛋白疫苗，生產(chǎn)步驟簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，可以應(yīng)用于抗O157:H7?N-糖蛋白疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)；且本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗O157:H7?N-糖蛋白疫苗具有良好的免疫效果，為抗細(xì)菌感染的免疫治療提供了新的選擇，提示具有良好的工業(yè)開發(fā)和應(yīng)用前景。
【專利說明】一株重組大腸桿菌及其在制備抗0157: H7的N-糖蛋白疫苗中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株重組大腸桿菌及構(gòu)建方法以及該重組菌株在生產(chǎn)抗大腸桿菌0157:H7N-糖蛋白疫苗中的應(yīng)用。屬于生物技術(shù)、基因工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]腸出血性大腸桿菌0157:H7在臨床感染中常常引起血樣腹瀉、貧血和腎衰竭，常常危及患者生命。我國已分離出大腸桿菌0157: H7，表明我國也有該病爆發(fā)流行的潛在危險性，應(yīng)引起足夠重視。我國已將腸出血性大腸桿菌列為21世紀(jì)可能對國人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一，僅次于艾滋病病毒(HIV),排列第二。由于米用抗生素療法能夠?qū)е麓竽c桿菌0157:H7的細(xì)胞壁溶解，促進細(xì)胞毒素的釋放，從而加重病程。目前在臨床中針對大腸桿菌0157:H7感染的治療以預(yù)防和保守療法為主。
[0003]糖蛋白疫苗被認(rèn)為是最有效和最安全的抗病原菌疫苗之一，具有廣闊應(yīng)用前景。糖蛋白疫苗通過將細(xì)菌多糖如O抗原或莢膜多糖連接到具有免疫原性的載體蛋白上，此糖蛋白能引發(fā)依賴于T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，可以給予兒童以抵抗細(xì)菌感染并且也可以給成年人提供長時間持續(xù)的免疫應(yīng)答。
[0004]目前，合成糖蛋白疫苗的方法主要是化學(xué)法。即通過基因工程技術(shù)表達和純化載體蛋白，然后同提純的病原菌表面多糖進行化學(xué)耦聯(lián)。但是由于糖鏈化學(xué)激活的隨機性，交聯(lián)產(chǎn)生的糖蛋白具有高度不均一性；同時，此方法還存在著步驟繁雜、操作困難等問題?；诖?，急待建立和開發(fā)新的可以大幅降低生產(chǎn)成本的糖蛋白疫苗生產(chǎn)方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有方法的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株重組大腸桿菌及其在制備抗0157:H7的N-糖蛋白疫苗中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案基于空腸彎曲菌N-連接糖基化途徑同大腸桿菌脂多糖合成途徑相似的特點，采用在大腸桿菌中表達來源于大腸桿菌中的rfb基因簇(0157:H7rfb基因簇:G1: 3435170)，并過量表達來源于大腸桿菌中的malE基因(來源NEB公司的質(zhì)粒pMAL-p5X)突變體和來源于空腸彎曲菌的pglB基因(PglB NCBI_GeneID:905417)，在改良TB培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)抗0157:H7的N-糖蛋白。
[0007]本發(fā)明所述的重組大腸桿菌命名為重組大腸桿菌CBEB，其特征在于:所述重組大腸桿菌由如下方法制得:構(gòu)建含malEM和pglB基因的共表達載體p-pglB-malEM,再構(gòu)建含rfb基因簇的表達載體p-rfb,然后將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒p-pglB_malEM和p-rfb共轉(zhuǎn)化大腸桿菌CLM24中，得到能同時表達pglB、malEM基因和rfb基因簇的重組大腸桿菌CBEB，其基因型是 W3110 Δ waal/p-pglB-malEM+p-rfb ；
[0008]其中，所述malEM來源于質(zhì)粒pMAL_p5X，所述pglB基因來源于空腸彎曲桿菌NCTCl 1168，共表達malEM和pglB基因的載體為pBAD24 ;所述rfb基因簇來源于大腸桿菌0157:H7 ;表達rfb基因簇的載體為pYESIL ；
[0009]上述malEM為malE基因突變體，是通過在malE基因的3’末端插入一段核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不的表達糖基化序列的基因所得；
[0010]上述大腸桿菌CLM24是通過敲除出發(fā)菌株大腸桿菌W3110的waal基因而構(gòu)建的大腸桿菌工程菌，其基因型為W3110Araal，命名為大腸桿菌CLM24。
[0011 ] 上述重組大腸桿菌CBEB的構(gòu)建方法概述:
[0012]l.waal基因的敲除
[0013]基本方法是通過Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌E.coli W3110中敲除基因waal (寡糖基轉(zhuǎn)移酶)。所得缺失waal基因的大腸桿菌E.coli W3110 AraaI命名為CLM24。
[0014]上述Red重組系統(tǒng)，是通過質(zhì)粒pSM19表達λ噬菌體重組酶Gam、Bet和Εχο，通過設(shè)計帶有同源臂的引物擴增帶有篩選標(biāo)記的kan (卡那霉素抗性基因)的重組片段。然后通過電穿孔儀電擊，將重組片段轉(zhuǎn)入表達λ噬菌體重組酶Gam、Bet和Exo的大腸桿菌中，重組片段在重組酶的作用下與基因組上的目的基因發(fā)生重組，從而將原有的基因置換下來，而抗性基因通過表達FLP內(nèi)切酶，從基因組上切除掉。
[0015]2.rfb基因簇的表達載體的構(gòu)建
[0016]基本方法是以大腸桿菌0157:H7基因組為模板，克隆rfb基因簇，將所獲得的rfb基因簇插入到線性質(zhì)粒PYESlL中，從而獲得rfb基因簇的表達載體p-rfb。
[0017]3.malEM和pglB基因的共表`達載體的構(gòu)建
[0018]基本方法是以空腸彎曲菌基因組為模板，克隆pglB基因，將所克隆獲得的pglB插入質(zhì)粒PBAD24中，從而獲得pglB的表達載體p-pglB ；以質(zhì)粒pMAL_p5X為模板，克隆malEM基因，將所克隆獲得的malEM插入質(zhì)粒p-pglB中，從而獲得malEM和pglB的共表達載體p-pglB_malEM0
[0019]4.N-糖蛋白發(fā)酵重組菌株的構(gòu)建
[0020]基本方法是將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒p-pglB和p-pglB_malEM共轉(zhuǎn)化大腸桿菌CLM24中，從而獲得表達rfb基因簇，過量表達malEM和pglB的重組大腸桿菌CBEB。
[0021 ] 本發(fā)明所述重組大腸桿菌在制備抗大腸桿菌0157: H7的N-糖蛋白疫苗中的應(yīng)用。
[0022]進一步的，具體的制備抗大腸桿菌0157:H7的N-糖蛋白疫苗方法是:
[0023]1.搖瓶培養(yǎng)
[0024]挑取所構(gòu)建的重組菌株CBEB單菌落至裝有3-5mL的改良TB培養(yǎng)基的25mL的三角瓶中，氨芐青霉素終濃度為100 μ g/mL，壯觀霉素終濃度為50μ g/mL，37°C，200-225r/min，培養(yǎng)12h。
[0025]將過夜培養(yǎng)的菌液按照0.5-3% (v/v)的接種量接入裝有50mL改良TB培養(yǎng)基的IOOmL的三角瓶中，氨芐青霉素終濃度為100 μ g/mL，壯觀霉素終濃度為50 μ g/mL，37°C，200-225r/min。
[0026]待菌液OD6qq=0.4-0.6時，按照0.5-3% (v/v)的接種量接入裝有IL改良TB培養(yǎng)基的3L的三角瓶中，氨芐青霉素終濃度為100 μ g/mL，壯觀霉素終濃度為50 μ g/mL，37°C，200-225r/min。
[0027]待菌液OD6qq=0.6-0.8時，加入終濃度為0.2 % (v/v)的L-阿拉伯糖，16-37°C,200-225r/min。[0028]上述加入L-阿拉伯糖后，發(fā)酵溫度優(yōu)選28°C。
[0029]待4_6h后，補加一次終濃度為0.2% (v/v)的L-阿拉伯糖，16-37°C，200_225r/min，繼續(xù)培養(yǎng)14-16小時。
[0030]上述優(yōu)選6h再次加入L-阿拉伯糖，發(fā)酵溫度優(yōu)選28°C，繼續(xù)培養(yǎng)14h。
[0031]2.N-糖蛋白純化
[0032]將搖瓶發(fā)酵的菌液10，000-12，000r/min離心5-10min。離心所得沉淀用lmg/ml溶菌酶4°C處理lh。10，000-12，000r/min離心5_10min，用親和鎳柱純化，收集N-糖蛋白的洗脫液，超濾脫鹽。
[0033]其中，搖瓶發(fā)酵中N-糖蛋白的產(chǎn)量為3mg/L。
[0034]本發(fā)明公開的重組大腸桿菌及其在制備抗0157:H7的N-糖蛋白疫苗中的應(yīng)用具有非常重要的應(yīng)用價值。
[0035]利用本發(fā)明提供的重組大腸桿菌發(fā)酵制備抗0157:H7N-糖蛋白疫苗，生產(chǎn)步驟簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，可以應(yīng)用于抗0157:H7N-糖蛋白疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)；同時，本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗0157:H7N-糖蛋白疫苗具有良好的免疫效果，為抗細(xì)菌感染的免疫治療提供了新的選擇， 提示具有良好的工業(yè)開發(fā)和應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1.糖蛋白疫苗一步發(fā)酵生產(chǎn)方法原理示意圖。
[0037]圖2.基因敲除原理步驟示意圖及waal基因敲除瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0038]圖3.p-rfb表達載體圖譜。
[0039]圖4.p-pglB-malEM表達載體圖譜。
[0040]圖5.SDS-PAGE分析MBP糖基化。MBP為malEM基因表達的蛋白，MBP-PS為糖基化的 MBP。
[0041]圖6.Western blot分析MBP糖基化。泳道I為MBP，泳道2為MBP-PS。
[0042]圖7.MALD1-T0F 分析 MBP 糖基化。
[0043]圖8.小鼠血清抗0157的IgG抗體ELISA檢測。
[0044]圖9.小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4的ELISA檢測。
【具體實施方式】
[0045]—般性說明:如下實施例所涉及的酶均購自Thermo公司，質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收DNA片段試劑盒購自天根公司，操作完全按照相應(yīng)說明書進行。質(zhì)粒構(gòu)建中基因測序由華大基因公司完成。質(zhì)粒pYESIL來源于invitrogen公司；質(zhì)粒pBAD24和出發(fā)菌大腸桿菌W3110來源于ATCC(美國典型菌種保藏中心)；DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自全式金生物技術(shù)有限公司。4-6周齡Balb/C雌性小鼠，購于山東大學(xué)新藥評定中心。細(xì)胞因子測定ELISA試劑盒購自深圳達可為有限公司。實施例中的其他實驗方法及試劑如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法與市售試劑。
[0046]所述LB培養(yǎng)基為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L。
[0047]所述SOC 培養(yǎng)基為:蛋白胨 2g/L，酵母粉 0.5g/L，NaCl0.0585g/L, KC10.0186g/L,MgCl20.203g/L, MgSO40.246g/L，葡萄糖 20mmol/L。[0048]所述改良TB培養(yǎng)基為:蛋白胨10_20g/L，酵母粉5_30g/L，甘油1-lOml/L，NaC15-10g/L。
[0049]實施例1、大腸桿菌W3110waal基因的敲除
[0050](I)同源片段的克隆
[0051]利用Red重組系統(tǒng)對目的基因進行敲除。根據(jù)Genbank公布的waal基因序列設(shè)計引物:
[0052]pKD-waal F:
[0053]5，-TTGGAAAAGTTATCATCATTATAAAGGTAAAACATGCTAACATCCTTTAAACTTCATTCATTGAAACCTTACACTCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
[0054]pKD-waal R:
[0055]5，-GAGTTTTAACTCACTTCTTAAACTTGTTTATTCTTAATTAATTGTATTGTTACGATTATTAATGACGAGTAAGAGGACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3，
[0056]以PKD4通過PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴增獲得帶有卡那霉素抗性的重組片段。PCR反應(yīng)體系如下:(引物濃度為20 μ mol/L)
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一株重組大腸桿菌，該菌命名為重組大腸桿菌CBEB，其特征在于:所述重組大腸桿菌由如下方法制得:構(gòu)建含malEM和pglB基因的共表達載體p-pglB-malEM,再構(gòu)建含rfb基因簇的表達載體p-rfb,然后將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒p-pglB-malEM和ρ-rfb共轉(zhuǎn)化大腸桿菌CLM24中，得到能同時表達pglB、malEM基因和rfb基因簇的重組大腸桿菌CBEB，其基因型是 W3110 Δ waal/p-pglB-malEM+p-rfb ； 其中，所述malEM來源于質(zhì)粒pMAL-p5X，所述pglB基因來源于空腸彎曲桿菌NCTCl 1168，共表達malEM和pglB基因的載體為pBAD24 ;所述rfb基因簇來源于大腸桿菌0157:H7 ;表達rfb基因簇的載體為pYESIL ; 上述malEM為malE基因突變體，是通過在malE基因的3’末端插入一段核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不的表達糖基化序列的基因所得； 上述大腸桿菌CLM24是通過敲除出發(fā)菌株大腸桿菌W3110的waal基因而構(gòu)建的大腸桿菌工程菌，其基因型為W3110Araal，命名為大腸桿菌CLM24。
2.權(quán)利要求1所 述重組大腸桿菌在制備抗大腸桿菌0157:H7的N-糖蛋白疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/21GK103740632SQ201410029563
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】陳敏, 馬中瑞, 張化杰, 商文靜, 王鵬 申請人:山東大學(xué)