一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，所述方法包括以下步驟：（1）制備石墨烯量子點(diǎn)水溶液；（2）將石墨烯量子點(diǎn)水溶液與PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系按優(yōu)化比例混合均勻；（3）在PCR儀上按程序進(jìn)行DNA擴(kuò)增。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化PCR的綜合優(yōu)化效果更佳，優(yōu)于其它現(xiàn)有的納米材料，可以有效提高PCR技術(shù)的靈敏度，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性。且優(yōu)化所需的石墨烯量子點(diǎn)用量低。此外，石墨烯量子點(diǎn)的制備步驟簡(jiǎn)單，貯存方便。
【專利說(shuō)明】一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)是一種新型的碳納米材料，具有單原子厚度的二維結(jié)構(gòu)，其粒徑分布小于100 nm。因?yàn)槠洫?dú)特的結(jié)構(gòu)和化學(xué)、物理性質(zhì)，石墨烯量子點(diǎn)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥各個(gè)領(lǐng)域。例如:研究發(fā)現(xiàn)石墨烯量子點(diǎn)可以作為一種核祀向藥物載體(EnhancingCell Nucleus Accumulation and DNA Cleavage Activity of Ant1-Cancer Drug viaGraphene Quantum Dots.Scientific Reports, 2013, 3, 2852);石墨烯量子點(diǎn)也可以與特定結(jié)構(gòu)的DNA分子作用，有望調(diào)控基因的表達(dá)(Stabilization and Induction ofOligonucleotide 1-Motif Structure via Graphene Quantum Dots.ACS Nano, 2013,7，531-537)，石墨烯量子點(diǎn)可以修飾DNA的結(jié)構(gòu)，有望在抗癌藥物方面有一定的應(yīng)用價(jià)值(Photo-Fenton Reaction of Graphene Oxide: A New Strategy to Prepare GrapheneQuantum Dots for DNA Cleavage.ACS Nano, 2012, 6(8)，6592)。除此之外，石墨烯量子點(diǎn)也可用于癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)(Detection of the ovarian cancer biomarker CA-125using chemiluminescence resonance energy transfer to graphene quantum dots,DO1: 10.1039/c3cc47701k)以及細(xì)胞成像(Strongly green-photoluminescent graphenequantum dots for bioimaging applicationsw Chem.Commun., 2011, 47, 6858 -6860.)。
[0003]聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)作為一種DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，自1985年被發(fā)明以來(lái)，被廣泛用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域。但是，不同于體內(nèi)擴(kuò)增，PCR體系沒有精確的調(diào)控和錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率不夠理想。近年來(lái)，有大量?jī)?yōu)化和改進(jìn)PCR方法和技術(shù)的報(bào)道。例如，利用各種納米材料作為增強(qiáng)劑來(lái)提高PCR技術(shù)的性能。如金納米粒(NanoparticlePCR: Nanogold-Assisted PCR with Enhanced Specificity.Angew.Chem.2005, 117,5230-5233);有些綜合優(yōu)化效果不明顯，如碳納米粉(專利號(hào):CN101134975A)、碳納米管(Effects of single-walled carbon nanotubes on the polymerase chain reaction.Nanotechnology, 2004, 15, 154-157)等。但是其中一些納米材料原料比較昂貴,成本高，所以有一定的缺陷性。最近報(bào)道的利用氧化石墨烯優(yōu)化PCR的方法克服了其中一些優(yōu)化方法的不足，PCR綜合優(yōu)化效果得到了改善(專利號(hào):01010546630)。但是仍存在一些缺點(diǎn)，例如氧化石墨烯尺寸較大，所以生物相容性差，而且該方法中氧化石墨烯使用量較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法。
[0005]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供石墨烯量子點(diǎn)在優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:
(1)制備石墨烯量子點(diǎn)水溶液；
(2)將石墨烯量子點(diǎn)水溶液與PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系按優(yōu)化比例混合均勻；
(3)在PCR儀上按程序進(jìn)行DNA擴(kuò)增；
步驟(2)中所述優(yōu)化比例是指石墨烯量子點(diǎn)的濃度是通過以下方法確定:對(duì)石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)行梯度稀釋后加入到PCR體系中進(jìn)行反應(yīng)，以實(shí)際擴(kuò)增效果達(dá)到優(yōu)化的范圍在體系中的比例為石墨烯量子點(diǎn)的優(yōu)化比例。
[0007]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(1)中石墨烯量子點(diǎn)水溶液制備方法為:以Hummers法合成的氧化石墨烯水溶液為起始物，利用Photo-Fenton反應(yīng)，即以H2O2為氧化劑，F(xiàn)e3+為催化劑，在紫外光輻射下制備而成，將產(chǎn)物在超純水中透析，去除未反應(yīng)H2O2和反應(yīng)產(chǎn)生的小分子，得到純凈的石墨烯量子點(diǎn)水溶液。
[0008]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(2) PCR所擴(kuò)增的包括簡(jiǎn)單質(zhì)粒和復(fù)雜基因組，所述復(fù)雜基因組包括小牛胸腺DNA。
[0009]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(2)所述優(yōu)化比例為0.016-0.320 ng/μ 1，ng/μ I為石
墨烯量子點(diǎn)的質(zhì)量/反應(yīng)體系溶液體積。
[0010]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明公開石墨烯量子點(diǎn)在優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于`:利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化PCR的綜合優(yōu)化效果更佳，優(yōu)于其它現(xiàn)有的納米材料，可以有效提高PCR技術(shù)的靈敏度，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性。且優(yōu)化所需的石墨烯量子點(diǎn)用量很低。此外，石墨烯量子點(diǎn)的制備步驟簡(jiǎn)單，貯存方便。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為不同濃度的GQDs對(duì)PCR靈敏度和產(chǎn)量的影響。
[0013]圖2為不同濃度的GQDs對(duì)質(zhì)粒PCR產(chǎn)物特異性的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0015]實(shí)施例1.利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法 第一步:制備石墨烯量子點(diǎn)水溶液
所述的石墨烯量子點(diǎn)水溶液是以Hmnmers法合成的氧化石墨烯水溶液為起始物,利用Photo-Fenton反應(yīng)，即以H2O2為氧化劑，F(xiàn)e3+為催化劑，在紫外光照射下制備而成，將產(chǎn)物在超純水中透析2天，除去未反應(yīng)H2O2和反應(yīng)產(chǎn)生的小分子，得到純凈的石墨烯量子點(diǎn)水溶液。具體制備方法可以參照文獻(xiàn)(Photo-Fenton Reaction of Graphene Oxide: A NewStrategy to Prepare Graphene Quantum Dots for DNA Cleavage.ACS Nano, 2012，6(8)，6592-6599)。
[0016]第二步:將石墨烯量子點(diǎn)溶液與PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系按優(yōu)化比例混合均勻 所述石墨烯量子點(diǎn)水溶液與PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化比例為有優(yōu)化效果的濃度在反應(yīng)體系中的比例。本發(fā)明中石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化范圍為0.016-0.320 ng/μ l,ng/y I為石墨烯量子點(diǎn)的質(zhì)量/反應(yīng)體系溶液體積。
[0017]所用的DNA聚合酶可以是Taq酶，也可以是Ex Taq等其它聚合酶；PCR擴(kuò)增DNA模板可以是質(zhì)粒，也可以是其它DNA模板。
[0018]混合均勻是指將擴(kuò)增所需的所有組分加入PCR管后，用移液槍連續(xù)吹吸7-8次。
[0019]第三步:在PCR儀上按程序進(jìn)行DNA擴(kuò)增
PCR條件和各操作步驟均可按常規(guī)方法操作。PCR中所用試劑和原料均可在市場(chǎng)購(gòu)買或按現(xiàn)有方法制得。本實(shí)施例中PCR儀為BIO-RAD (T100? Thermal Cycler, U.S.A.)。
[0020]實(shí)施例2.石墨烯量子點(diǎn)提高PCR反應(yīng)靈敏度和產(chǎn)量 實(shí)驗(yàn)試劑和材料:
引物 1:5’ -CGCTAACGGATTCACCAC-3，(SEQ ID N0.1)；
引物 2:5，-CACGGAAACCGAAGACCA-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0021]石墨烯量子點(diǎn)水溶液(0.1 ng/μ I和I ng/μ I),使用前在常溫下超聲I min。其它試劑見下面步驟中。
[0022]PCR條件:(I) 94°C預(yù)熱 5 min，(2) 95°C變性 30 s，(3) 52°C退火 30 s，(4) 72°C延伸30 s，步驟⑵~⑷重復(fù)36個(gè)循環(huán)，(5) 72°C延伸5 min, (6) 12°C降溫10 min。
[0023]操作步驟:
第一步:篩選PCR最低DNA模板量。將不同量的DNA模板加入到PCR體系中反應(yīng)。模板量分別為:1.75X10_2、1X10_2、2.5 X 10'1.75 X 10'I X 10'2.5 X 10'1.75X10'1Χ10_4、2.5Χ10_5、1.75Χ10_5、1Χ10_5、2.5Χ10_6 ng。
[0024]PCR 反應(yīng)體系其它組分:10XPCR 緩沖溶液(2.5μ I) ；dNTP (2 mM,2.5μ I) ；MgCl2(25 mM，1.5μ1);引物 I和 2 (各 5 mM，I μ I) ;Taq 聚合酶(5 U/μ 1，0.3 μ I);無(wú)菌水補(bǔ)足到25 μ I。對(duì)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0025]第二步:選用擴(kuò)增產(chǎn)物最少模板量2.5Χ 10_6 ng,并分別加入不同量的GQDs。GQDs量分別為:0、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8 ng，其它組分同上，無(wú)菌水補(bǔ)足到25 μ I。對(duì)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示。
[0026]當(dāng)模板量為2.5Χ 10_6 ng時(shí)，用常規(guī)的PCR條件幾乎沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，但加入GQDs后，如圖1所示，隨著GQDs加入量逐漸提高，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸增多，PCR產(chǎn)量和靈敏度得到明顯改善。當(dāng)GQDs終濃度范圍在0.016-0.16 ng/μ I時(shí)，優(yōu)化效果明顯。加入0.8 ngGQDs(最終濃度為0.032 ng/μ I),PCR的產(chǎn)量是不加GQDs的1.8倍，相當(dāng)于加入2.5X 10_5ng模板量的產(chǎn)量，靈敏度比不加GQDs提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0027]實(shí)施例3.石墨烯量子點(diǎn)提高PCR產(chǎn)物特異性
第一步:將0.25 ng DNA模板加入到PCR體系中反應(yīng)，DNA聚合酶換用Ex Taq酶，PCR體系其他組分同實(shí)施例2步驟一，無(wú)菌水補(bǔ)足到25 μ I。
[0028]第二步:以步驟一中的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，稀釋10倍，取1μ I加入PCR體系，加入不同量的GQDs進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。GQDs量分別為為:0、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 ng，其它組分同步驟一，無(wú)菌水補(bǔ)足到25 μ I。
[0029]對(duì)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示。從圖中可以看出，隨著加入GQDs的量增多，產(chǎn)物中非特異性條帶逐漸減少，當(dāng)石墨烯量子點(diǎn)最終濃度為0.12 - 0.14 ng/ μ I時(shí)優(yōu)化效果最佳。
[0030]實(shí)施例4.石墨烯量子點(diǎn)提高小牛胸腺DNA的PCR產(chǎn)量 實(shí)驗(yàn)試劑和材料:
引物 1:5，-ATTAAGGACATCTTAGGGGCCCTCT-3’ (SEQ ID N0.3)；
引物 2:5，-GGGTTTGATGTGAGGGGGTGTGTTG-3，(SEQ ID N0.4)。
[0031]石墨烯量子點(diǎn)水溶液(0.1 ng/μ I和I ng/μ I),使用前在常溫下超聲I min。其它試劑見下面步驟中。
[0032]PCR條件:(I) 95°C預(yù)熱 8 min, (2) 95°C變性 30 s，(3) 71°C退火30 S，(4) 72°C延伸25 S，步驟⑵~⑷重復(fù)35個(gè)循環(huán)，(5) 72°C延伸5 min, (6) 12°C降溫10 min。
[0033]將不同量的GQDs加入到PCR體系中反應(yīng)。GQDs量依次為:0、0.4、0.6、0.8、2、4、
6、8 ng。PCR體系其它組分:小牛胸腺DNA(0.5X10—3 ng/μ 1，I μ I) ; 10XPCR緩沖溶液(2.5 μ I) ；dNTP(2 mM,2.5μ I) ；MgCl2 (25 mM,2y I);引物 I 和 2(各 5 mM, I μ I) ; Taq 聚合酶(5 U/ μ I，0.3 μ I);無(wú)菌水補(bǔ)足到25 μ I。
[0034]對(duì)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。隨著加入GQDs的量增多，PCR產(chǎn)物產(chǎn)量也逐漸增多。加入0.8 ng GQDs(終濃度為0.032 ng/μ I)的產(chǎn)量是不加GQDs的2.1倍。
[0035]綜上所述，利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化PCR的綜合優(yōu)化效果更佳，可以有效提高PCR技術(shù)的靈敏度，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性。且優(yōu)化所需的石墨烯量子點(diǎn)量很低。PCR所擴(kuò)增的可以是簡(jiǎn)單質(zhì)粒，也可以是小牛胸腺DNA等復(fù)雜的基因組。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系所使用的聚合酶沒有特殊要求，`可以是Taq酶，也可以是Ex Taq等其它DNA聚合酶。
[0036]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)制備石墨烯量子點(diǎn)水溶液； (2)將石墨烯量子點(diǎn)水溶液與PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系按優(yōu)化比例混合均勻； (3)在PCR儀上按程序進(jìn)行DNA擴(kuò)增； 步驟(2)中所述優(yōu)化比例是指石墨烯量子點(diǎn)的濃度是通過以下方法確定:對(duì)石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)行梯度稀釋后加入到PCR體系中進(jìn)行反應(yīng)，以實(shí)際擴(kuò)增效果達(dá)到優(yōu)化的范圍在體系中的比例為石墨烯量子點(diǎn)的優(yōu)化比例。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，其特征在于，步驟(1)中石墨烯量子點(diǎn)水溶液制備方法為:以Hummers法合成的氧化石墨烯水溶液為起始物，利用Photo-Fenton反應(yīng)，即以H2O2為氧化劑，F(xiàn)e3+為催化劑，在紫外光輻射下制備而成，將產(chǎn)物在超純水中透析，去除未反應(yīng)H2O2和反應(yīng)產(chǎn)生的小分子，得到純凈的石墨烯量子點(diǎn)水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，其特征在于，步驟(2) PCR所擴(kuò)增的包括簡(jiǎn)單質(zhì)粒和復(fù)雜基因組，所述復(fù)雜基因組包括小牛胸腺DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 一種利用石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，其特征在于，步驟(2)所述優(yōu)化比例為0.016-0.320 ng/μ I, ng/μ I為石墨烯量子點(diǎn)的質(zhì)量/反應(yīng)體系溶液體積。
5.石墨烯量子點(diǎn)在優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103773757SQ201410029636
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】張井巖, 朱美棟 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)