一種生物合成慶大霉素x2工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及生物合成慶大霉素X2基因工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用。利用微生物分子遺傳學(xué)技術(shù)，使絳紅小單孢菌中慶大霉素的生物合成關(guān)鍵基因失活，阻斷慶大霉素生物合成代謝流，定向積累慶大霉素X2。本發(fā)明通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pFU503，并將pFU503導(dǎo)入絳紅小單孢菌GK1101，借助框內(nèi)敲除技術(shù)，滅活genB3基因的功能，篩選雙交換菌株，發(fā)酵產(chǎn)物檢測，新組分鑒定，確認(rèn)為慶大霉素X2產(chǎn)生菌。本發(fā)明所構(gòu)建工程菌，遺傳性狀穩(wěn)定，可大量積累慶大霉素X2，填補(bǔ)了國內(nèi)外研究空白。所構(gòu)建的工程菌生產(chǎn)工藝簡單，發(fā)酵調(diào)控容易，合成效率高，提取精制方便，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，幾乎達(dá)到潔凈的生產(chǎn)境界，具有重要的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值，可產(chǎn)生極大的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種生物合成慶大霉素X2工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗生素制藥領(lǐng)域，涉及生物合成慶大霉素X2基因工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用。具體涉及利用分子遺傳學(xué)技術(shù)，敲除絳紅小單孢菌麗GKllOl中慶大霉素生物合成關(guān)鍵基因阻斷慶大霉素Χ2的后續(xù)修飾，積累慶大霉素Χ2，可應(yīng)用于藥物開發(fā)研究。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物是藥物的重要來源，是微生物制藥的基礎(chǔ)。小單孢菌能產(chǎn)生許多重要的抗生素和微生物酶，其合成的氨基糖苷類抗生素在臨床上具有重要的應(yīng)用價(jià)值，自瓦克斯曼發(fā)現(xiàn)鏈霉素以來，氨基糖苷類抗生素已經(jīng)在臨床上應(yīng)用了 70年，而且至今仍然是臨床上不可缺少的抗感染藥物。隨著科學(xué)家對(duì)藥用微生物研究的不斷深入，小單孢菌被認(rèn)為是尋找新化合物、新型藥物或其他具有生理活性物質(zhì)的重要資源。
[0003]慶大霉素是一類由小單孢菌產(chǎn)生的廣譜抗感染氨基糖苷類抗生素。幾十年的研究證明，慶大霉素經(jīng)過不同化學(xué)基團(tuán)修飾，可有效對(duì)付_耐藥菌感染。慶大霉素的結(jié)構(gòu)特征是:由2-脫氧鏈霉胺(2-D0S)，絳紅糖胺和加拉糖胺通過糖苷鍵連接而成。因絳紅糖胺取代基團(tuán)和取代位置的不同，形成了慶大霉素Α、B、X和C族等化合物。慶大霉素Α、B、X是慶大霉素生物合成途徑的中間產(chǎn)物，是開發(fā)抗原蟲藥物的重要化合物。此外，慶大霉素類衍生物還具有抗HIV效果。因此利用分子遺傳學(xué)技術(shù)`定向改造慶大霉素生物合成途徑，對(duì)積累慶大霉素單組份中間代謝產(chǎn)物具有重要的科學(xué)意義和現(xiàn)實(shí)意義。
[0004]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子遺傳學(xué)技術(shù)已成為后基因組時(shí)代闡明基因功能及工程菌構(gòu)建的重要手段。慶大霉素生物合成基因簇(GenBake accession nos.:JQ975418，AJ628149，AY524043，AJ575934)的構(gòu)建與測序，為研究該類藥物的深度開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。生物信息學(xué)的發(fā)展，為慶大霉素生物合成基因功能的預(yù)測及其生物合成途徑的闡明創(chuàng)造了條件。根據(jù)生物信息學(xué)知識(shí)及已有研究成果推斷慶大霉素生物合成基因簇上的#?似基因可能編碼氨基轉(zhuǎn)移酶，有可能是催化絳紅糖胺C6'的氨基轉(zhuǎn)移。理論推測，敲除絳紅小單孢菌私purpurea GKllOl (專利:201110331534.9)中g(shù)enB3基因，可能定向積累慶大霉素X2，得到主產(chǎn)慶大霉素X2的基因工程菌。
[0005]氨基寡糖功能研究，特別是抗原蟲，抗病毒，抗腫瘤功能方面的研究，是當(dāng)前國際研究的熱點(diǎn)。氨基寡糖被藥物學(xué)家看作是最有可能成為抗病毒和抗腫瘤藥物的一類化合物。慶大霉素B族、X族化合物早已被證明具有抗原蟲，抗病毒功效，是開發(fā)新型藥物的重要前體。慶大霉素生物合成過程，含有許多重要的氨基寡糖，但是它們僅僅是氨基寡糖生物合成的中間體，要獲得這些重要的化合物，十分困難，國內(nèi)外少見取得突破。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)，結(jié)合微生物分子遺傳學(xué)操作技術(shù)，在建立了系統(tǒng)的小單孢菌基因組改造的基礎(chǔ)上，成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)絳紅色小單孢菌該基因組的改良，在國際上首次得到了主產(chǎn)慶大霉素X2工程菌，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)慶大霉素X2奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)新型藥物奠定了創(chuàng)造了條件。本發(fā)明是在前一發(fā)明專利(201110331534.9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步拓展，是前一發(fā)明專利的深化，屬系列性專利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供生物合成慶大霉素X2基因工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用，通過構(gòu)建重組質(zhì)粒PFU503，并將pFU503導(dǎo)入絳紅小單孢菌GK1101，借助框內(nèi)敲除技術(shù)，滅活
基因的功能，篩選雙交換菌株，發(fā)酵產(chǎn)物檢測，新組分鑒定，確認(rèn)為慶大霉素Χ2產(chǎn)生菌。本發(fā)明所構(gòu)建工程菌，遺傳性狀穩(wěn)定，可大量積累慶大霉素Χ2，填補(bǔ)了國內(nèi)外研究空白。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種生物合成慶大霉素Χ2工程菌，所述的工程菌為絳紅色小單孢菌，該菌株被命名為Micromonospora purpurea 6----?,該菌株已于2013年12月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保蕆，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.8597。
[0008]工程化慶大霉素生物合成菌株絳紅色小單孢菌(包括棘孢小單孢菌)，迫使慶大霉素生物合成停止在慶大霉素X2位點(diǎn)，不再進(jìn)一步修飾，形成其它慶大霉素混合物，大量積累慶大霉素X2。
[0009]在已敲除基因的絳紅色小單孢菌GKl 101基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除genB3基因。
[0010]敲除genB3基因的關(guān)鍵序列，以達(dá)到喪失該基因功能為最終目的。
[0011]基因工程菌的構(gòu)建方法，主要包括以下步驟:
A.同源重組質(zhì)粒pFU503`的構(gòu)建；
B.同源重組質(zhì)粒pFU503導(dǎo)入絳紅色小單孢菌GKllOl；
C.接合子的篩選；
D.工程菌組分的鑒定。
[0012]利用所述的基因敲除方法，經(jīng)PCR分別獲得供《似基因上下游大約2000bp的兩個(gè)片段，作為交換臂，將兩者同時(shí)連接到PKC1139中，得到同源重組質(zhì)粒pFU503。
[0013]轉(zhuǎn)化是以萬co7iET12657/pUZ8002介導(dǎo)的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。
[0014]借助抗性標(biāo)記，篩選雙交換工程菌，刪除特定DNA序列，獲得經(jīng)生物合成且積累慶大霉素X2的工程菌。
[0015]所述的生物合成慶大霉素X2工程菌，在抗生素藥物制備中的應(yīng)用。
[0016]基因敲除的方法是:借助PCR技術(shù)，擴(kuò)增genB3上下游序列各2000 bp左右的片段，作為同源交換臂，兩個(gè)交換臂連接到穿梭載體PKC1139上，得到同源重組質(zhì)粒pFU503，載體pKC1139上的安普霉素抗性基因作為后續(xù)研究的篩選標(biāo)記。
[0017]重組質(zhì)粒pFU503通過疋co7iET12657 (pUZ8002)介導(dǎo)，經(jīng)結(jié)合轉(zhuǎn)移進(jìn)入絳紅小單孢菌GK1101。接合子能在含抗性(安普霉素AmK)篩選平板上萌發(fā)和生長，經(jīng)松弛培養(yǎng)數(shù)代，再從中篩選安普霉素敏感(Ams)菌株，通過PCR技術(shù)檢測，DNA測序驗(yàn)證，確認(rèn)得到主產(chǎn)慶大霉素X2的基因工程菌株GKB3226。
[0018]發(fā)酵液經(jīng)酸堿處理和離子交換樹脂提取，除雜精制后，代謝產(chǎn)物采用MS法檢測，進(jìn)行最終確認(rèn)。
[0019]其中基因genB3的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，基因genB3的氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:利用分子遺傳學(xué)技術(shù)，通過基因敲除法，構(gòu)建&?似和基因缺失的工程菌。該基因工程菌阻斷慶大霉素生物合成途徑中的關(guān)鍵步驟，迫使代謝過程停留在特定位點(diǎn)，積累慶大霉素X2，填補(bǔ)了國內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)慶大霉素X2的技術(shù)空白。同時(shí)闡明了基因的功能，對(duì)慶大霉素生物合成途徑的研究，具有重要的生物學(xué)意義。對(duì)開發(fā)氨基寡糖藥物，具有現(xiàn)實(shí)意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是慶大霉素X2的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0022]圖2是genB3敲除方案示意圖。
[0023]圖3是穿梭質(zhì)粒pFU503及其酶切電泳驗(yàn)證圖。(M1:DL5000 DNA Marker、1:EcoR
I/Xba I 酶切結(jié)果、2 =EcoR I /XhoI 酶切結(jié)果、3:XhoI/Xba I 酶切結(jié)果、M2: λ -EcoT14 Idigest DNA Marker)。
[0024]圖4是供》似基因同源重組及雙交換原理圖。(1:雙交換菌株GKB3226 PCR產(chǎn)物、2:出發(fā)菌株GKlOl PCR產(chǎn)物、M1:DL5000 DNA Marker)。1:質(zhì)粒游離存在；I1:染色體片段；II1:染色體回復(fù)突變；IV:染色體雙交換
圖5出發(fā)菌株GKllOl與工程菌GKB3226代謝產(chǎn)物的MS圖譜(GK1101為出發(fā)菌株，450.2為慶大霉素Cla，464.3為慶大霉素C2b ；GKB3226為工程菌，483.2為慶大霉素X2。 【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1:
1.穿梭質(zhì)粒PFU503的構(gòu)建
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的慶大霉素生物合成基因簇序列(GenBank Accession NumberJQ975418)，利用Verctor NTI 11.5軟件，分別在供》似基因上下游擴(kuò)增交換臂，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別命名 P21/P22、P23/P24。P21 (5' - GAATTC CGTGTACGTCCCCTGAATCC-3'，EcoRO, P22 (5 ; - CTCGAGGGGAGATCCTGACCAGTGAG -3 ; , XholO, P23 (5 ; - CTCGAGTACAACAGCTCCGGCGAGAT-3 ; , XholO ,?2A (5 ; - TCTAGA TACGTCAACGTGCACGGGGT-3 ;，Xba I )。提取絳紅色小單孢菌染色體DNA，以染色體DNA為模板，利用引物P21/P22，擴(kuò)增上游交換臂JHB1，長度為2141bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA試劑盒回收，克隆至pMD19-T，得到陽性克隆子，命名為PFU501 ;利用引物P23/P24，擴(kuò)增下游交換臂JHB2，長度為2289bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同樣經(jīng)DNA試劑盒回收，克隆至pMD19-T，得到陽性克隆子，命名為pFU502。質(zhì)粒PFU501 (需提供來源)通過I /Xhol I )雙酶(需提供來源)切，回收2141bp片段；質(zhì)粒pFU502 (需提供來源)經(jīng)OXo7 I /Xba I )雙酶切，回收2289bp片段；與此同時(shí)，pKC1139經(jīng)(&01? I /Xba I)雙酶切，回收大片段；將交換臂JHB1、JHB2和pKC1139三個(gè)片段混合，酶連。將酶產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌toplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取抗性菌落于LB培養(yǎng)液中過夜擴(kuò)增培養(yǎng)，提取得到陽性克隆子，命名為PFU503。PFU503通過三種不同的限制性內(nèi)切酶酶切:BcoR I /Xba I 雙酶切得到 6446bp 和 4442bp，&oR I /ZAoI 雙酶切得到 2147bp、1669bp、7072bp，油a I/Xhol雙酶切得到4777bp、3816bp、2295bp，其酶切電泳驗(yàn)證結(jié)果見圖3，證明質(zhì)粒pFU503與預(yù)測吻合。穿梭質(zhì)粒PFU503上含有敲除了供》似基因中998個(gè)堿基對(duì)的AgenB3序列和安普霉素抗性基因(圖3)。穿梭載體pFU503構(gòu)建完畢。
[0026]2.穿梭質(zhì)粒pFU503導(dǎo)入絳紅小單孢菌GKllOl將穿梭質(zhì)粒PFU503轉(zhuǎn)入萬.co7i ET12567 (pUZ8002)中，得到供體菌^:co7i ET12567(PUZ8002，pDB303)。然后通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法，轉(zhuǎn)化絳紅小單孢菌GK1101，37°C培養(yǎng)IOh后，用安普霉素和萘啶酸(終濃度分別為50 μ g / mL和25yg / mL)水溶液覆蓋，37°C繼續(xù)培養(yǎng)，直至長出轉(zhuǎn)化子；將所獲得的安普霉素抗性轉(zhuǎn)化子，在含有安普霉素(50μ g / mL)的斜面培養(yǎng)基上，于37°C條件下反復(fù)培養(yǎng)，直至徹底消除游離質(zhì)粒。隨機(jī)挑取一株命名為絳紅小單孢菌GKB32。經(jīng)提取染色體DNA，PCR檢測，DNA測序，確定為單交換突變株。
[0027]3.篩選雙交換菌株
將表型為安普霉素抗性的單交換突變株:絳紅小單孢菌GKB32，轉(zhuǎn)接到不添加安普霉素的平板上，連續(xù)松弛培養(yǎng)三代以上，分離單菌落，挑取單菌落分別影印到不含安普霉素和含安普霉素(安普霉素50 μ g/mL)的平板上，進(jìn)行敏感性鑒別培養(yǎng)，結(jié)果從2660多株中，篩選到6個(gè)安普霉素敏感菌株。設(shè)計(jì)雙交換驗(yàn)證引物P25/P26(P25:GCCTCCTTGGTCGGGTTGAA，P26:TTCTCGGCGATGATCGAGTC)，對(duì)安普霉素敏感型菌株進(jìn)行檢測，從中得到I株表型符合雙交換菌株的突變株，命名為絳紅小單孢菌GKB3226，雙交換菌株原理見圖4。雙交換檢測的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測和DNA序列，與預(yù)測的雙交換突變結(jié)果相吻合，證明絳紅小單孢菌GKB3226為敲除了職/7似基因的雙交換工程菌。
[0028]對(duì)雙交換菌株GKB3226進(jìn)行發(fā)酵，去除菌絲渣，收集發(fā)酵液。提取濾液中的代謝產(chǎn)物，通過MS定性檢測，結(jié)果顯示:產(chǎn)物的主峰為483 [M+H]+，其分子量與慶大霉素X2的482吻合，而161.75,242.13,322.19為其II級(jí)和III級(jí)離子碎片峰，質(zhì)譜圖見圖5。
[0029]實(shí)施例2:
絳紅色小單孢菌GKB3226代謝產(chǎn)物的制備
1.絳紅色小單孢菌GKB3226菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基:葡萄糖0.1%，玉米`淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黃豆餅粉1.0%，KNO3 0.05%, CaCO3 0.5%, ρΗ7.0。
[0030]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白胨0.4%，黃豆餅粉2.0 %，KNO3
0.01%, (NH4)2SO4 0.1%，CaCO3 0.5%,淀粉酶 0.025%, ρΗ7.5。
[0031]將實(shí)例I中步驟3獲得的絳紅色小單孢菌GKB3226，發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)10天，挖塊接種于種子培養(yǎng)基(裝量為50mL / 250mL三角瓶)，37°C搖床培養(yǎng)36 h (轉(zhuǎn)速為250rpm)。按10%接種量轉(zhuǎn)種于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝量為50mL/250mL三角瓶)，37°C發(fā)酵培養(yǎng)120 h(轉(zhuǎn)速為250rpm)。
[0032]20000升發(fā)酵罐培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，通氣量1:0.5~1.0 (M3 /M3 *min)，培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，接種量比例，發(fā)酵時(shí)間等類同于搖瓶發(fā)酵。
[0033]2代謝產(chǎn)物提取精制 A、粗提
發(fā)酵液稀釋后分別酸化、堿化，過濾除蛋白和菌絲渣后，用732樹脂靜態(tài)吸附61小時(shí)。收集吸附飽和樹脂，用0.5M HCl溶液酸洗飽和樹脂，再用無離子水洗滌至中性，而后用
0.01%氨水進(jìn)行堿洗，當(dāng)流出液達(dá)pH 9.0以上時(shí)，串聯(lián)到等體積的711樹脂柱上，收集樹脫液。
[0034]B、精制、結(jié)晶
洗脫液經(jīng)薄膜濃縮到約300000ug/mL，用12當(dāng)量濃硫酸調(diào)至pH5.5飛.0.活性炭脫色到透光度達(dá)92%以上，在攪拌下，緩慢向濃縮液中滴加入95%以上乙醇，進(jìn)行結(jié)晶，時(shí)間3—4小時(shí)，之后經(jīng)液固分離，85%乙醇溶液淋洗，得濕成品。濕成品真空干燥(真空度500mmHg以上，溫度60°C，干燥6小時(shí))，即得慶大霉素X2成品，收率80%以上。
[0035]C、代謝產(chǎn)物質(zhì)譜分析
絳紅色小單孢菌GKB3226的代謝產(chǎn)物經(jīng)安捷倫質(zhì)譜儀分析，結(jié)果見圖5。圖5-GK1101中450.3和464.3的峰，對(duì)應(yīng)的組分依次是慶大霉素Cla和C2b ；圖5-GB3226中483.2的峰，對(duì)應(yīng)的是慶大霉素X2，而161.75,242.13,322.19的峰，是慶大霉素X2的II級(jí)和III級(jí)離子碎片峰。因此，從圖5中的GKllOl (上)和GB3226 (下)比較可以看出，工程菌絳紅色小單孢菌GKB3226主要合成慶大霉素X2，是一株生物合成組分高度單一的工程菌，非常適合于產(chǎn)業(yè)化。
[0036]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋`范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:所述的工程菌為絳紅色小單孢菌，該菌株被命名為絳紅色小單抱菌purpurea) GKB3226,已于2013年12月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保蕆，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.8597。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:工程化慶大霉素生物合成菌株絳紅色小單孢菌，包括棘孢小單孢菌，迫使慶大霉素生物合成停止在慶大霉素X2位點(diǎn)，不再進(jìn)一步修飾，形成其它慶大霉素混合物，大量積累慶大霉素X2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:在已敲除職af基因的絳紅色小單孢菌GKl 101基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除genB3基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:敲除genB3基因的關(guān)鍵序列，以達(dá)到喪失該基因功能為最終目的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:基因工程菌的構(gòu)建方法，主要包括以下步驟: A.同源重組質(zhì)粒pFU503的構(gòu)建； B.同源重組質(zhì)粒pFU503導(dǎo)入絳紅色小單孢菌GKllOl； C.接合子的篩選； D.工程菌組分的鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:利用所述的基因敲除方法，經(jīng)PCR分別獲得供《似基`因上下游大約2000bp的兩個(gè)片段，作為交換臂，將兩者同時(shí)連接到PKC1139中，得到同源重組質(zhì)粒PFU503。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:轉(zhuǎn)化是以萬co7iET12657/pUZ8002介導(dǎo)的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:借助抗性標(biāo)記，篩選雙交換工程菌，刪除特定DNA序列，獲得經(jīng)生物合成且積累慶大霉素X2的工程菌。
9.一種如權(quán)利要求1所述的生物合成慶大霉素X2工程菌，在抗生素藥物制備中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P19/50GK103820362SQ201410030147
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】洪文榮, 張熠, 林強(qiáng) 申請(qǐng)人:福州大學(xué), 福州市鼓樓區(qū)榮德生物科技有限公司