一種二化螟血淋巴細胞的原代培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種二化螟血淋巴細胞的原代培養(yǎng)方法。包括如下步驟：（1）配制細胞原代培養(yǎng)液和傳代培養(yǎng)液；（2）將二化螟幼蟲浸沒在乙醇溶液中，進行表面消毒，清洗吸干；（3）將蟲體置于用乙醇消毒過的解剖蠟盤中，解剖二化螟；（4）將血淋巴放入盛有HBSS清洗液的細胞培養(yǎng)瓶，靜置，待血淋巴細胞貼壁后，吸除HBSS，加入新鮮的HBSS，重復3次；（5）加入細胞原代培養(yǎng)液，放入無光照的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜后，再加入細胞傳代培養(yǎng)液；（6）每隔7天吸出和換入細胞傳代培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶。本發(fā)明有助于在離體條件下研究二化螟，為其防治途徑的研究和開發(fā)提供幫助。
【專利說明】一種二化螟血淋巴細胞的原代培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及屬于昆蟲細胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種二化螟血淋巴細胞的原代
培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生命科學的迅猛發(fā)展，在生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】中，細胞工程已愈來愈受到重視。培養(yǎng)昆蟲細胞作為研究材料，一直是細胞生物學、分子生物學和生物化學以及昆蟲毒理學等科學研究的重要方面。
[0003]自從Grace在1962年首次建立天蠶蛾細胞系以來，昆蟲細胞培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速發(fā)展，目前已建立了 800多株昆蟲細胞系，主要集中于鱗翅目、雙翅目(潘李珍等，1980，1989 ;曾慶韜等，1998)、鞘翅目(Lynn et al., 1995; Iwabuchi, 1999; Stiles,1992)、直翅目(Heinandez-Crespo et al., 2000)、膜翅目、同翅目和半翅目等,其中大部分來自鱗翅目和雙翅目，來源于其他目的昆蟲細胞系僅占1/10左右(張寰等，2007)。昆蟲細胞系的建立，不但促進了昆蟲生物學方面的基礎(chǔ)研究，也大大促進了基于昆蟲細胞的應用性研究。其中，昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)(BEVS)是當今最具高效的真核表達系統(tǒng)，已廣泛應用于干擾素等外源基因的表達。
[0004]在所建立的昆蟲細胞系中，研究和應用最多的是黑腹果蠅iDrosophila
S2 細胞系 、粉紋夜蛾/?i)的 BT1-Tn-5B1_4 (High Five)細胞系和草地貪夜蛾/r^§7>6?r￡/a)Sf21細胞系及其克隆株Sf9等。相對于已知的上百萬種昆蟲以及昆蟲細胞系的廣泛用途來說，已經(jīng)建立的細胞系還遠遠不夠，仍需要建立更多的昆蟲細胞系以滿足實際需要。
[0005]二化螟suppressalis (Walker)屬鱗翅目，螟蛾科,是我國水稻上危害最為嚴重的常發(fā)性害蟲之一，在分蘗期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成蟲傷株和白穗，一般年份減產(chǎn)3%~5%，嚴重時減產(chǎn)在3成以上。除危害水稻外，二化螟還危害玉米、甘蔗、粟、蠶豆、茭白、高粱、油菜、小麥、紫云英等作物。二化螟有很強的適應能力，能快速適應不利環(huán)境(如抗性品種和殺蟲劑)，其致害性能快速變異。在二化螟的防治過程中，新型生物農(nóng)藥的篩選和鑒定日益成為研究重點。生物農(nóng)藥的活動生物測定需要大量發(fā)育一致的二化螟試蟲，對飼養(yǎng)場地要嚴格的要求，工作量大，而若有離體培養(yǎng)的二化螟細胞，則可以在離體條件下研究生物農(nóng)藥對二化螟的作用，從而有助于在細胞水平研究殺蟲劑對二化螟的作用機制，有助于當前殺蟲劑的改進和新殺蟲劑的發(fā)明。目前，關(guān)于二化螟細胞的體外培養(yǎng)技術(shù)及二化螟細胞系，還未見報道。因此，通過本發(fā)明，建立二化螟細胞系，不僅能增加我國新昆蟲細胞系的數(shù)量及種類，還能為日后該類昆蟲細胞系的建立提供借鑒經(jīng)驗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種二化螟血淋巴細胞的原代培養(yǎng)方法。[0007]二化螟血淋巴細胞的原代培養(yǎng)方法包括如下步驟:
(O配制細胞原代培養(yǎng)液和傳代培養(yǎng)液；
(2)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進行表面消毒10~20分鐘，用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲2~3次，用無菌濾紙吸干蟲體或用吹風機吹干蟲體；
(3)將蟲體置于用70%或75%乙醇消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，解剖二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴；
(4)將血淋巴放入盛有ImL~2mLHBSS清洗液的T_25cm2細胞培養(yǎng)瓶，靜置15~20分鐘，待血淋巴細胞貼壁后，吸除HBSS，加入新鮮的HBSS，重復3次；
(5)最后I次去除HBSS后，加入細胞原代培養(yǎng)液lmL，放入無光照的細胞培養(yǎng)箱中27°C培養(yǎng)，過夜后，再加入2mL細胞傳代培養(yǎng)液；
(6)每隔7天吸出和換入50%~70%量的細胞傳代培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶。
[0008]所述的細胞原代培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清及飽和苯基硫脲的混合物，PH值為6.0-6.8。所述的細胞傳代培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液和動物血清的混合物，PH值為6.0-6.8。所述的昆蟲細胞培養(yǎng)液選自TNM-FH，所述的動物血清為胎牛血清。所述的青霉素含量為200U/ml,鏈霉素含量為0.2yg /ml,兩性霉素B含量為0.5μ g /mlO所述的動物血清體積比含量為10~20%。所述的動物血清體積比含量為10-20%。所述的飽和苯基硫脲溶液為高壓滅菌的苯基硫脲固體過量加入到無菌的TNM-FN培養(yǎng)液中配制而成。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:采用上述方案，對二化螟幼蟲血淋巴進行了原代培養(yǎng)，取得了較好的培養(yǎng)效果。本發(fā)明 快速、有效、重復性強，是對鱗翅目昆蟲細胞培養(yǎng)的重要補充。二化螟為水稻重要害蟲，本發(fā)明有助于在離體條件下研究二化螟，為其防治途徑的研究和新型生物農(nóng)藥的開發(fā)提供幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1培養(yǎng)2天后血淋巴細胞的培養(yǎng)形態(tài)；
圖2培養(yǎng)16天后血淋巴細胞的培養(yǎng)形態(tài)；
圖3培養(yǎng)30天后血淋巴細胞的培養(yǎng)形態(tài)。
【具體實施方式】
[0011]以下結(jié)合實例對本發(fā)明作進一步的詳細說明:
實施例1
TNM-FH細胞培養(yǎng)基的配制 經(jīng)過下列步驟:
(1)47.5g Grace干粉培養(yǎng)基中加入700mL去離子水,磁力攪拌器攪拌加速溶解；
(2)依次加入0.35g NaHCO3, 3.0g的水解乳蛋白，3.0g酵母提取物；
(3)精密酸度計測定pH值，用去離子水配制的INNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.20—6.30 ；
(4)去離子水定容至1000mL;
(5)0.45 μ m濾膜過濾；(6)超級工作臺用0.22 μ m的濾膜過濾培養(yǎng)基并分裝；
(7)28°C培養(yǎng)箱放置I星期，檢查無污染后4°C保存；
實施例2
原代細胞培養(yǎng)液和傳代細胞培養(yǎng)液的制備 原代細胞培養(yǎng)液(配制500mL):
成分數(shù)量
TNM-FH 培養(yǎng)基400mL
胎牛血清50.0mL
苯基硫脲飽和溶液50.0mL
青霉素100U
鏈霉素0.1 μ g
兩性霉素B0.25 μ g
在無菌操作臺內(nèi)，將上述成分混勻，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0012]傳代細胞培養(yǎng) 液(配制500mL):
成分數(shù)量
TNM-FH 培養(yǎng)基400mL
胎牛血清100.0mL
在無菌操作臺內(nèi)，將上述成分混勻，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0013]實施例3 二化螟血淋巴細胞的原代培養(yǎng)
(1)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在75%乙醇溶液中，進行表面消毒10分鐘；用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲3次；用無菌濾紙吸干蟲體；
(2)將蟲體置于用75%消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定；解剖二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴；
(3)將血淋巴放入盛有ImLHBSS清洗液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶，靜置15分鐘，待血淋巴細胞貼壁后，吸除HBSS，加入新鮮的HBSS，重復3次；
(4)最后I次去除HBSS后，加入原代培養(yǎng)液lmL，放入無光照的細胞培養(yǎng)箱中27°C培養(yǎng)；過夜后，再加入2mL細胞傳代培養(yǎng)液；
(5)每隔7天吸出和換入70%量的細胞傳代培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)
瓶；
所述的細胞原代培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清及飽和苯基硫脲的混合物，pH值為6.0。所述的細胞傳代培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液和動物血清的混合物，pH值為6.0。所述的昆蟲細胞培養(yǎng)液選自TNM-FH，所述的動物血清為胎牛血清。所述的青霉素含量為200U/ml,鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g/ml ο所述的動物血清體積比含量為10%。所述的動物血清體積比含量為10%。所述的飽和苯基硫脲溶液為高壓滅菌的苯基硫脲固體過量加入到無菌的TNM-FN培養(yǎng)液中配制而成。
[0014]在上述操作后2天后可觀察到大量增殖的單個細胞(見圖1)并逐漸向外圍擴展直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶;第16天后見到細胞開始拉絲生長，不斷增值(見圖2);第30天后，拉絲現(xiàn)象消失，增殖細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶表面，二化螟血淋巴細胞原代培養(yǎng)成功(見圖3);把含有新增值的細胞，連同全部的細胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，按照1:5(細胞體積:最后培養(yǎng)液體積)進行傳代培養(yǎng)。二化螟幼蟲血淋巴細胞系初步建立成功。
[0015]實施例4 二化螟血淋巴細胞的原代培養(yǎng)
(1)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在70%乙醇溶液中，進行表面消毒20分鐘，用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲2次，用吹風機吹干蟲體；
(2)將蟲體置于用70%乙醇消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，解剖二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴；
(4)將血淋巴放入盛有2mLHBSS清洗液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶，靜置20分鐘，待血淋巴細胞貼壁后，吸除HBSS，加入新鮮的HBSS，重復3次；
(5)最后I次去除HBSS后，加入細胞原代培養(yǎng)液lmL，放入無光照的細胞培養(yǎng)箱中27°C培養(yǎng)，過夜后，再加入2mL細胞傳代培養(yǎng)液；
(6)每隔7天吸出和換入50%量的細胞傳代培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶。
[0016]所述的細胞原代培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清及飽和苯基硫脲的混合物，pH值為6.8。
[0017]所述的細胞傳代培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液和動物血清的混合物，pH值為6.8。所述的昆蟲細胞培養(yǎng)液選自TNM-FH，所述的動物血清為胎牛血清。所述的青霉素含量為200U/ml,鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g /ml。所述的動物血清體積比含量為20%。所述的動物血`清體積比含量為20%。所述的飽和苯基硫脲溶液為高壓滅菌的苯基硫脲固體過量加入到無菌的TNM-FN培養(yǎng)液中配制而成。
【權(quán)利要求】
1.一種二化螟血淋巴細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: (O配制細胞原代培養(yǎng)液和傳代培養(yǎng)液； (2)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進行表面消毒10~20分鐘，用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲2~3次，用無菌濾紙吸干蟲體或用吹風機吹干蟲體； (3)將蟲體置于用70%或75%乙醇消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，解剖二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴； (4)將血淋巴放入盛有ImL~2mLHBSS清洗液的T_25cm2細胞培養(yǎng)瓶，靜置15~20分鐘，待血淋巴細胞貼壁后，吸除HBSS，加入新鮮的HBSS，重復3次； (5)最后I次去除HBSS后，加入細胞原代培養(yǎng)液lmL，放入無光照的細胞培養(yǎng)箱中27°C培養(yǎng)，過夜后，再加入2mL細胞傳代培養(yǎng)液； (6)每隔7天吸出和換入50%~70%量的細胞傳代培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞原代培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清及飽和苯基硫脲的混合物，pH值為6.0-6.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞傳代培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液和動物血清的混合物，PH值為6.0-6.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲細胞培養(yǎng)液選自ΤΝΜ---，所述的動物血清為胎牛血清?！?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量為200U/ml，鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g /ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的動物血清體積比含量為10~20%。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的動物血清體積比含量為10-20%。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的飽和苯基硫脲溶液為高壓滅菌的苯基硫脲固體過量加入到無菌的TNM-FN培養(yǎng)液中配制而成。
【文檔編號】C12N5/07GK103820380SQ201410030148
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】劉光富, 俞曉平 申請人:中國計量學院