一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用。該胞外多糖由質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為20.70～22.74%的氨基葡萄糖、33.87～35.21%的葡萄糖、20.57～22.38%的阿拉伯糖、11.85～12.74%的氨基半乳糖和8.74～11.20%的半乳糖組成，其重均分子量為11,864～15,473道爾頓。本發(fā)明所述的胞外多糖為一種組成明確，具備一定免疫調(diào)節(jié)作用的新型多糖，其可作為添加劑應(yīng)用于制藥、臨床等相關(guān)領(lǐng)域中，應(yīng)用前景十分廣闊。
【專利說明】—種具有免疫調(diào)節(jié)作用的胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類能利用可發(fā)酵性糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱，目前在自然界已發(fā)現(xiàn)的這類細(xì)菌在分類學(xué)上至少有23個(gè)屬。在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用較多的乳酸菌主要有乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬等。乳酸菌是益生菌最主要的來源，許多乳酸菌是人體腸道固有的益生菌，具有改善人體腸道菌群，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，抑腫瘤，降低血清膽固醇，調(diào)節(jié)血壓等重要的生理活性。 [0003]乳酸菌發(fā)揮主要功能特性的作用機(jī)理，除了定殖、通過主要代謝產(chǎn)物(乳酸等)改善腸道內(nèi)環(huán)境等以外，一些次生代謝產(chǎn)物如細(xì)菌素、胞外多糖等也發(fā)揮著非常重要的作用。其中，具有理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的乳酸菌胞外多糖引起了國內(nèi)外許多學(xué)者的研究興趣。
[0004]乳酸菌胞外多糖是乳酸菌產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的一種多糖。乳酸菌胞外多糖具有重要的工藝學(xué)功能，對酸乳、干酪及絕大多數(shù)發(fā)酵乳制品的流變性質(zhì)、質(zhì)構(gòu)、口感以及風(fēng)味具有重要的影響。乳酸菌胞外多糖可以改善乳制品的流變學(xué)特性和質(zhì)構(gòu)特性。由于天然增稠作用，由產(chǎn)粘乳桿菌與非產(chǎn)粘球菌混合發(fā)酵形成的酸乳與非產(chǎn)粘菌株形成的酸乳相比口感滑潤、粘度增加；產(chǎn)胞外多糖乳酸菌能夠賦予酸乳更強(qiáng)的持水力，從而避免乳清析出；此外，由胞外多糖而產(chǎn)生的持水性增強(qiáng)有助于提高干酪等產(chǎn)品的得率。乳酸菌胞外多糖還具有良好的生理功能，如增強(qiáng)黏膜吸附作用、抗腫瘤、抗?jié)?、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇、降血壓，還可以作為益生元促進(jìn)腸道內(nèi)其他益生菌的生長，優(yōu)化腸道微生態(tài)環(huán)境等。因此，開展產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的研究，對于改善乳制品生產(chǎn)加工、開發(fā)具有特定功能性質(zhì)的乳酸菌發(fā)酵乳制品，具有十分重要的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。開發(fā)具有益生功能的乳酸菌胞外多糖成為目前研究的熱點(diǎn)。
[0005]20世紀(jì)60年代以來，多糖被認(rèn)為是一種廣譜的非特異性的免疫促進(jìn)劑，可增強(qiáng)宿主細(xì)胞的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，如激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等，激活補(bǔ)體及誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素等，其作用將是激活人體的非特異性防御機(jī)能，在抗病毒、抗腫瘤、抗輻射等方面有很好的療效。
[0006]然而，目前在本領(lǐng)域內(nèi)，研究成熟的并且能夠在實(shí)踐中推廣應(yīng)用的乳酸菌胞外多糖的種類并不多，生產(chǎn)和科研上都存在對新的胞外多糖進(jìn)行研究的需要，以豐富性能優(yōu)良、用途廣泛的乳酸菌胞外多糖的種類。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對目前乳酸菌胞外多糖種類和產(chǎn)品功能不夠豐富的現(xiàn)狀，而提供一種新的乳酸菌胞外多糖，具體為一種鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)的胞外多糖,本發(fā)明還提供所述胞外多糖的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的胞外多糖被證明具有良好的有絲分裂原活性和免疫調(diào)節(jié)活性。[0008]本發(fā)明所述的鼠李糖乳桿菌的胞外多糖最初發(fā)現(xiàn)由保藏編號為CGMCC N0.6430的鼠李糖乳桿菌所產(chǎn)生。所述的保藏編號為CGMCC N0.6430的鼠李糖乳桿菌篩選自健康成年人的糞便，在發(fā)酵乳中能夠產(chǎn)生胞外多糖。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)該菌株具有良好的耐酸耐膽鹽性能，推測其具有潛在的益生功能，并且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其粗多糖可以提高小鼠T/B淋巴細(xì)胞的活性，推測其具有潛在的提高機(jī)體免疫力的功能。為了更好地了解其結(jié)構(gòu)和功能，對其粗多糖進(jìn)行分離純化及其功能研究。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，其保藏編號為CGMCC N0.6430。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案。
[0009]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種鼠李糖乳桿菌的胞外多糖，所述胞外多糖由質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為20.70~22.74%的氨基葡萄糖、33.87~35.21%的葡萄糖、20.57~22.38%的阿拉伯糖、11.85~12.74%的氨基半乳糖和8.74~11.20%的半乳糖組成，該胞外多糖的平均重量分子量為11，864~15，473道爾頓。
[0010]本發(fā)明中，所述的胞外多糖可以由保藏號為CGMCC N0.6430的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)菌株產(chǎn)生，但不限于此，也可以由其它的可以產(chǎn)胞外多糖的菌株產(chǎn)生。較佳地，所述的胞外多糖由前述保藏號為CGMCC N0.6430的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)菌株
所產(chǎn)生。
[0011]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是:前述鼠李糖乳桿菌的胞外多糖的制備方法。
[0012]本發(fā)明中，所述的制備方法可以是將所述的鼠李糖乳桿菌按照現(xiàn)有技術(shù)內(nèi)常規(guī)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液采用常規(guī)的多糖分離方法分離得到胞外多糖。
[0013]較佳地，所述的制備方法包括如下步驟:
[0014](I)將保藏編號為CG`MCC N0.6430的鼠李糖乳桿菌的種子液以體積比1.0~5.0%的接種量接種于無菌脫脂乳培養(yǎng)基，于28~36°C培養(yǎng)24~40小時(shí)得發(fā)酵液；
[0015](2)將步驟(1)所得的發(fā)酵液在95~100°C加熱10~30min，冷卻至15~25°C后靜置3~16小時(shí)，離心取上清并向所述上清中加入三氯乙酸溶液至終濃度為5~8%，靜置8~16小時(shí)，離心獲得發(fā)酵上清液；所述百分比為每100毫升中含有的三氯乙酸的克數(shù)，所述三氯乙酸溶液是質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為75~85%的三氯乙酸溶液；
[0016](3)向步驟(2)所得的發(fā)酵上清液中加入2~4倍體積的體積百分?jǐn)?shù)為80~100%的乙醇，離心或過濾收集沉淀物并將沉淀物溶于水，用截留分子量為5000~14000道爾頓的透析袋在水中透析48~72小時(shí)，每8~12小時(shí)換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得所述胞外多糖的粗品。
[0017]本發(fā)明步驟(1)中，所述的無菌脫脂乳培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)所述的無菌脫脂乳培養(yǎng)基，較佳地是將10~12重量份脫脂乳和0.8~1.2重量份葡萄糖溶解于85~90重量份的水中，于115~125°C滅菌15~20分鐘，冷卻至15~25°C所得的無菌脫脂乳培養(yǎng)基。所述的接種量較佳地是2.0~4.0%，更佳地是2.0~2.5%。其中，發(fā)酵的時(shí)間較佳地是24~36小時(shí)，更佳地是28~32小時(shí)。
[0018]本發(fā)明步驟(2)中，所述的加熱較佳地為將步驟(1)所得的發(fā)酵液在95~100°C加熱15~20min。所述的三氯乙酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)較佳地為78~82%。
[0019]本發(fā)明步驟(3)中，所述的乙醇的體積百分?jǐn)?shù)較佳地為82~90%。所述透析袋的截留分子量較佳地為12000~14000道爾頓。[0020]本發(fā)明所述的制備方法更佳地還包括步驟(4)，即對步驟(3)所得的胞外多糖的粗品進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化的步驟；
[0021]所述的步驟(4)為:采用離子交換層析柱對步驟(3)所得的胞外多糖的粗品進(jìn)行分離純化，以45~55mM，pH7.5~7.8的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行等度洗脫，洗脫速度為2.5~
3.5mL/min，合并收集組分峰的洗脫產(chǎn)物，裝入截留分子量為10000~15000道爾頓的透析袋在去離子水中透析48~72小時(shí)，每8~12小時(shí)換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得所述胞外多糖。
[0022]本發(fā)明優(yōu)選步驟(4)為:采用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱對步驟
(3)所得的胞外多糖的粗品進(jìn)行分離純化，所述離子交換層析柱的規(guī)格為D2.6cmX30cm,以50mM, pH7.6的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行等度洗脫，洗脫速度為3mL/min，合并收集組分峰的洗脫產(chǎn)物，裝入截留分子量為14000道爾頓的透析袋在去離子水中透析72小時(shí)，每8小時(shí)換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得所述胞外多糖。
[0023]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是:前述鼠李糖乳桿菌的胞外多糖在食品、醫(yī)藥和相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明所述的胞外多糖具有一定的免疫活性，在食品、醫(yī)藥和相關(guān)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
[0025]在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0026]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0027]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0028]本發(fā)明所述的胞外多糖為一種組成明確、具備一定免疫調(diào)節(jié)作用的新型多糖，其可作為添加劑應(yīng)用于制藥、臨床等相關(guān)領(lǐng)域中，應(yīng)用前景十分廣闊。作為微生物產(chǎn)生的高分子物質(zhì)，本發(fā)明的胞外多糖具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如免疫刺激和免疫抑制活性，其可以通過刺激特定免疫細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫作用，在應(yīng)用時(shí)對于劑量的確定及應(yīng)用的范圍也更為明確，具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為CGMCC N0.6430胞外多糖粗品的凝膠層析等度洗脫曲線圖。
[0030]圖2為CGMCC N0.6430胞外多糖粗品的凝膠層析等度洗脫曲線圖。
[0031 ]圖3為CGMCC N0.6430胞外多糖粗品的凝膠層析等度洗脫曲線圖。
[0032]圖4為CGMCC N0.6430胞外多糖單一組分S2凝膠柱層析洗脫曲線圖。
[0033]圖5為CGMCC N0.6430胞外多糖單一組分S2的高效液相圖譜。
[0034]圖6為CGMCC N0.6430胞外多糖單一組分S2單糖組成的離子色譜圖。
[0035]圖7為CGMCC N0.6430胞外多糖單一組分S2的紅外光譜圖。
[0036]圖8為CGMCC N0.6430胞外多糖單一組分S2對淋巴細(xì)胞增殖作用的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0038]本發(fā)明中所述的鼠李糖乳桿菌CGMCC N0.6430篩選自健康成年人的糞便(其已經(jīng)在專利CN102994432A中公開)，其在MRS瓊脂平板(MRS培養(yǎng)基，乳桿菌選擇性培養(yǎng)基，Merck, Germany)上形成光滑、濕潤、圓形的菌落,用接種環(huán)輕輕接觸菌落表面,能形成很長的拉絲，具有良好的拉絲性能。
[0039]本發(fā)明利用鼠李糖乳桿菌CGMCC N0.6430在發(fā)酵乳中產(chǎn)胞外多糖，提取粗多糖，并利用離子色譜層析和凝膠色譜層析對其分離純化，制備得到單一多糖組分，并研究其多糖的部分物化性質(zhì)以及生物活性。
[0040]本發(fā)明中所述的室溫是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為20_25°C。
[0041]實(shí)施例1胞外多糖的制備
[0042]從37°C、厭氧培養(yǎng)48h的MRS瓊脂平板上挑取新鮮培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌CGMCCN0.6430菌落，轉(zhuǎn)接到添加2%(w/v)葡萄糖的12%(w/w)的無菌脫脂乳培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)20h，獲得種子液。然后按1%體積比的接種量轉(zhuǎn)接到上述無菌脫脂乳培養(yǎng)基中，36°C發(fā)酵40h，獲得鼠李糖乳桿菌CGMCC N0.6430的發(fā)酵乳。發(fā)酵乳于95°C加熱30min，待冷卻至室溫后，離心(4°C、14, 000g、20min)除去菌體和凝結(jié)蛋白；于上清液中加入85%(w/w)的三氯乙酸至終濃度8.0% (w/v)靜置過夜，離心(4°C、14，000g、20min)除去沉淀蛋白；取上清液加入4倍體積的80%乙醇，4°C靜置過夜，離心(4°C、14，000g、20min)收集沉淀，溶解于去離子水中并裝入截留分子量為8000道爾頓的透析袋內(nèi)，用去離子水透析48h，每12h換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得胞外多糖的粗品A。
[0043]米用DEAE-Sepharose Fast Flow(D2.6cmX 30cm)離子交換柱分離胞外多糖的粗品A，用45mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液平衡柱子。胞外多糖的粗品A用上述45mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液溶解后上樣，用Tris-HCl緩沖液(45mM，pH7.5)等度洗脫，洗脫速度為
2.5mL/min，每管6mL分部收集。用硫酸-苯酚法檢測多糖含量，合并收集組分峰的洗脫產(chǎn)物(圖1中0-50管，圖1中橫坐標(biāo)為管的編號，縱坐標(biāo)為光吸收值)，裝入截留分子量為8000道爾頓的透析袋內(nèi)，用去離子水透析48h以去除緩沖鹽，每8h換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，得單一組分的多糖，即本發(fā)明所述的胞外多糖，稱為S2-A。
[0044]實(shí)施例2胞外多糖的制備
[0045]從37°C、厭氧培養(yǎng)48h的MRS瓊脂平板上挑取新鮮培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌CGMCCN0.6430菌落，轉(zhuǎn)接到無菌脫脂乳培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)20h，獲得種子液，所述的無菌脫脂乳培養(yǎng)基是將10重量份脫脂乳和0.8重量份葡萄糖溶解于8重量份的水中，于115°C滅菌20分鐘，冷卻至25°C所得的無菌脫脂乳培養(yǎng)基。然后按3%體積比的接種量轉(zhuǎn)接到上述無菌脫脂乳培養(yǎng)基中，32°C發(fā)酵30h，獲得鼠李糖乳桿菌CGMCC N0.6430的發(fā)酵乳。發(fā)酵乳于100°C加熱IOmin,待冷卻至室溫后，離心(4°C、14, 000g、20min)除去菌體和凝結(jié)蛋白；于上清液中加入80%(w/w)的三氯乙酸至終濃度7.0% (w/v)靜置過夜,離心(4°C、14，000g、20min)除去沉淀蛋白；取上清液加入3倍體積的95%乙醇，4°C靜置過夜，離心(4°C、14，000g、20min)收集沉淀，溶解于去離子水中并裝入截留分子量為14000道爾頓的透析袋內(nèi)，用去離子水透析72h，每12h換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得胞外多糖的粗品B。
[0046]米用DEAE-Sepharose Fast Flow(D2.6cmX30cm)離子交換柱分離胞外多糖的粗品B，用50mM Tris-HCl (pH7.6)緩沖液平衡柱子。胞外多糖的粗品B用上述50mMTris-HCl (pH7.6)緩沖液溶解后上樣，用Tris-HCl緩沖液(50mM，pH7.6)等度洗脫，洗脫速度為3.0mL/min,每管6mL分部收集。用硫酸_苯酚法檢測多糖含量，合并收集組分峰的洗脫產(chǎn)物(圖2中0-50管，圖2中橫坐標(biāo)為管的編號，縱坐標(biāo)為光吸收值)，裝入截留分子量為14000道爾頓的透析袋內(nèi)，用去離子水透析72h以去除緩沖鹽，每12h換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得單一組分的多糖，即本發(fā)明所述的胞外多糖，稱為S2-B。
[0047]實(shí)施例3胞外多糖的制備
[0048]從37°C、厭氧培養(yǎng)48h的MRS瓊脂平板上挑取新鮮培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌CGMCCN0.6430菌落，轉(zhuǎn)接到無菌脫脂乳培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)20h，獲得種子液，所述的無菌脫脂乳培養(yǎng)基是將12重量份脫脂乳和1.2重量份葡萄糖溶解于90重量份的水中，于125°C滅菌15分鐘，冷卻至15°C所得的無菌脫脂乳培養(yǎng)基。然后按5%體積比的接種量轉(zhuǎn)接到上述無菌脫脂乳培養(yǎng)基中，28°C發(fā)酵24h，獲得鼠李糖乳桿菌CGMCC N0.6430的發(fā)酵乳。發(fā)酵乳于98°C加熱20min,待冷卻至室溫后，離心(4°C、14, 000g、20min)除去菌體和凝結(jié)蛋白；于上清液中加入75%(w/w)的三氯乙酸至終濃度5.0% (w/v)靜置過夜,離心(4。。、14，000g、20min)除去沉淀蛋白；取上清液加入2倍體積的100%乙醇，4°C靜置過夜，離心(4°C、14，OOOg,20min)收集沉淀，溶解于去離子水中并裝入截留分子量為5000道爾頓的透析袋內(nèi)，用去離子水透析56h，每IOh換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得胞外多糖的粗品C。
[0049]米用DEAE-Sepharose Fast Flow(D2.6cmX 30cm)離子交換柱分離胞外多糖的粗品C，用55mM Tris-HCl(pH7.8)緩沖液平衡柱子。胞外多糖的粗品C用上述55mM Tris-HCl(pH7.8)緩沖液溶解后上樣，用Tris-HCl緩沖液(55mM，pH7.8)等度洗脫，洗脫速度為
3.5mL/min，每管6mL分部`收集。用硫酸-苯酚法檢測多糖含量，合并收集組分峰的洗脫產(chǎn)物(圖3中0-50管，圖3中橫坐標(biāo)為管的編號，縱坐標(biāo)為光吸收值)，裝入截留分子量為5000道爾頓的透析袋內(nèi)，用去離子水透析56h以去除緩沖鹽，每IOh換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得單一組分的多糖，即本發(fā)明所述的胞外多糖，稱為S2-C。
[0050]實(shí)施例4胞外多糖單一性的驗(yàn)證
[0051]為驗(yàn)證本發(fā)明所述胞外多糖的單一性，將實(shí)施例1~3收集得到的多糖樣品S2-A、S2-B和S2-C在S印harose C1-6B(D1.6cmX 100cm)凝膠層析柱上繼續(xù)分離，用含0.15MNaCl的50mM Tris-HCl緩沖液平衡柱子和洗脫。洗脫速度為0.375mL/min, 15min/管分部收集，用硫酸-苯酚法檢測多糖含量。
[0052]結(jié)果表明，S2-A、S2-B和S2_C三個(gè)樣品均只呈現(xiàn)單一的對稱峰，表明本發(fā)明的胞外多糖為分子量相對均一的多糖。其中，樣品S2-B的凝膠色譜柱純化結(jié)果如圖4所示，其中，橫坐標(biāo)為管的編號，縱坐標(biāo)為吸光值。
[0053]實(shí)施例5胞外多糖的分子量測定
[0054]將實(shí)施例1~3收集得到的三個(gè)單一組分的胞外多糖樣品，即S2-A、S2_B、S2_C采用高效液相色譜HPLC法測定重均分子量(Mw)。將不同分子量(5，900，9，600，21，100，47, 100，107，000,200, 000,708, 000 和 I, 330，OOODa)的標(biāo)準(zhǔn)普魯藍(lán)多糖(Pullulanpolysaccharides calibration kit, Agilent technologies, USA)相繼進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間TR，以TR為橫坐標(biāo)，LgMw為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出分子量與保留時(shí)間TR的回歸方程。待測樣品按下述步驟進(jìn)樣，根據(jù)所得TR，通過回歸方程計(jì)算樣品的相對分子量。
[0055]采用Waters2690高效液相系統(tǒng)，配備Waters2410示差折光檢測器和紫外檢測器；選用 Waters UltrahydrogelTM Linear (ID7.8 X 300mm, 10 μ m)色譜柱兩柱串連。流動相:
0.1M NaNO3 ;柱溫:45°C ;流速:0.9mL/min ;進(jìn)樣量:20 μ L。
[0056]其中，樣品S2-B的高效液相圖譜如圖5所示，其呈現(xiàn)單一對稱峰，進(jìn)一步說明其是均一多糖，S2-B在HPLC上洗脫曲線的保留時(shí)間為20.78min，將保留時(shí)間代入到回歸方程推算出S2-B重均分子量為13，583Da。以相同的方法推算出S2_A、S2_C的重均分子量分別為11，864Da、15, 473Da。
[0057]結(jié)論:CGMCC N0.6430胞外多糖S2的重均分子量為11，864~15，473Da。
[0058]實(shí)施例6胞外多糖的單糖組成測定
[0059]采用離子色譜法測定本發(fā)明胞外多糖S2的單糖組成。
[0060](I)多糖的水解
[0061]吸取100 μ L濃度為4-5mg/mL的組分S2樣品溶液于5mL的具塞刻度試管中，加入IOOyL的4M三氟乙酸(TFA)，充氮?dú)夥夤埽?10°C烘箱中水解2h ;冷卻后打開蓋，加200 μ L甲醇后用氮?dú)獯蹈?，如此重?fù)加甲醇并用氮?dú)獯?次，去除TFA，將其殘?jiān)盟芙舛ㄈ葜?mL,用0.45 μ m微孔膜過濾后供進(jìn)樣分析。
[0062](2)離子色譜條件
[0063]色譜柱:CarboPacPA20 (ID3X150mm)
[0064]流動相:A，H2O；B, 250mmol/L NaOH ；
[0065]梯度洗脫；流速:0.5mL/min ;脈沖安培檢測器(PAD)；
[0066]進(jìn)樣體積:20 μ L ;柱溫:30°C
[0067]將實(shí)施例1~3中所得的S2-A、S2_B、S2_C三個(gè)樣品進(jìn)行上述單糖組成測定，其中S2-B單糖組成的HPAEC的色譜圖如圖6所示，其中，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為響應(yīng)值(nC)。結(jié)果顯示:胞外多糖S2-B主要由氨基葡萄糖(GlcN)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、氨基半乳糖(GalN)和半乳糖(Gal)組成。S2_A、S2_B、S2-C三個(gè)單一組分樣品中單糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比見表1。
[0068]表1S2的單糖組成
【權(quán)利要求】
1.一種鼠李糖乳桿菌的胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖由質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為20.70~22.74%的氨基葡萄糖、33.87~35.21%的葡萄糖、20.57~22.38%的阿拉伯糖、11.85~12.74%的氨基半乳糖和8.74~11.20%的半乳糖組成，該胞外多糖的平均重量分子量為11，864~15，473道爾頓。
2.如權(quán)利要求1所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏號為CGMCCN0.6430的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)菌株所產(chǎn)生。
3.如權(quán)利要求1所述的鼠李糖乳桿菌的胞外多糖的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將保藏編號為CGMCCN0.6430的鼠李糖乳桿菌的種子液以體積比1.0~5.0%的接種量接種于無菌脫脂乳培養(yǎng)基，于28~36°C培養(yǎng)24~40小時(shí)得發(fā)酵液； (2)將步驟(1)所得的發(fā)酵液在95~100°C加熱10~30min，冷卻至15~25°C后靜置3~16小時(shí)，離心取上清并向所述上清中加入三氯乙酸溶液至終濃度為5~8%，靜置8~16小時(shí)，離心獲得發(fā)酵上清液；所述百分比為每100毫升中含有的三氯乙酸的克數(shù)，所述三氯乙酸溶液是質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為75~85%的三氯乙酸溶液； (3)向步驟(2)所得的發(fā)酵上清液中加入2~4倍體積的體積百分?jǐn)?shù)為80~100%的乙醇，離心或過濾收集沉淀物并將沉淀物溶于水，用截留分子量為5000~14000道爾頓的透析袋在水中透析48~72小時(shí)，每8~12小時(shí)換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得所述胞外多糖的粗品。
4.如權(quán)利要求3所述 的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的無菌脫脂乳培養(yǎng)基是將10~12重量份脫脂乳和0.8~1.2重量份葡萄糖溶解于85~90重量份的水中，于115~125°C滅菌15~20分鐘，冷卻至15~25°C所得的無菌脫脂乳培養(yǎng)基；所述的接種量是2.0~4.0%，發(fā)酵的時(shí)間是24~36小時(shí)。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的接種量是2.0~2.5%，發(fā)酵的時(shí)間是28~32小時(shí)。
6.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的加熱為將步驟(1)所得的發(fā)酵液在95~100°C加熱15~20min ;所述的三氯乙酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為78~82%。
7.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的乙醇的體積百分?jǐn)?shù)為82~90% ;所述透析袋的截留分子量為12000~14000道爾頓。
8.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，其還包括步驟(4):所述的步驟(4)為:采用離子交換層析柱對步驟(3)所得的胞外多糖的粗品進(jìn)行分離純化，以45~55mM，pH7.5~7.8的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行等度洗脫，洗脫速度為2.5~3.5mL/min,合并收集組分峰的洗脫產(chǎn)物，裝入截留分子量為10000~15000道爾頓的透析袋在去離子水中透析48~72小時(shí)，每8~12小時(shí)換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥，即得所述胞外多糖。
9.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(4)為:采用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱對步驟(3)所得的胞外多糖的粗品進(jìn)行分離純化，所述離子交換層析柱的規(guī)格為D2.6cmX30cm,以50mM，pH7.6的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行等度洗脫，洗脫速度為3mL/min，合并收集組分峰的洗脫產(chǎn)物，裝入截留分子量為14000道爾頓的透析袋在去離子水中透析72小時(shí)，每8小時(shí)換水一次，在溫度不超過105 °C下干燥或者真空冷凍干燥，即得所述胞外多糖。
10.如權(quán)利要求1所 述的胞外多糖在食品、醫(yī)藥和相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/225GK103757070SQ201410033122
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】郭本恒, 吳正鈞, 劉振民, 韓瑨, 邵麗 申請人:光明乳業(yè)股份有限公司