一種異常畢赤酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】的一種異常畢赤酵母菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的異常畢赤酵母菌（Pichia?anomala），菌株為YPL6，保藏號為：CGMCC?No.8041。所述異常畢赤酵母菌（Pichia?anomala）YPL6及其代謝產(chǎn)物對桃采后褐腐病菌、蘋果采后灰霉病菌、蘋果采后青霉病菌和梨采后青霉病菌具有抑制作用；對桃采后褐腐病、蘋果采后灰霉病、梨采后青霉病、蘋果采后青霉病具有抑制作用。
【專利說明】一種異常畢赤酵母菌及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種異常畢赤酵母菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物真菌病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失，而果實(shí)采后真菌病害是一類重要的病害，造成了果實(shí)的大量減產(chǎn)，嚴(yán)重影響了果實(shí)的食用價(jià)值和市場價(jià)值，導(dǎo)致了果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入降低。在發(fā)達(dá)國家，果實(shí)采后病害引起的損失量占果實(shí)總量的15%以上，在發(fā)展中國家由于缺少必要的防控技術(shù)和設(shè)備，果實(shí)采后病害引起的損失量占總量的30%甚至更高上。果實(shí)采后病害的發(fā)生已給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)尤其是高端果蔬產(chǎn)品生產(chǎn)與加工造成了嚴(yán)重影響。而目前，國內(nèi)大多的研究多集中于果實(shí)的田間及園間防治，而對于果實(shí)采后病害的防治工作做的相對較少。
[0003]由Botrytis cinerea病原菌引起的蘋果灰霉病和由P.expansum病原菌引起的青霉病菌是蘋果果實(shí)主要的采后病害。目前在世界范圍，蘋果灰霉病和蘋果請霉病都是影響蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。蘋果灰霉病和青霉病多發(fā)于蘋果采摘、運(yùn)輸及貯存期間，因此，對蘋果灰霉病和青霉病的防控顯得非常重要。而目前，國內(nèi)對二者病害能夠有效防治的手段不多，即便是化學(xué)農(nóng)藥，有效的種類也不是很多。而蘋果作為人們桌上的經(jīng)常食用的果實(shí)，對食品安全方面要求較高。
[0004]由Monilinia spp.病原真菌引起的桃褐腐病目前在世界范圍內(nèi)都是桃子的第一大病害，也是影響桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的第一大問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在發(fā)達(dá)國家如美國、以色列、意大利、法國等，采后褐腐病導(dǎo)致的損失量就占桃總產(chǎn)量的10%-30%;在發(fā)展中國家由于缺少必要的防治技術(shù)和相關(guān)設(shè)備其損失量達(dá)30%-50%，甚至更高；有些地區(qū)，桃褐腐病的大面積嚴(yán)重發(fā)生，幾乎導(dǎo)致桃果實(shí)絕收。因此，對桃褐腐病的防治和控制顯得迫切和重要。
[0005]目前生產(chǎn)中對蘋果灰霉·病、青霉病和桃褐腐病的防治仍然以化防為主，但由此帶來的“3R”負(fù)面影響非常嚴(yán)重。化學(xué)農(nóng)藥的大量使用嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致果實(shí)中大量的農(nóng)藥殘留，影響人們身體健康。生物防治，利用拮抗微生物防治病害，已成為病害綜合防治的重要組成部分，是化學(xué)農(nóng)藥試劑應(yīng)用最有前景的替代手段之一。
[0006]異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)在自然環(huán)境中普遍存在,主要存在于含糖量較為豐富的果實(shí)表面和花上。該菌生長速度快，營養(yǎng)簡單，生長力強(qiáng)。在作為生防防治方面，它擁有自己獨(dú)特的優(yōu)勢:1)該酵母菌對環(huán)境的污染較少，不產(chǎn)生毒素；2)該酵母菌不產(chǎn)生抗生素，對人類相對比較安全；3)相對于真菌而言，該酵母菌不產(chǎn)生致敏孢子；4)該酵母生長所需營養(yǎng)比較簡單；5)該酵母適合商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；6)酵母菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，基因組較小，比較容易在分子水平上進(jìn)行操作。因此，它具有很好的應(yīng)用前景。
[0007]異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)在自然界中分布十分廣闊,而目前國內(nèi)還未有防治蘋果灰霉病、青霉病和桃褐腐病的異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種異常畢赤酵母菌(Pichia anomala),菌株為YPL6,保藏號為:CGMCC N0.8041。
[0009]本發(fā)明的目的也在于提供一種病原菌抑制劑，其活性成分為上述異常畢赤酵母菌和/或上述異常畢赤酵母菌的代謝物。
[0010]所述病原菌抑制劑對下述至少一種病原菌具有抑制作用:
[0011]A、桃采后褐腐病菌；
[0012]B、平果米后灰霉病囷；
[0013]C、平果米后青霉病囷；
[0014]D、梨米后青霉病菌。
[0015]所述桃米后褐腐病菌為Monilinia fructicola、Monilinia Iaxa 或 Moniliniafructigena ;所述蘋果采后灰霉病菌為Botrytis cinerea ;所述蘋果采后青霉病菌為Penicillium expansum ;所述梨米后青霉病菌為 Penicillium expansum。
[0016]本發(fā)明的目的還在于提供一種病害抑制劑，其活性成分為上述異常畢赤酵母菌和/或上述異常畢赤酵母菌的代謝物。
[0017]所述病害為下述至少一種:
[0018]A、桃采后褐腐病；
[0019]B、平果米后灰霉病；
[0020]C、平果米后青霉??；
`[0021]D、梨米后青霉病。
[0022]本發(fā)明的異常畢赤酵母菌(Pichia anomala),菌株為YPL6,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為=CGMCC N0.8041。
[0023]所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6為從果實(shí)表面分離得到。所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6 的 5.8S rDNA 基因及 TS1/ITS2 序列如 SEQ ID N0.1 所示，26S rDNA基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0024]所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的形態(tài)學(xué)特征為:白色奶油樣菌落，營養(yǎng)體細(xì)胞出芽生殖，兩極出芽，檸檬狀細(xì)胞，無假菌絲。25°C在5%Difco麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基上通過細(xì)胞與芽接合形成子囊孢子，每個(gè)子囊包含1-2個(gè)盔甲狀的子囊孢子。
[0025]所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的生理生化特征:可進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵，不可進(jìn)行棉子糖和乳糖發(fā)酵；碳源同化方面:山梨糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、D-甘露醇為陽性，半乳糖、乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖醇、赤蘚糖醇為陰性。所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6于含有5% (質(zhì)量含量)氯化鈉的培養(yǎng)基中均可正常生長，于PH4.0-5.5的培養(yǎng)基中均可正常生長，在環(huán)境溫度為4°C下生長勢弱，在40°C以上不可生長；最佳適宜生長溫度為25_30°C。所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6產(chǎn)具有抑菌作用較強(qiáng)的物質(zhì)。
[0026]本發(fā)明的目的還在于提供上述異常畢赤酵母菌和/或其代謝物在抑制病原菌、制備病原菌抑制劑、抑制病害、制備病害抑制劑中的應(yīng)用。
[0027]上述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)DPP2的用途中，所述病原菌為下述至少一種:
[0028]A、桃采后褐腐病菌；[0029]B、平果米后灰霉病囷；
[0030]C、平果米后青霉病囷；
[0031]D、梨米后青霉病菌；
[0032]所述病害為下述至少一種:
[0033]A、桃釆后褐腐病；
[0034]B、平果米后灰霉?。?br> [0035]C、蘋果米后青霉病；
[0036]D、梨米后青霉病。
[0037]其中，所述桃米后褐腐病菌為Monilinia fructicola、Monilinia Iaxa 或Monilinia fructigena ;所述蘋果釆后灰霉病菌為Botrytis cinerea ;所述蘋果釆后青霉病菌為 Penicillium expansum ;所述梨米后青霉病菌為 Penicillium expansum。
[0038]所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的代謝物可從所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的發(fā)酵液中獲得。
[0039]所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6的代謝物具體可按照如下方法制備:在液體培養(yǎng)基(包括YPDJD等能使酵母菌生長的液體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6,除去液體培養(yǎng)物(發(fā)酵液)中的異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6即得到所述異常畢赤酵·母菌(Pichia anomala) YPL6的代謝物。
[0040]本發(fā)明中的異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6對桃釆后褐腐病菌、蘋果釆后灰霉病囷、平果米后青霉病囷和梨米后青霉病囷具有抑制作用；對桃米后掲腐病、平果米后灰霉病、梨米后青霉病、蘋果米后青霉病具有抑制作用。
[0041]生物材料保藏說明
[0042]分類命名:異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)
[0043]菌株編號:YPL6
[0044]保藏機(jī)構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0045]保藏機(jī)構(gòu)簡稱:CGMCC
[0046]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0047]保藏日期:2013年8月16日
[0048]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.8041。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1為異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)，YPL6生長于YNBD 培養(yǎng)基上，280C，48h，“一” 代表 20 μ m。
[0050]圖2為異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6在桃子上對桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)引起的病斑的抑制效果。
[0051]圖3為異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6在蘋果上對蘋果灰霉病菌(Botrytis cinerea)引起的病斑的抑制效果。
[0052]圖4為異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6在蘋果上對青霉病菌(Penicillium expansum)引起的病斑的抑制效果。【具體實(shí)施方式】
[0053]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0054]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0055]下述實(shí)施例中所用到的病原菌，公眾可從野外采集，也可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得:
[0056]桃褐腐病菌一鏈核盤菌(Monilinia fructicola(wint.)Rehm)(王菲等.桃褐腐病的發(fā)生與防治.果樹花卉.2012年第5期p58)； [0057]蘋果采后灰霉病菌一灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr)；
[0058]蘋果米后青霉病菌一展青霉菌(Penicilliumexpansum Link, 1809)；
[0059]梨米后青霉病菌一展青霉菌(Penicilliumexpansum Link, 1809)；
[0060]實(shí)施例1
[0061]本發(fā)明所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的分離與菌株鑒定
[0062]1、樣品采集
[0063]從有中國有機(jī)蘋果園，采集果實(shí)。
[0064]2、菌株的分離篩選及拮抗篩選
[0065]從有機(jī)水果上分離菌株，采用常規(guī)梯度稀釋涂布分離，用PDA (含有硫酸鏈霉素)和YPD瓊脂(含有硫酸鏈霉素)共2種培養(yǎng)基分別在28°C條件下培養(yǎng)，挑取菌落形態(tài)差異較大并可純培養(yǎng)的細(xì)菌，在YB)瓊脂培養(yǎng)基上純化保存，并以蘋果灰霉病菌為靶標(biāo)病原菌進(jìn)行拮抗菌的初篩和多次復(fù)篩，最終得到一株抑菌活性強(qiáng)的酵母菌菌株，命名其為YPL6。
[0066]3、菌株的鑒定
[0067]對菌株Y68進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特性和部分保守序列的分析。參考《TheYeasts,a Taxonomic Study》(Kurtzman, C.P.(1998a).Williopsis Zender.1n TheYeasts, a Taxonomic Study, 4th edn,pp.529-920.Edited by C.P.Kurtzman&J.ff.Fell.Amsterdam:Elsevier.)中描述方法進(jìn)行生理生化測定和分子生物學(xué)鑒定。
[0068]結(jié)果表明，YPL6的形態(tài)學(xué)特征:白色至奶油色的奶油樣菌落，營養(yǎng)體細(xì)胞出芽生殖，有簡單至復(fù)雜的假菌絲。25°C在5%Difco麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基上通過細(xì)胞與芽接合形成子囊孢子，每個(gè)子囊包含1-4個(gè)盔甲狀的子囊孢子。所述異常畢赤酵母菌(Pichiaanomala) YPL6的生理生化特征:可進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵，不可進(jìn)行棉子糖和乳糖發(fā)酵；碳源同化方面:山梨糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、D-甘露醇為陽性，半乳糖、乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖醇、赤蘚糖醇為陰性。所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6于含有5% (質(zhì)量含量)氯化鈉的培養(yǎng)基中均可正常生長，于PH4.0-5.5的培養(yǎng)基中均可正常生長，在環(huán)境溫度為4°C下生長勢弱，在40°C以上不可生長；最佳適宜生長溫度為25-32°C。所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6具有較強(qiáng)的抑菌活性。
[0069]異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6在顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)，如圖1所不，為YPL6生長于YNBD培養(yǎng)基上，280C，48h, “一”代表20 μ m。
[0070]異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的5.8S rDNA基因及ITS1/ITS2核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其26S rDNA基因D1/D2區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0071]實(shí)施例2
[0072]本發(fā)明所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6抑菌譜的測定[0073]供試病原菌:
[0074]桃褐腐病菌一鏈核盤菌(Moniliniafructicola (wint.) Rehm);
[0075]蘋果采后灰霉病菌一灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr)；
[0076]蘋果米后青霉病菌--展青霉菌(Penicilliumexpansum Link, 1809)；
[0077]梨米后青霉病菌一展青霉菌(Penicilliumexpansum Link, 1809)；
[0078]選擇上述病原菌為指示真菌，采用果實(shí)體內(nèi)人為打孔接種生測法(以防治蘋果采后灰霉病為例進(jìn)行說明)。
[0079]具體操作如下:
[0080]果實(shí)體內(nèi)人為打孔接種法為:將病原菌菌株在YPD液體培養(yǎng)基上28°C恒溫培養(yǎng)48h，用蒸餾水調(diào)至菌液濃度為lX108cfu/ml。蘋果灰霉病菌B.cinerea在PDA平板上25°C恒溫培養(yǎng)5-7天，收集灰霉菌孢子，用蒸餾水制成IX 108cfu/ml的孢子懸浮液；成熟的蘋果，先用0.5%次氯酸鈉消毒之后，用滅過菌的移液器槍頭，沿著蘋果腰部插孔，每個(gè)果子扎孔3個(gè)，每個(gè)孔為30mmX 30mm。每孔接種30 μ I YPL6菌液，室溫晾干，然后再接種30 μ I的病原菌孢子懸浮液。最后，處理的果子放置于25°C下，5-7天后，測定果實(shí)腐爛斑大小。腐爛斑小于IOmm被視為不發(fā)病。根據(jù)腐爛病斑的占總接種孔數(shù)的多少，計(jì)算發(fā)病率，未發(fā)病的病斑數(shù)占總接種孔數(shù)的多少，計(jì)算病斑抑制率。
[0081]桃褐腐病菌、蘋果采后青霉病菌和梨采后青霉病菌的操作同上。
[0082]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所述異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6桃采后褐腐病病菌、蘋果采后灰霉病菌、蘋果采后青霉病菌等具有較強(qiáng)的抑制效果。結(jié)果見圖2，圖3，圖4及表1。
[0083]表1.實(shí)驗(yàn)室條件下P.anomala YPL6對不同果實(shí)上病原菌的病斑抑制效果
【權(quán)利要求】
1.一種異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)，菌株為YPL6，保藏號為:CGMCC N0.8041。
2.一種病原菌抑制劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌和/或權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌的代謝物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的病原菌抑制劑，其特征在于，所述病原菌抑制劑對下述至少一種病原菌具有抑制作用: A、桃米后揭腐病囷； B、蘋果采后灰霉病菌； C、蘋果采后青霉病菌； D、梨米后青霉病菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的病原菌抑制劑，其特征在于，所述桃采后褐腐病菌為Monilinia fructicola、Monilinia Iaxa 或 Monilinia fructigena ;所述蘋果米后灰霉病菌為Botrytis cinerea ;所述蘋果采后青霉病菌為Penicillium expansum ;所述梨采后青霉病菌為 Penicillium expansum。
5.一種病害抑制劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌和/或權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌的代謝物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的病害抑制劑，其特征在于，所述病害為下述至少一種: A、桃米后褐腐?。? B、平果米后灰霉?。? C、蘋果米后青霉??； D、梨米后青霉病。
7.權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌和/或權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌的代謝物的下述任一應(yīng)用: 1)權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌和/或權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌的代謝物在抑制病原菌中的應(yīng)用； 2)權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌和/或權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌的代謝物在制備病原菌抑制劑中的應(yīng)用； 3)權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌和/或權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌的代謝物在抑制病害中的應(yīng)用； 4)權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌和/或權(quán)利要求1所述異常畢赤酵母菌的代謝物在制備病害抑制劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病原菌為下述至少一種: A、桃米后揭腐病囷； B、蘋果采后灰霉病菌； C、蘋果采后青霉病菌； D、梨米后青霉病菌； 所述病害為下述至少一種: A、桃米后褐腐??； B、平果米后灰霉??； C、蘋果米后青霉??；D、梨米后青霉病。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述桃釆后褐腐病菌為Moniliniafructicola、Monilinia Iaxa 或 Monilinia fructigena ;所述蘋果米后灰霉病菌為Botrytis cinerea ;所述蘋果釆后青霉病菌為Penicillium expansum ;所述梨釆后青霉病菌為 Penicillium expansum。`
【文檔編號】C12N1/16GK103740603SQ201410036291
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】全利紅 申請人:北京綠環(huán)國際科技有限公司