鑒別11種鴨病毒病的GeXP檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒別11種鴨病毒病的GeXP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定鴨傳染病病原體的GeXP檢測(cè)的引物組，由引物對(duì)A、引物對(duì)B、引物對(duì)C、引物對(duì)D、引物對(duì)E、引物對(duì)F、引物對(duì)G、引物對(duì)H、引物對(duì)I、引物對(duì)J、引物對(duì)K和引物對(duì)L組成；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的引物組、PCR試劑、引物對(duì)，用于同時(shí)鑒別檢測(cè)禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨圓環(huán)病毒，特異性好，靈敏度高。本發(fā)明為常見的主要鴨傳染性疾病病原體的檢測(cè)提供了簡(jiǎn)便、高通量的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)體系，更符合實(shí)際的需要，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說(shuō)明】鑒別11種鴨病毒病的GeXP檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及鑒別11種鴨病毒病的GeXP檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]H5、H7和H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨圓環(huán)病毒是嚴(yán)重危害鴨的11種主要傳染性疾病。隨著養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，鴨傳染性病毒病的發(fā)病率也在逐漸升高，已成為限制養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的一大重要因素。鑒別診斷這些鴨傳染性疾病的傳統(tǒng)方法，主要包括病原分離鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)等，但這些方法常受臨床病料新鮮度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁瑣、費(fèi)時(shí)，對(duì)多重混合感染的鑒別診斷就更為困難。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于這些鴨傳染病的檢測(cè)，并建立了多重PCR檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)幾種病原，但需幾對(duì)引物組合在一起同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)地?cái)U(kuò)增，引物之間會(huì)產(chǎn)生相互干擾，多增加一對(duì)引物，敏感性就越低。PCR產(chǎn)物需通過瓊脂糖電泳才可觀察結(jié)果，該電泳難以區(qū)分50bp-100bp以內(nèi)的條帶，一般只可做到2-4重PCR，難以達(dá)到高通量的檢測(cè)。多重?zé)晒釶CR—般只檢測(cè)到3重，由于探針要標(biāo)記不同發(fā)光波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)，如標(biāo)記太多的熒光基團(tuán)，相互會(huì)產(chǎn)生干擾，因此，也只能檢測(cè)到2-4重。由于在多重PCR反應(yīng)體系中同時(shí)存在幾對(duì)引物，使得形成復(fù)雜引物二聚體的概率大大增加，同時(shí)檢測(cè)的目的基因數(shù)量有限(多在2-4個(gè)基因)，使得多重PCR還達(dá)不到高通量快速檢測(cè)和分析的目的。
[0003]GeXP 系統(tǒng)(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美國(guó)Beckman Coulter公司研發(fā)的用于研究多基因表達(dá)定量分析的平臺(tái)，由兩部分組成:用于設(shè)計(jì)引物的 GeXP expression Profiler 軟件和用于結(jié)果分析的 GenomeLabTM GeXP GeneticAnalysis System毛細(xì)管電泳儀，后者可清晰分離出相差7bp以上的相鄰擴(kuò)增片段。GeXP多重PCR擴(kuò)增采用熒光標(biāo)記通用引物和特異性嵌合引物(即基因特異性引物5’端連接通用引物序列)相結(jié)合引發(fā)多重體系擴(kuò)增。PCR反應(yīng)之初，先由反向特異性嵌合引物與原始模板結(jié)合進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再由正向特異性嵌合引物合成cDNA的第二鏈，此后，由正、反向嵌合引物的特異性序列以cDNA為模板啟動(dòng)PCR反應(yīng)，分別擴(kuò)增出通用引物的互補(bǔ)序列；再由反應(yīng)體系中占主導(dǎo)地位的熒光標(biāo)記通用引物，與其互補(bǔ)序列結(jié)合，引發(fā)后續(xù)擴(kuò)增，通用引物與反應(yīng)體系中帶有熒光標(biāo)記的堿基序列互補(bǔ)，PCR產(chǎn)物經(jīng)GeXP毛細(xì)管電泳分離，含有熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物經(jīng)GeXP檢測(cè)窗口檢測(cè)，依據(jù)檢測(cè)片段與標(biāo)準(zhǔn)分子片段(DNA SizeStandard, DSS)遷移時(shí)間計(jì)算出擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，熒光信號(hào)強(qiáng)度代表該分離片段的擴(kuò)增含量。GeXP系統(tǒng)可在同一個(gè)體系里對(duì)多達(dá)40個(gè)目的基因進(jìn)行有效分析。
[0004]利用GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)，建立一種能同時(shí)鑒別多種病原體的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，關(guān)鍵是設(shè)計(jì)特異性引物，將多重引物組合，利用通用引物，把多重引物的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為I對(duì)通用引物的擴(kuò)增，從而達(dá)到高通量檢測(cè)的目的。目前，還沒有基于GeXP系統(tǒng)的同時(shí)可檢測(cè)鴨源多種傳染性疾病病原體的試劑或試劑盒。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供鑒定或輔助鑒定鴨傳染病病原體的GeXP檢測(cè)引物組。
[0006]本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定鴨傳染病病原體的GeXP檢測(cè)引物組，由單獨(dú)使用的引物對(duì)A、弓丨物對(duì)B、引物對(duì)C、弓丨物對(duì)D、引物對(duì)Edl物對(duì)F、弓丨物對(duì)G、弓丨物對(duì)H、弓丨物對(duì)1、引物對(duì)J、引物對(duì)K和引物對(duì)L組成；
[0007]所述引物對(duì)A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成；
[0008]所述引物對(duì)B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成；
[0009]所述引物對(duì)C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成；
[0010]所述引物對(duì)D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成；
[0011]所述引物對(duì)E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成；
[0012]所述引物對(duì)F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成；
[0013]所述引物對(duì)G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成；`
[0014]所述引物對(duì)H由序列表序列15所示的單鏈DNA和序列表序列16所示的單鏈DNA組成；
[0015]所述引物對(duì)I由序列表序列17所示的單鏈DNA和序列表序列18所示的單鏈DNA組成；
[0016]所述引物對(duì)J由序列表序列19所示的單鏈DNA和序列表序列20所示的單鏈DNA組成；
[0017]所述引物對(duì)K由序列表序列21所示的單鏈DNA和序列表序列22所示的單鏈DNA組成；
[0018]所述引物對(duì)L由序列表序列23所示的單鏈DNA和序列表序列24所示的單鏈DNA組成。
[0019]上述引物組中，所述弓丨物對(duì)A、弓丨物對(duì)B、引物對(duì)C、弓丨物對(duì)D、引物對(duì)Edl物對(duì)F、引物對(duì)G、弓丨物對(duì)H、弓丨物對(duì)1、引物對(duì)J、弓丨物對(duì)K和引物對(duì)L中的各條引物為等摩爾混合；
[0020]所述鴨傳染病病原體為H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和/或鴨圓環(huán)病毒。
[0021]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鑒定或輔助鑒定鴨傳染病病原體的GeXP檢測(cè)PCR試劑。
[0022]本發(fā)明提供的GeXP檢測(cè)PCR試劑，包括上述的引物組。
[0023]上述PCR試劑由PCR擴(kuò)增緩沖液、上述的引物組中的引物對(duì)A_L、MgCl2, DNA聚合酶和水組成；[0024]所述引物對(duì)A-L中的各條引物在所述PCR試劑中的濃度為ΙΟηΜ。
[0025]上述PCR試劑中，
[0026]所述鴨傳染病病原體為H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和/或鴨圓環(huán)病毒。
[0027]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供鑒定或輔助鑒定鴨傳染病病原體的GeXP檢測(cè)試劑盒。
[0028]本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述的PCR試劑。
[0029]上述試劑盒中，所述鴨傳染病病原體為H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和/或鴨圓環(huán)病毒。
[0030]上述的引物組或上述的PCR試劑或上述的試劑盒在制備利用GeXP檢測(cè)鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣本是否含有鴨傳染病病原體的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0031]上述應(yīng)用中，所述鴨傳染病病原體為H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和/或鴨圓環(huán)病毒。
[0032]本發(fā)明所提供的試劑或試劑盒中的引物對(duì)可檢測(cè)的病原體種類分別如下:引物對(duì)A可檢測(cè)16種HA亞型禽流感病毒，即Hl—H16亞型的禽流感病毒；引物對(duì)B可檢測(cè)H5亞型禽流感病毒；引物對(duì)C可檢測(cè)H7亞型禽流感病毒；引物對(duì)D可檢測(cè)H9亞型禽流感病毒；引物對(duì)E可檢測(cè)鴨肝炎病毒；引物對(duì)F可檢測(cè)鴨瘟病毒；引物對(duì)G可檢測(cè)鴨黃病毒；引物對(duì)H可檢測(cè)新城疫病毒；引物對(duì)I可檢`測(cè)減蛋綜合征病毒；引物對(duì)J可檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒；引物對(duì)K可檢測(cè)番鴨細(xì)小病毒；引物對(duì)L可檢測(cè)鴨圓環(huán)病毒。
[0033]所述禽源具體可為雞源或鴨源，但不限于上述病毒的上述來(lái)源。
[0034]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，使用本發(fā)明所提供的基于GeXP系統(tǒng)的試劑或試劑盒中的12種引物對(duì)同時(shí)檢測(cè)禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨圓環(huán)病毒的特異性強(qiáng)，靈敏度分別為10拷貝/μ 1、100拷貝/μ 1、100拷貝/μ 1、100拷貝/μ 1、10拷貝/μ 1、100 拷貝 / μ 1、10 拷貝 / μ 1、10 拷貝 / μ 1、100 拷貝 / μ 1、10 拷貝 / μ 1、100 拷貝 /μ IUOO拷貝/μ 1，與病毒分離和血凝抑制實(shí)驗(yàn)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法的鑒定結(jié)果相比，符合率達(dá)100%。本發(fā)明為常見的主要鴨常見傳染病及其病原體的檢測(cè)提供了簡(jiǎn)便、高通量的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)體系，更符合實(shí)際的需要，應(yīng)用前景廣闊。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1為Η5、Η7、Η9亞型禽流感病毒cDNA混合模板的GeXP十二重PCR的毛細(xì)管電泳分析圖。
[0036]圖2為H5亞型禽流感病毒cDNA、鴨黃病毒cDNA、減蛋綜合征病毒DNA、鴨瘟病毒DNA和新城疫病毒cDNA混合模板的GeXP十二重PCR的毛細(xì)管電泳分析圖。
[0037]圖3為11種鴨傳染性疾病病原的GeXP十二重PCR的毛細(xì)管電泳分析圖。
[0038]圖1-3中，橫坐標(biāo)為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光信號(hào)值?！揪唧w實(shí)施方式】
[0039]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0040]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041]下述實(shí)施例中所用一些材料和試劑如下:
[0042]禽流感病毒毒株:Duck/HK/717/79-dl(H1N3 亞型)、Duck/HK/77/76 (H2N3 亞型)、Duck/HK/526/79/2B (H3N6 亞型)、Duck/HK/668/79 (H4N5 亞型)、Duck/HK/531/79(H6N8 亞型)、Turkey/ont/6118/68 (H8N4 亞型)、Duck/Guangxi/1/00 (H9N2 亞型)、Duck/HK/876/80 (H10N3 亞型)、Duck/HK/661/79 (H11N3 亞型)、Duck/HK/862/80 (H12N5亞型)、Gull/MD/704/77 (H13N5 亞型)均記載在“Zhixun Xie, Yao-shan Pang, JiaboLiu,et al.A multiplex RT-PCR for detection of type A influenza virus anddifferentiation of avian H5, H7, and H9hemagglutinin subtypes”，Molecular andCellular Probes, 2006, 20(3-4): 245-249，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0043]禽流感病毒毒株Duck/HK/313/78 (H5N3 亞型)和 Duck/HK/47/76 (H7N2 亞型)均記載在“同時(shí)鑒別六種雞病毒性呼吸道病GeXP檢測(cè)方法的建立”，病毒學(xué)報(bào)，2013，2 (3):250-257，由香港大學(xué)惠贈(zèng)，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；分別是以cDNA形式留存的樣品，并已經(jīng)HA基因測(cè)序證實(shí)。
[0044]鴨肝炎病毒AV2111株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；
[0045]鴨瘟病毒AV1221株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；
[0046]鴨黃病毒記載在“4株廣西鴨源坦布蘇病毒分離及初步鑒定”，中國(guó)動(dòng)物檢疫，2013，30 (6): 31-35，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0047]新城疫病毒記載在“新城疫植物油乳劑苗的研究”，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，
(04): 23-27，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0048]減蛋綜合癥病毒記載在“減蛋綜合癥植物油乳劑苗的研究”，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，(04):23-27,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0049]番鴨呼腸孤病毒記載在“番鴨花肝病的病原研究”，中國(guó)獸醫(yī)科技，2003，33
(5): 7-9，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0050]番鴨細(xì)小病毒記載在“廣西番鴨細(xì)小病毒的分離和鑒定”，廣西畜牧獸醫(yī)，2002，18 (6): 5-7，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0051]鴨圓環(huán)病毒記載在“廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況調(diào)查”，中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010,37 (11): 156-158，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0052]實(shí)施例1、引物對(duì)的設(shè)計(jì)
[0053]以GenBank公布的引物序列為參考，從NCBI上下載已知序列使用DNASTAR軟件進(jìn)行序列比對(duì)，選取針對(duì)各個(gè)祀基因高度保守與特異的基因片段，由primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)了 12種特異性引物，并在引物的5’端添加GeXP通用引物(下劃線標(biāo)出的序列)，引物方向均為從5’ -3’端，具體如下:
[0054]I)、以禽流感病毒(AIV)M基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)A:
[0055]AIV-F:AGGTGACACTATAGAATACAGAAACGGATGGGAGTGC (序列表序列 I);
[0056]AIV-R: GTACGACTCACTATAGGGATATCAAGTGCAAGATCCCAATGAT (序列表序列 2)；[0057]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為122bp ；
[0058]2)、以H5亞型禽流感病毒(AIV_H5)HA基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)B:
[0059]AIV-H5-F: AGGTGACACTATAGAATACTTCAGGCATCAAAATGCACA (序列表序列 3 序列)；
[0060]AIV-H5-R:GTACGACTCACTATAGGGATAGTTTGTTCATTTCTGAGTCGGTC (序列表序列 4 序列)；
[0061]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為286bp ；
[0062]3)、以H7亞型禽流感病毒(AIV_H7)HA基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)C:
[0063]AIV-H7-F: AGGTGACACTATAGAATAAATGGGGCHTTCATAGCTCC (序列表序列 5 序列)；
[0064]AIV-H7-R: GTACGACTCACTATAGGGATGATAGCARTCRCCTTCACAA (序列表序列 6 序列，其中的R為兼并堿基，代表A或G)；
[0065]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為144bp ；
[0066]4)、以H9亞型禽流感病毒(AIV_H9)HA基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)D:
[0067]AIV-H9-F: AGGTGACACTATAGAATAACAACAAGTGTGACAACAGAAGA (序列表序列 7 序列)；
[0068]AIV-H9-R: GTACGACTCACTATAGGGATCTTCCGTGGCTCTCTCC (序列表序列 8 序列)；
[0069]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度卿目的峰位置)為237bp ；
[0070]5)、以鴨肝炎病毒(DHV) 5’UTR區(qū)域?yàn)榘谢虻囊飳?duì)E:
[0071]DHV-F: AGGTGACACTATAGAATATCTTCGTTGTGAAACGGATTACC (序列表序列 9 序列)；
[0072]DHV-R:GTACGACTCACTATAGGGATGCCTGGACAGATDTGTGCCTACT (序列表序列 10 序列，其中的D為兼并堿基，代表A或G或T)；
[0073]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為133bp ；
[0074]6)、以鴨瘟病毒(DPV)UL6基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)F:
[0075]DPV-F: AGGTGACACTATAGAATAGGGAGGAGCAAACAAAGA (序列表序列 11 序列)；
[0076]DPV-R: GTACGACTCACTATAGGGAATCGCAAATTCCATCACATA (序列表序列 12 序列)；
[0077]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為15 Ibp ;
[0078]7)、以鴨黃病毒(BYD) E基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)G:
[0079]BYD-F: AGGTGACACTATAGAATAATGGACAGGGTCATCAGCGG (序列表序列 13 序列)；
[0080]BYD-R: GTACGACTCACTATAGGGAGAATRGCTCCYGCCAATGCT (序列表序列 14 序列，其中的R為兼并堿基，代表A或G ；Y為兼并堿基，代表C或Τ);
[0081]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為177bp ；
[0082]8)、以新城疫病毒(ND)L基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)H:
[0083]ND-F: AGGTGACACTATAGAATAGTRGCAGCAAGRACAAGG(序列表序列 15 序列，其中的 R 為兼并堿基，代表A或G)；
[0084]ND-R:GTACGACTCACTATAGGGACATATCYGCATACATCAA(序列表序列 16 序列，其中的 Y為兼并堿基，代表C或T)；
[0085]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為196bp ；
[0086]9)、以減蛋綜合征病毒(EDSV)penton基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)1:
[0087]EDSV-F: AGGTGACACTATAGAATAAATCGGCAACTCAAGACATC (序列表序列 17 序列)；
[0088]EDSV-R: GTACGACTCACTATAGGGACCCATTCATAAACAGGATTC (序列表序列 18 序列)；
[0089]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為208bp ；[0090]10)、以番鴨呼腸孤病毒(MDRV)Sl基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)J:
[0091]MDRV-F:AGGTGACACTATAGAATACAGTTGAGCCGGAYGGTAATT (序列表序列 19 序列，其中的Y為兼并堿基，代表C或T)；
[0092]MDRV-R:GTACGACTCACTATAGGGAACTCGGTTGGTGTTAGTVGCVTAGAA (序列表序列 20 序列，其中的V為兼并堿基，代表A或G或C);
[0093]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為218bp ；
[0094]11)、以番鴨細(xì)小病毒(MDPV) VPl基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)L:
[0095]MDPV-F: AGGTGACACTATAGAATACTTTCAGGCTACATCTTCAA (序列表序列 21 序列)；
[0096]MDPV-R: GTACGACTCACTATAGGGAAATTCTCTTTTCACCCATCC (序列表序列 22 序列)；
[0097]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度卿目的峰位置)為253bp ；
[0098]12)、以鴨圓環(huán)病毒(DuCV) REP基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)L:
[0099]DuCV-F:AGGTGACACTATAGAATATGCKCCAAAGAGTCGACATA (序列表序列 23 序列，其中的K為兼并堿基，代表T或G)；
[0100]DuCV-R: GTACGACTCACTATAGGGACAAAYGCATAACGGCTCTTTCC (序列表序列 24 序列，其中的Y為兼并堿基，代表C或T)；
[0101]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(即目的峰位置)為300bp ；
[0102]根據(jù)實(shí)際檢測(cè)的病原體的毒株不同以及GeXP系統(tǒng)如GenomeLabTM GeXP GeneticAnalysis System毛細(xì)管電泳儀的誤差，使用上述引物對(duì)A— L及GeXP通用引物對(duì)檢測(cè)獲得的實(shí)際擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度可在預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度基礎(chǔ)上上下波動(dòng)3bp。
[0103]實(shí)施例2、引物對(duì)的特異性檢測(cè)
[0104]一、模板的制備
[0105]1、病毒RNA提取及cDNA的獲得
[0106]I)病毒RNA提取
[0107]使用DNA/RNA提取試劑盒(均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)為ER201)，按照試劑盒說(shuō)明書，分別以下提取病毒的RNA (以提取陰性鴨胚尿囊液獲得的樣品為陰性對(duì)照樣品):禽流感病毒毒株:Duck/HK/717/79-dl (H1N3亞型)、Duck/HK/77/76 (H2N3亞型)、Duck/HK/526/79/2B (H3N6 亞型)、Duck/HK/668/79 (H4N5 亞型)、Duck/HK/531/79(H6N8 亞型)、Turkey/ont/6118/68 (H8N4 亞型)、Duck/Guangxi/1/00 (H9N2 亞型)、Duck/HK/876/80 (H10N3 亞型)、Duck/HK/661/79 (Hl 1N3 亞型)、Duck/HK/862/80 (H12N5 亞型)、Gull/MD/704/77 (H13N5亞型)；鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒。
[0108]2)cDNA 的獲得
[0109]將步驟I)獲得的RNA樣品分別按照如下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ;以DEPC水作為總RNA的對(duì)照。
[0110]反應(yīng)體系(20μ L):5 X Reverse Transcriptase Buffer4 μ L, Random Primer (9mer) 50pmol >dNTP Mixture (IOmM) 2 μ L, Ribonuclease Inhibitor20U, AMV ReverseTranscriptase,模板 RNAl μ g,DEPC水補(bǔ)足至20 μ L。
[0111]用反轉(zhuǎn)錄試劑Random Primer (9mer)、dNTP Mixture、Ribonuclease Inhibitor、Reverse Transcriptase XL(AMV)(均購(gòu)自大連TaKaRa公司，目錄號(hào)分別為 D3802、D4030RA、D2313A、D2620)。[0112]反應(yīng)條件:抽提的總RNA加完DEPC水和Random Primer (9mer)后，瞬離，70°C IOmin后立即冰浴5min。加完其余四樣后，瞬離，42°C 1.5h，置于_20°C保存。
[0113]3)禽流感病毒毒株 Duck/HK/313/78 (H5N3 亞型)和 Duck/HK/47/76 (H7N2 亞型)分別是以cDNA形式留存的樣品，并已經(jīng)HA基因測(cè)序證實(shí)。
[0114]2、基因組DNA的提取
[0115]使用DNA/RNA提取試劑盒(均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)為ER201)，按照試劑盒說(shuō)明書，分別從減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒提取病毒基因組DNA (以提取陰性鴨胚尿囊液獲得的樣品為陰性對(duì)照樣品)。
[0116]3、測(cè)定核酸含量
[0117]用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測(cè)定其OD值,得出其濃度與純度值,并以此控制核酸質(zhì)量。
[0118]二、各引物對(duì)單重PCR的特異性檢測(cè)
[0119]1、引物對(duì)A的特異性檢測(cè)
[0120]I) PCR 擴(kuò)增
[0121]用引物對(duì)A 對(duì)步驟一中 I 獲得的 Duck/HK/717/79-dl(HlN3 亞型)、Duck/HK/77/76(H2N3 亞型)、Duck/HK/526/79/2B (H3N6 亞型)、Duck/HK/668/79 (H4N5 亞型)、Duck/HK/531/79 (H6N8 亞型)、Turkey/ont/6118/68 (H8N4 亞型)、Duck/Guangxi/1/00 (H9N2 亞型)、Duck/HK/876/80 (H10N3 亞型)、Duck/HK/661/79 (Hl 1N3 亞型)、Duck/HK/862/80 (H12N5亞型)、Gull/MD/704/77 (H13N5 亞型)及 Duck/HK/313/78 (H5N3 亞型)和 Duck/HK/47/76(H7N2亞型)13種HA亞型禽流感病毒毒`株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下:
[0122]反應(yīng)體系(20μL):GenomeLabTM GeXP Start Kit5XPCR Buffer (含 GeXP 通用引物對(duì)，美國(guó)貝克曼公司，PN A85017)4yL,引物對(duì)A (每條引物在反應(yīng)體系中的終濃度為 10nM)、25mM MgCl24y L(美國(guó)貝克曼公司，PN A25395)、JumpStart Taq DNAPolymerasel.4 μ L (美國(guó) SIGMA 公司,D4184),模板 cDNA 或 DNA0.5pg_0.5 μ g,加滅菌水至20 μ L0每個(gè)cDNA/DNA設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
[0123]反應(yīng)程序:95°C30s, 55°C 30s,72°C 30s，10 個(gè)循環(huán)；95°C 30s,63°C 30s, 72°C 30s,10 個(gè)循環(huán)；95°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s, 20 個(gè)循環(huán)；4°C終止。
[0124]2)毛細(xì)管電泳
[0125]使用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對(duì)步驟I)的各PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，操作步驟如下:用甲酰胺為上樣緩沖液(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，目錄編號(hào)608082)，DNA size standard Kit_400Base Pairs (美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，目錄編號(hào)608098)與上樣緩沖液按體積比1: (80-160)徹底混勻，在樣品板上每孔加入39 μ L混勻好的液體，用PCR產(chǎn)物進(jìn)行10-100倍稀釋，取稀釋后的產(chǎn)物I μ L加至樣品板，吹打混勻，最后在每孔滴入一滴石蠟油封閉，以免甲酰胺氧化和樣品蒸發(fā)。在緩沖液板上每孔加入2/3的緩沖液，進(jìn)行毛細(xì)管電泳。毛細(xì)管電泳的條件如下:毛細(xì)管升溫--溫度50°C;變性:90°C，120s ;注入樣品:2.0KV, 30s ;分離:6.0KV，35min。利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)分析檢測(cè)結(jié)果。[0126]結(jié)果:13種HA亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品均可擴(kuò)增得到120bp_123bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，13種亞型擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為122bp，該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)A的靶序列；非禽流感病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)A的特異性很好，可特異檢出13種HA亞型(Hl—H13亞型)的禽流感病毒。另外，將引物對(duì)A的序列與H14、H15、H16亞型禽流感病毒的RNA序列進(jìn)行NCBI BLASA比對(duì)，同源性很高，如引物對(duì)A的序列與 H14N6 (登錄號(hào):CY005394)、H14N5 (登錄號(hào)為:CY014605)、H14N5 (登錄號(hào)為:⑶052253)、H15N9 (登錄號(hào) CY077617)、H15N6 (登錄號(hào)為:⑶052261)、H15N9 (登錄號(hào)為:CY005406)、H16N3 (登錄號(hào)為:HM060055)的靶引物序列同源性均為100.00%，說(shuō)明引物對(duì)A也可檢出H14、H15、H16亞型禽流感病毒。
[0127]2、引物對(duì)B的特異性檢測(cè)
[0128]I) PCR 擴(kuò)增
[0129]用引物對(duì)B對(duì)步驟一中I的H5亞型(H5N3)禽流感病毒毒株的cDNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H7N2和H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0130]2)毛細(xì)管電泳
[0131]與步驟I中2)方法相同。
[0132]結(jié)果:2種H5亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品可擴(kuò)增得到285— 287bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，H5N3的擴(kuò)增`產(chǎn)物大小為286bp ;擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)B的靶序列；非H5亞型禽流感病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)B的特異性很好，可以特異檢出H5亞型禽流感病毒。
[0133]3、引物對(duì)C的特異性檢測(cè)
[0134]I) PCR 擴(kuò)增
[0135]用引物對(duì)C對(duì)步驟一中I的H7亞型(H7N2)禽流感病毒毒株的cDNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3和H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0136]2)毛細(xì)管電泳
[0137]與步驟I中2)方法相同。
[0138]結(jié)果:H7亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品可擴(kuò)增得到142— 145bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，H7N2的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為144bp，該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)C的靶序列；非!17亞型禽流感病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)C的特異性很好，可以特異檢出H7亞型禽流感病毒。
[0139]4、引物對(duì)D的特異性檢測(cè)
[0140]I) PCR 擴(kuò)增
[0141]用引物對(duì)D對(duì)步驟一中I的H9亞型(H9N2)禽流感病毒毒株的cDNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3和H7N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0142]2)毛細(xì)管電泳
[0143]與步驟I中2)方法相同。
[0144]結(jié)果:H9亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品可擴(kuò)增得到236_239bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，H9N2的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為237bp，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)D的靶序列；非!19亞型禽流感病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)D的特異性很好，可以特異檢出H9亞型禽流感病毒。
[0145]5、引物對(duì)E的特異性檢測(cè)
[0146]I) PCR 擴(kuò)增
[0147]用引物對(duì)E對(duì)步驟一中2的鴨肝炎病毒的cDNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3、H7N2和H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品， 以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0148]2)毛細(xì)管電泳
[0149]與步驟I中2)方法相同。
[0150]結(jié)果:鴨肝炎病毒的cDNA樣品可擴(kuò)增得到132— 135bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，鴨肝炎病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為133bp ;該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)E的靶序列；非鴨肝炎病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)E的特異性很好，可以特異檢出鴨肝炎病毒。
[0151]6、引物對(duì)F的特異性檢測(cè)
[0152]I) PCR 擴(kuò)增
[0153]用引物對(duì)F對(duì)步驟一中2的鴨瘟病毒的DNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3、H7N2、H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0154]2)毛細(xì)管電泳
[0155]與步驟I中2)方法相同。
[0156]結(jié)果:鴨瘟病毒的DNA樣品可擴(kuò)增得到150— 153bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，鴨瘟病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為151bp ;該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)F的靶序列；非鴨瘟病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)F的特異性很好，可以特異檢出鴨瘟病毒。
[0157]7、引物對(duì)G的特異性檢測(cè)
[0158]I) PCR 擴(kuò)增
[0159]用引物對(duì)G對(duì)步驟一中2的鴨黃病毒的cDNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3、H7N2和H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0160]2)毛細(xì)管電泳
[0161]與步驟I中2)方法相同。
[0162]結(jié)果:鴨黃病毒的cDNA樣品可擴(kuò)增得到175— 178bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，鴨黃病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為176bp ;該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)G的靶序列；非鴨黃病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)G的特異性很好，可以特異檢出鴨黃病毒。
[0163]8、引物對(duì)H的特異性檢測(cè)
[0164]I) PCR 擴(kuò)增
[0165]用引物對(duì)H對(duì)步驟一中2的新城疫病毒的cDNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3、H7N2和H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0166]2)毛細(xì)管電泳
[0167]與步驟I中2)方法相同。
[0168]結(jié)果:新城疫病毒的cDNA樣品可擴(kuò)增得到195— 198bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，新城疫病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為196bp ;該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)H的靶序列；非新城疫病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物`。結(jié)果表明，引物對(duì)H的特異性很好，可以特異檢出新城疫病毒。
[0169]9、引物對(duì)I的特異性檢測(cè)
[0170]I) PCR 擴(kuò)增
[0171]用引物對(duì)I對(duì)步驟一中2的減蛋綜合癥病毒的DNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3、H7N2和H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0172]2)毛細(xì)管電泳
[0173]與步驟I中2)方法相同。
[0174]結(jié)果:減蛋綜合癥病毒的DNA樣品可擴(kuò)增得到207— 210bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，減蛋綜合癥病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為208bp ;該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)I的靶序列；非減蛋綜合癥病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)I的特異性很好，可以特異檢出減蛋綜合癥病毒。
[0175]10、引物對(duì)J的特異性檢測(cè)
[0176]I) PCR 擴(kuò)增
[0177]用引物對(duì)J對(duì)步驟一中2的番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3、H7N2和H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性番鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0178]2)毛細(xì)管電泳
[0179]與步驟I中2)方法相同。
[0180]結(jié)果:番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品可擴(kuò)增得到218—221bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，番鴨呼腸孤病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為218bp ;該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)J的靶序列；非番鴨呼腸孤病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)J的特異性很好，可以特異檢出番鴨呼腸孤病毒。
[0181]12、引物對(duì)K的特異性檢測(cè)
[0182]I) PCR 擴(kuò)增
[0183]用引物對(duì)K對(duì)步驟一中2的番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3、H7N2和H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒和鴨圓環(huán)病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性番鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0184]2)毛細(xì)管電泳
[0185]與步驟I中2)方法相同。
[0186]結(jié)果:番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品可擴(kuò)增得到252— 255bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，:番鴨細(xì)小病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為253bp ;該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)K的靶序列；非番鴨細(xì)小病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)K的特異性很好，可以特異檢出
番鴨細(xì)小病毒。`
[0187]12、引物對(duì)L的特異性檢測(cè)
[0188]I) PCR 擴(kuò)增
[0189]用引物對(duì)L對(duì)步驟一中2的鴨圓環(huán)病毒的DNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的H5N3、H7N2和H9N2亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合癥病毒、鴨瘟病毒和番鴨細(xì)小病毒的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。
[0190]2)毛細(xì)管電泳
[0191]與步驟I中2)方法相同。
[0192]結(jié)果:鴨圓環(huán)病毒的DNA樣品可擴(kuò)增得到299— 302bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，鴨圓環(huán)病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為300bp ;該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對(duì)L的靶序列；非鴨圓環(huán)病毒及陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對(duì)L的特異性很好，可以特異檢出鴨圓環(huán)病毒。
[0193]三、十二種引物對(duì)混合的特異性檢測(cè)
[0194]1MM4_^A、B、C、D、E、F、G、H、1、J、K^P L 同時(shí)加入同一個(gè) PCR 反應(yīng)體系，分別
對(duì)步驟一獲得的I種H5亞型禽流感病毒毒株、I種H7亞型禽流感病毒毒株、I種H9亞型禽流感病毒毒株、鴨肝炎病毒、鴨黃病毒、番鴨呼腸孤病毒的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒的cDNA或DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以步驟一獲得的陰性鴨胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下:
[0195]反應(yīng)體系(20μL):GenomeLabTM GeXP Start Kit5XPCR Buffer (含 GeXP 通用引物對(duì)，美國(guó)貝克曼公司，PN A85017)4yL,引物對(duì)A、B、C、D、E、F、G、H、I和J (各引物對(duì)中的每條引物在反應(yīng)體系中的終濃度均為10nM)、25mM MgCl24 μ L(美國(guó)貝克曼公司，PNΑ25395)、JumpStart Taq DNA Polymerasel.4 μ L (美國(guó) SIGMA 公司，D4184),模板 cDNA 或DNA0.5pg-0.5 μ g,加滅菌水至20 μ L。每個(gè)cDNA/DNA設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
[0196]反應(yīng)程序:95°C30s, 55°C 30s，72°C 30s，10 個(gè)循環(huán)；95°C 30s，63°C 30s, 72°C 30s,10 個(gè)循環(huán)；95°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s, 20 個(gè)循環(huán)；4°C終止。
[0197]2)毛細(xì)管電泳:與“步驟二”中的“步驟I中2)”相同。
[0198]結(jié)果:十二種引物對(duì)A-L混合后分別對(duì)11種病原體(H5、H7和H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨圓環(huán)病毒)的單一 cDNA或DNA樣品檢測(cè)，分別檢出了 122bp和286bp、122bp和 144bp、122bp 和 237bp、133bp、150bp、176bp、196bp、208bp、218bp、253bp 和 300bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0199]上述結(jié)果表明:引物對(duì)A— L混合后對(duì)各引物對(duì)的特異性無(wú)影響，可用于特異地檢出禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨圓環(huán)病毒的每種病原體。
[0200]因此，引物對(duì)Α-L、含有引物對(duì)A-L的PCR試劑或含有引物對(duì)A-L的PCR試劑盒均可用來(lái)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行GeXP檢測(cè)，從而判斷待測(cè)樣本是否含有禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒或鴨圓環(huán)病毒；
[0201]每20yL PCR 試劑由 5XPCR Buffer、引物對(duì) A_L、25mM MgCl2 (終濃度為 5mM/μ L)4y L.Taq DNA聚合酶1.4 μ L (終濃度為0.175unit/μ L);模板cDNA或DNA，其余為滅菌水。
[0202]通過如下判斷待測(cè)樣本是否含有對(duì)應(yīng)的病毒:
[0203]若引物對(duì)A的擴(kuò)增產(chǎn)物為120— 123bp且引物對(duì)B的擴(kuò)增產(chǎn)物為285— 287bp，則
待測(cè)樣本中含有H5亞型禽流感病毒；
[0204]若引物對(duì)A的擴(kuò)增產(chǎn)物為120— 123bp且引物對(duì)C的擴(kuò)增產(chǎn)物為142— 145bp，則
待測(cè)樣本中含有H7亞型禽流感病毒；
[0205]若引物對(duì)A的擴(kuò)增產(chǎn)物為120— 123bp且引物對(duì)D的擴(kuò)增產(chǎn)物為236_239bp，則待
測(cè)樣本中含有H9亞型禽流感病毒；
[0206]若引物對(duì)E的擴(kuò)增產(chǎn)物為132— 135bp，則待測(cè)樣本中含有鴨肝炎病毒；
[0207]若引物對(duì)F的擴(kuò)增產(chǎn)物為150— 153bp，則待測(cè)樣本中含有鴨瘟病毒；
[0208]若引物對(duì)G的擴(kuò)增產(chǎn)物為175— 178bp，則待測(cè)樣本中含有鴨黃病毒；
[0209]若引物對(duì)H的擴(kuò)增產(chǎn)物為195— 198bp，則待測(cè)樣本中含有新城疫病毒；
[0210]若引物對(duì)I的擴(kuò)增產(chǎn)物為207— 210bp，則待測(cè)樣本中含有減蛋綜合癥病毒；
[0211]若引物對(duì)J的擴(kuò)增產(chǎn)物為218 — 221bp，則待測(cè)樣本中含有番鴨呼腸孤病毒；
[0212]若引物對(duì)K的擴(kuò)增產(chǎn)物為252— 255bp，則待測(cè)樣本中含有番鴨細(xì)小病毒；
[0213]若引物對(duì)L的擴(kuò)增產(chǎn)物為299— 302bp，則待測(cè)樣本中含有鴨圓環(huán)病毒。[0214]實(shí)施例3、引物對(duì)的靈敏度檢測(cè)
[0215]一、制備含靶基因的單克隆質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和H7亞型禽流感病毒
[0216]分別以實(shí)施例2中步驟一獲得的H5亞型禽流感病毒Duck/HK/313/78( H5N3亞型)、H7亞型禽流感病毒Duck/HK/47/76 (H7N2亞型)、H9亞型禽流感病毒Duck/Guangxi/1/OO(H9N2亞型)、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨圓環(huán)病毒的cDNA或DNA樣品為模板，將PCR擴(kuò)增獲得的禽流感病毒M基因、H5亞型禽流感病毒HA基因、H7亞型禽流感病毒HA基因、H9亞型禽流感病毒HA基因、鴨肝炎病毒5’ UTR區(qū)域基因、鴨瘟病毒UL6基因、鴨黃病毒E基因、新城疫病毒L基因、減蛋綜合征病毒penton基因、番鴨呼腸孤病毒SI基因、番鴨細(xì)小病毒VPl基因和鴨圓環(huán)病毒REP基因的全長(zhǎng)cDNA或DNA片段，分別與質(zhì)粒pMD18_T vector連接(購(gòu)自大連寶生物公司)連接，獲得十二種重組質(zhì)粒PA、PB、PC、PD、PE、PF、PG、PH、P1、PJ、PKjP PL，經(jīng)測(cè)序證實(shí)這十二種重組質(zhì)粒為質(zhì)粒PMD18-T vector分別插入了一種上述基因的重組質(zhì)粒，且分別可作為上述12種引物對(duì)A— L的靶基因。
[0217]利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各含靶基因重組質(zhì)粒的濃度，并根據(jù)重組質(zhì)粒的分子量和濃度計(jì)算相應(yīng)的拷貝數(shù)。將高濃度的各重組質(zhì)粒分別稀釋成靶基因濃度為106、105、104、103、IO2UO1拷貝/ μ L的單一質(zhì)粒稀釋液。將各重組質(zhì)?；旌希瞥稍诨旌先芤褐懈髻|(zhì)粒的濃度均為IO5拷貝/ μ L的混合液，再按10倍比稀釋為ΙΟ4、103、IO2拷貝/ μ L的混合質(zhì)粒稀釋液。
[0218]二、十種引物對(duì) 混合的靈敏度檢測(cè)
[0219]1.以引物對(duì)A— L混合為引物，不同濃度的不同單一質(zhì)粒稀釋液為模板，按照實(shí)施例2中步驟三的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)；結(jié)果，檢測(cè)禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/μ L，檢測(cè)Η5亞型禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測(cè)Η7亞型禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)Η9亞型禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)鴨肝炎病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測(cè)鴨瘟病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)鴨黃病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測(cè)新城疫病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測(cè)減蛋綜合癥病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測(cè)番鴨細(xì)小病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)鴨圓環(huán)病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L0
[0220]2.以引物對(duì)A— L混合為引物，不同濃度的混合十種質(zhì)粒稀釋液為模板，按照實(shí)施例2中步驟三的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)；結(jié)果，檢測(cè)禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/μ L，檢測(cè)Η5亞型禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)Η7亞型禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)Η9亞型禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)鴨肝炎病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測(cè)鴨瘟病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)鴨黃病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測(cè)新城疫病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)減蛋綜合癥病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測(cè)番鴨細(xì)小病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L,檢測(cè)鴨圓環(huán)病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L。
[0221 ] 實(shí)施例4、引物對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確率
[0222]一、十二種引物對(duì)混合檢測(cè)的準(zhǔn)確率
[0223]分別取經(jīng)HA基因測(cè)序鑒定為Η5亞型禽流感病毒Duck/HK/313/78 (H5N3亞型)和H7亞型禽流感病毒Duck/HK/47/76 (H7N2亞型)的cDNA樣品；經(jīng)病毒分離、血凝抑制試驗(yàn)、中和試驗(yàn)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法分別鑒定為H9亞型禽流感病毒Duck/Guangxi/1/00 (H9N2亞型)、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨圓環(huán)病毒(按照實(shí)施例2中步驟一的方法分別提取cDNA或DNA)，按照實(shí)施例2中步驟三的方法分別對(duì)上述單一病原體的cDNA或DNA樣品、上述病原體模擬臨床感染的樣品、上述11種病原體cDNA或DNA樣品的混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，具體結(jié)果如下:
[0224]1、11種單一病毒的cDNA或DNA樣品均可檢出相應(yīng)病毒的目的峰,無(wú)其他雜峰,與上述測(cè)序、病毒分離、血凝抑制試驗(yàn)、中和試驗(yàn)和PCR等常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法的檢測(cè)結(jié)果相符合。
[0225]2、模擬臨床感染
[0226]從上述11種病原體的cDNA或DNA樣品中隨機(jī)選擇若干種病原體的cDNA或DNA混合，分如下兩組試驗(yàn):
[0227]第I組:H5N3亞型、H7N2亞型和H9N2亞型禽流感病毒的cDNA混合作為模板，
[0228]第2組:鴨瘟病毒的DNA、鴨黃病毒的cDNA、新城疫病毒的cDNA、減蛋綜合癥病毒的DNA和H5N3亞型禽流感病毒的cDNA混合作為模板；
[0229]經(jīng)實(shí)施例2中步驟三的方法檢測(cè)，第I組可檢出122.14bp和144.92,122.14bp和237.21、122.14bp和285.73四個(gè)目的峰(圖1)，表明樣品中含有H5、H9和H7亞型禽流感病毒的模板，與實(shí)際相符；第2組可檢出122.13bp和285.75bp、150.53bp、176.43bp、196.68bp和208.91bp五個(gè)目的峰，無(wú)其他雜峰，表明樣品中含有H5亞型禽流感病毒的cDNA、鴨瘟病毒的DNA、鴨黃病毒的cDNA、新城疫病毒的cDNA和減蛋綜合癥病毒的DNA的模板(圖2),與實(shí)際相符。
[0230]3、11種病原體混合
`[0231]可檢出12個(gè)目的峰(圖3)，無(wú)其他雜峰，表明檢測(cè)樣品中含有H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨圓環(huán)病毒的全部病原體的cDNA或DNA模板，與實(shí)際相符。
【權(quán)利要求】
1.鑒定或輔助鑒定鴨傳染病病原體的GeXP檢測(cè)引物組，由單獨(dú)使用的引物對(duì)A、引物對(duì)B、引物對(duì)C、引物對(duì)D、引物對(duì)Edl物對(duì)F、引物對(duì)G、引物對(duì)H、引物對(duì)1、引物對(duì)J、引物對(duì)K和引物對(duì)L組成； 所述引物對(duì)A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)H由序列表序列15所示的單鏈DNA和序列表序列16所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)I由序列表序列17所示的單鏈DNA和序列表序列18所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)J由序列表序列19所 示的單鏈DNA和序列表序列20所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)K由序列表序列21所示的單鏈DNA和序列表序列22所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)L由序列表序列23所示的單鏈DNA和序列表序列24所示的單鏈DNA組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于:所述引物對(duì)A、引物對(duì)B、引物對(duì)C、引物對(duì)D、引物對(duì)Edl物對(duì)F、引物對(duì)G、引物對(duì)H、弓丨物對(duì)1、引物對(duì)】、引物對(duì)K和引物對(duì)L中的各條引物為等摩爾混合； 所述鴨傳染病病原體為H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和/或鴨圓環(huán)病毒。
3.鑒定或輔助鑒定鴨傳染病病原體的GeXP檢測(cè)PCR試劑，包括權(quán)利要求1或2所述的引物組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PCR試劑，其特征在于: 所述PCR試劑由PCR擴(kuò)增緩沖液、權(quán)利要求1或2所述的引物組中的引物對(duì)A-L、MgCl2、DNA聚合酶和水組成； 所述引物對(duì)A-L中的各條引物在所述PCR試劑中的濃度為ΙΟηΜ。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的PCR試劑，其特征在于: 所述鴨傳染病病原體為H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和/或鴨圓環(huán)病毒。
6.鑒定或輔助鑒定鴨傳染病病原體的GeXP檢測(cè)試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3-5中任一所述的PCR試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于:所述鴨傳染病病原體為H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和/或鴨圓環(huán)病毒。
8.權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3-5中任一所述的PCR試劑或權(quán)利要求6或7所述的試劑盒在制備利用GeXP檢測(cè)鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣本是否含有鴨傳染病病原體的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述鴨傳染病病原體為H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨黃病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、番鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和/或鴨圓環(huán)病毒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103773899SQ201410037453
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】謝芝勛, 張艷芳, 謝麗基, 劉加波, 龐耀珊, 范晴, 羅思思, 鄧顯文, 謝志勤 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所