鼠灰鏈霉菌amp脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法。該方法以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，設計特異性引物擴增AMP脫氨酶基因序列，在其兩端分別引入酶切位點，并亞克隆入表達載體pKLAC1構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，酶切線性化后電轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，再利用pKLAC1通用引物篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子，最后經(jīng)種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產(chǎn)物。本發(fā)明首次在乳酸克魯維酵母中成功表達了鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶，實驗結(jié)顯示該重組酶具有較高的酶活，且酶活性穩(wěn)定，可應用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
【專利說明】鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及AMP脫氨酶基因的真核表達，具體涉及一種鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法及其表達產(chǎn)物的應用，屬于分子生物學【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]AMP脫氨酶,英文名為AMP deaminase,簡寫為AMPD,是一種氨基水解酶,其可催化AMP使其脫去氨基生成肌苷酸(IMP)和NH3，IMP在食品以及制藥等領(lǐng)域中有重要應用。另外，AMP脫氨酶是嘌呤核苷酸代謝循環(huán)中的三種主要酶類之一，對于維持機體免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脫氨酶是工業(yè)生產(chǎn)中一種重要的酶。
[0003]AMP脫氨酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)。其最早由鼠骨骼肌制備，隨后又由人紅血細胞制備，目前工業(yè)化生產(chǎn)中通常由酵母、霉菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶，但是在酶的提取純化、酶活性以及穩(wěn)定性等方面存在諸多問題。因此，利用DNA重組技術(shù)，將微生物來源的AMP脫氨酶基因在特定宿主中進行重組表達，可以有效改善上述問題。現(xiàn)在國內(nèi)關(guān)于AMP脫氨酶基因重組表達的研究從未報道過，國外關(guān)于該酶的重組表達的研究較少，僅在申請?zhí)枮镃N200580013789.3的專利“放線菌來源的AMP脫氨酶及其應用”( 申請人::天野酶株式會社)中報道過一次。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本 申請人:經(jīng)過研究改進，提供一種鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法。本發(fā)明首次在乳酸克魯維酵母中成功表達了鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶，實驗結(jié)顯示該重組酶具有較高的酶活，且酶活性穩(wěn)定。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法，是以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，設計特異性引物擴增AMP脫氨酶基因序列，在其兩端分別引入酶切位點，并亞克隆入表達載體pKLACl構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，酶切線性化后電轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，再利用PKLACl通用引物篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子，最后經(jīng)種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產(chǎn)物。
[0007]具體的，所述方法步驟如下:
[0008]( I)鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的克隆
[0009]以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，以序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2的引物對通過PCR特異性擴增AMP脫氨酶基因，在其兩端分別引入XhoI和BglII酶切位點，純化回收PCR產(chǎn)物；
[0010](2)重組表達載體的構(gòu)建
[0011]將表達載體pKLACl和步驟(1)所得PCR產(chǎn)物分別用XhoI和BglII雙酶切，連接所得酶切純化產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化E.coli JM109，篩選陽性克隆菌株；
[0012](3)線性化重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選
[0013]提取步驟(2)所得陽性克隆菌株質(zhì)粒，經(jīng)BstXI線性化后電轉(zhuǎn)化Kluyveromyceslactis GG799，使用步驟(1)所述引物對篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，再利用pKLACl通用引物進行PCR篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子；
[0014](4)重組酶在GG799中的表達
[0015]將步驟(3)篩選到的多拷貝轉(zhuǎn)化子接種至YPD培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)，再以體積比2%的接種量接種至YPD培養(yǎng)基，于30°C、200r/min條件下進行液體發(fā)酵培養(yǎng)120h，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產(chǎn)物。
[0016]優(yōu)選地，步驟(1)所述鼠灰鏈霉菌選自鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)MCCCN0.1A01641。
[0017]本發(fā)明還提供了上述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法制備得到的AMP脫氨酶表達產(chǎn)物在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應用。
[0018]本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于:
[0019]本發(fā)明首次以鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因組為模板，通過重組載體pKLACl-AMPD的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，陽性克隆轉(zhuǎn)化子和多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選，液體發(fā)酵等步驟及其工藝條件參數(shù)的精心分析和優(yōu)化，在乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis GG79)中成功表達了鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶。 實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明制備得到的重組AMP脫氨酶具有較高的酶活，且酶活性穩(wěn)定，為AMP脫氨酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎，可應用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為實施例2中重組表達載體pKLACl-AMPD酶切驗證電泳圖。
[0021]圖2為實施例4中Kluyveromyces lactis GG79重組菌不同發(fā)酵時間的酶活變化趨勢圖。
【具體實施方式】
[0022]以下結(jié)合附圖，并通過實施例對本發(fā)明進行具體說明。
[0023]以下實施例所涉及實驗材料如下:
[0024]菌株:鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)，保藏編號 MCCC N0.1A01641，以下簡稱鼠灰鏈霉菌 MCCC1A01641 ；E.coli JM109購自大連寶生物工程有限公司；Kluyveromyces lactisGG799、pKLACl均購自New EnglandBiolabs 公司。
[0025]所涉及其他試劑及試劑盒均為國產(chǎn)或進口商品。
[0026]實施例1鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的克隆
[0027]以鼠灰鏈霉菌MCCC1A01641基因組為模板，設計引物對AMPDF3/AMPDR3特異性擴增鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因，在其兩端分別加入XhoI酶切位點和BglII酶切位點，引物對AMPDF3/AMPDR3 序列如下:AMPDF3: B，-GTTCTCGAG AAAAGA GCGCCGCCGCCCCGGCAG-3，(SEQID NO:1) ；AMPDR3:5，-GAAGATCTTCACCCCCGGGCGTGCGCCC-3> (SEQ ID NO:2)；
[0028]純化回收PCR產(chǎn)物。[0029]實施例2重組表達載體pKLACl-AMPD的構(gòu)建
[0030]將載體pKLACl和實施例1所得PCR產(chǎn)物分別用XhoI和BglII雙酶切，切膠回收純化，酶切產(chǎn)物于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109，提取pKLACl-AMPD-JM109菌株質(zhì)粒，用XhoI和BglII雙酶切驗證，篩選出PKLAC1-AMPD-JM109陽性菌株。重組表達載體pKLACl-AMPD酶切驗證電泳圖如圖1所示。
[0031]實施例3線性化質(zhì)粒pKLACl-AMPD對GG799的電轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選
[0032]提取實施例2所得pKLACl-AMPD-JM109陽性菌株質(zhì)粒，經(jīng)BstXI線性化后電轉(zhuǎn)化Kluyveromyces lactis GG799,涂布YCB平板,于3~5天后挑取單菌落檢測,通過蝸牛酶法提取重組子染色體基因組，使用特異性引物AMPDF3/AMPDR3進行PCR驗證，從而得到陽性克隆轉(zhuǎn)化子；然后利用PKLACl載體自帶的通用引物進行PCR以篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子，所述通用引物序列如表1所示:
[0033]表lpKLACl載體通用弓丨物序列
[0034]
【權(quán)利要求】
1.鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法，其特征在于:以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，設計特異性引物擴增AMP脫氨酶基因序列，在其兩端分別引入酶切位點，并亞克隆入表達載體pKLACl構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，酶切線性化后電轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，再利用PKLACl通用引物篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子，最后經(jīng)種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法，其特征在于具體步驟如下: (1)鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的克隆 以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，以序列為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2的引物對通過PCR特異性擴增AMP脫氨酶基因，在其兩端分別引入XhoI和BglII酶切位點，純化回收PCR產(chǎn)物； (2)重組表達載體的構(gòu)建 將表達載體PKLACl和步驟(1)所得PCR產(chǎn)物分別用XhoI和BglII雙酶切，連接所得酶切純化產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化E.coli JM109，篩選陽性克隆菌株； (3)線性化重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選 提取步驟(2)所得陽性克隆菌株質(zhì)粒，經(jīng)BstXI線性化后電轉(zhuǎn)化Kluyveromyceslactis GG799， 使用步驟(1)所述引物對篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，再利用pKLACl通用引物進行PCR篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子； (4)重組酶在GG799中的表達 將步驟(3)篩選到的多拷貝轉(zhuǎn)化子接種至YPD培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)，再以體積比2%的接種量接種至YPD培養(yǎng)基，于3(TC、200r/min條件下進行液體發(fā)酵培養(yǎng)120h，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法，其特征在于:步驟(1)所述鼠灰鏈霉菌選自鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus) MCCCN0.1A01641。
4.權(quán)利要求1~3任一項所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的乳酸克魯維酵母真核表達方法制備得到的AMP脫氨酶表達產(chǎn)物在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應用。
【文檔編號】C12N15/81GK103757035SQ201410040528
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】張梁, 石貴陽, 方煒, 丁重陽, 顧正華 申請人:江南大學