乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，包括檢測Foxp3、FGFR2、CD14、BRCA1基因所對應(yīng)的5個(gè)SNP多態(tài)性檢測。本發(fā)明還公開一種乳腺癌易感基因快速檢測方法。本發(fā)明的有益效果如下：通過半巢式AS-PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)DNA電泳條帶進(jìn)行基因分型，篩選出具有潛在乳腺癌易感的個(gè)體，從而達(dá)到預(yù)防乳腺癌的目的；此方法操作簡便，檢測時(shí)間短、成本低，此外還具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物基因檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]乳 腺癌(Breast cancer)被稱之為女性殺手，發(fā)病率僅次于肺癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心發(fā)布的癌癥報(bào)告(GL0B0CAN2008)估計(jì)，全世界每年約有138萬婦女罹患乳腺癌，約有54萬乳腺癌患者死亡。2008年中國女性乳腺癌新發(fā)病例數(shù)約16.9萬，世界人口標(biāo)化發(fā)病率為21.6/10萬，居女性所有惡性腫瘤第2位；死亡率為5.7/10萬，居女性癌癥死亡的第6位。
[0003]早診斷早發(fā)現(xiàn)，乳腺癌病情的治愈還是相當(dāng)令人樂觀的。在第IV期得到診斷的乳腺癌患者一只有20%能夠存活到5年之后，而在第I期就確診的患者一 100%活到5年之后。因此，乳腺癌的早期診斷是目前亟待解決的問題。
[0004]目前，臨床上對乳腺癌檢測有傳統(tǒng)的檢測方法，包括X線診斷、超聲顯象檢查、細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)診斷等，但這些檢測手段針對性不強(qiáng)，檢出率低，具有較大的局限性；還有一些基因檢測手段，如免疫組化技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。免疫組化技術(shù)可檢測腫瘤和靶細(xì)胞蛋白表達(dá)情況，不能觀察基因水平突變類型，F(xiàn)ISH能直接和準(zhǔn)確的判斷靶基因是否存在擴(kuò)增，但較昂貴和繁瑣。基因芯片技術(shù)可檢測人數(shù)多、位點(diǎn)多，時(shí)間短，但僅用于已公布的基因位點(diǎn)、重復(fù)準(zhǔn)確性低，價(jià)格高。熒光定量PCR技術(shù)試劑昂貴，需精密儀器等。這些技術(shù)的缺點(diǎn)都大大的限制了乳腺癌早期診斷的應(yīng)用。
[0005]國內(nèi)外對乳腺癌易感基因的研究表明，乳腺癌患者在基因水平存在某些基因突變的現(xiàn)象，大多表現(xiàn)為SNP或堿基缺失多態(tài)性。乳腺癌具有發(fā)病率、死亡率高等特點(diǎn)，因此，通過早期基因篩查、風(fēng)險(xiǎn)評估和監(jiān)測來規(guī)避乳腺癌的發(fā)生就顯得尤為重要。
[0006]目前，乳腺癌與基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)性研究成果使乳腺癌易感基因篩查成為可能。研究表明，F(xiàn)oxp3、⑶14、FGFR2、BRCA14個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)突變與乳腺癌發(fā)生顯著相關(guān)。4個(gè)基因中，F(xiàn)oxp3為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，對其發(fā)育和功能起著重要的調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)oxp3+⑶4+⑶25在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中起重要作用。⑶14識別、結(jié)合LPS復(fù)合物，介導(dǎo)LPS所致的細(xì)胞反應(yīng)，在LPS性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒休克等病理反應(yīng)中起重要作用，D14參與了乳腺癌，膀胱癌等腫瘤的發(fā)生過程；FGFR2指導(dǎo)細(xì)胞分裂、遷移和分化成更加具有功能性的細(xì)胞，F(xiàn)GFR2受體鑲嵌在細(xì)胞表面，接受來自外部的信號，從而傳遞信號到內(nèi)表面，最終指導(dǎo)細(xì)胞分化。FGFR2基因的突變，會引起細(xì)胞過度增生而引起癌癥的發(fā)生；BRCA1主要作用是控制傳遞細(xì)胞繁殖的信息，如果出現(xiàn)變異，細(xì)胞將會無節(jié)制地繁殖，導(dǎo)致癌癥。大約有10%的乳腺癌由遺傳性的BRCAl基因突變引發(fā)的。
[0007]中國漢族乳腺癌人群中，廣泛存在Foxp3、⑶14、FGFR2、BRCAl，4個(gè)基因的單核苷酸多態(tài)性改變，從而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生，因此篩查該4個(gè)基因的多態(tài)位點(diǎn)突變對于防治乳腺癌具有特殊的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008]本發(fā)明的目的是以上述現(xiàn)有技術(shù)為基礎(chǔ)，提供一種操作簡易、多位點(diǎn)、高效率、低成本、高靈敏度的，對乳腺癌能起到預(yù)防作用的乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒。
[0009]本發(fā)明另一目的是提供一種乳腺癌易感基因快速檢測方法。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，包括檢測Foxp3基因上rs2294021號多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物，其中，檢測Foxp3基因上rs2294021號多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物為:
[0011]
【權(quán)利要求】
1.乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測Foxp3基因上rs2294021號多態(tài)位點(diǎn)，其中檢測Foxp3基因多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物為:
SEQ N0.1:5’ -CCCGCAGGAAGGAGGAGGTCT-3’ ；
SEQ N0.2:5’ -TTCCGAACAGCATCGTCCT-3’ ；
SEQ N0.3:5’ -GGCAGGGGCTCATGGAC-3’ ；
SEQ N0.4:5’ -GGCAGGGGCTCATGGAT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，其特征在于，還包括檢測FGFR2基因上rsl219648和rs2981582號多態(tài)位點(diǎn)。 其中，檢測FGFR2基因上rsl219648號多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物為:
SEQ N0.1:5’ -ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3’ ；
SEQ N0.2:5’ -TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3’ ；
SEQ N0.3:5’ -CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3’ ；
SEQ N0.4:5’ -CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3’ ；
SEQ N0.5:5’ -ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3’ ；
SEQ N0.6:5’ -TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3’ ；
SEQ N0.7:5’ -CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3’ ；
SEQ N0.8:5’ -CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3’ ； 檢測FGFR2基因上rs2981582號多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物為:
SEQ N0.9:5’ -TCCAAGTATCACAGGGCAT-3’ ；
SEQ N0.10:5’ -CAAGAGGCAGTTCCATAATCG-3’ ；
SEQ N0.11:5’ -CACTTAATGAACCTGTTTTC-3’ ；
SEQ N0.12:5’ -CACTTAATGAACCTGTTTTT-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，其特征在于，還包括檢測⑶14基因上rs2569190號多態(tài)位點(diǎn)，其中，檢測⑶14基因多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物為:
SEQ N0.13:5’ -GCAGCAACAAGCAGGACG-3’ ；
SEQ N0.14:5’ -TGGTGCCAACAGATGAGG-3’ ；
SEQ N0.15:5’ -ATGTTTCAGGGAGGGGTG-3’ ；
SEQ N0.16:5’ -ATGTTTCAGGGAGGGGTA-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，其特征在于，還包括檢測BRCAl基因上rs2046210號多態(tài)位點(diǎn)，其中，檢測BRCAl基因多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物為:
SEQ N0.17:5’ -CGGTCATTACAACACAGAACTAT-3’ ；
SEQ N0.18:5’ -CACAGAACTAAACCACCAAGAG-3’ ；
SEQ N0.19:5’ -CTTTTATTTCAGGTAGATTT-3’ ；
SEQ N0.20:5’ -CTTTTATTTCAGGTAGATTC-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或者4所述的乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，其特征在于，檢測Foxp3基因上rs2294021號多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物的摩爾數(shù)比為SEQ N0.1 =SEQ N0.2/SEQ N0.3: SEQ N0.4=1:1:1 ;檢測FGFR2基因上rsl219648號多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物的摩爾數(shù)比都為 SEQ N0.5:SEQ N0.6/SEQ N0.7: SEQ N0.8=1:1:1 ;檢測 FGFR2 基因上 rs2981582號多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物的摩爾數(shù)比都為SEQ N0.9:SEQ N0.10/SEQ N0.1liSEQ N0.12=1:1:1 ;檢測CD14基因上rs2569190號多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物的摩爾數(shù)比為SEQ N0.13 =SEQN0.14/SEQ N0.15:SEQ N0.16=1:1:1 ;檢測 BRCAl 基因上 rs2046210 號多態(tài)位點(diǎn)的引物混合物的摩爾數(shù)比為 SEQ N0.17:SEQ N0.19/SEQ N0.19:SEQ N0.20=0.2-0.5:1:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，其特征在于，還包括擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增后的基因分型用試劑，所述擴(kuò)增試劑包括PCR緩沖液、dNTPs混合物、熱啟動Taq酶和超純水；所述擴(kuò)增后的基因分型用試劑包括瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA無毒染料和DNA上樣緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增試劑包括 IOX PCR buffer:其中，Tris-HCl pH8.0100mM;KC1500mM;MgCl215mM，各組分濃度為2.5mM的dNTPs混合物，5U/ μ I的熱啟動Taq酶用量為0.1-0.125 μ I。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳腺癌易感基因快速檢測試劑盒，其特征在于，擴(kuò)增試劑由以下體積的組分組成:
9.一種乳腺癌易感基因快速檢測方法，其特征在于，其步驟包括， (1)、檢材基因組的DNA提??； (2)、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測分析；
【文檔編號】C12Q1/68GK103966310SQ201410040644
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】陳偉民, 婁婧婧 申請人:廣州市體育科學(xué)研究所