一種利用微生物發(fā)酵技術生產(chǎn)瓜爾膠的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用微生物發(fā)酵技術生產(chǎn)瓜爾膠的方法。該方法利用胞外多聚物鞘氨醇單胞菌發(fā)酵制備瓜爾膠，其步驟包括菌種活化、制備種子液、發(fā)酵、去蛋白和后處理。所述胞外多聚物鞘氨醇單胞菌的保藏編號為CGMCC?NO.1.6417。本發(fā)明優(yōu)化了瓜爾膠的分離純化技術與工藝參數(shù)，建立了一套下游加工方法，此方法具有工藝簡單，易于操作等優(yōu)點；同時具有生產(chǎn)周期短，不受氣候和地理環(huán)境條件的限制，易于提取和應用面廣等特性，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明利用葡萄糖為原料，通過微生物發(fā)酵技術制備瓜爾膠，發(fā)酵液組分簡單，產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，雜質少，易于純化，制備得到的瓜爾膠與瓜爾膠標準品一致。
【專利說明】一種利用微生物發(fā)酵技術生產(chǎn)瓜爾膠的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及瓜爾膠的生產(chǎn)，尤其涉及的是一種利用微生物發(fā)酵技術生產(chǎn)瓜爾膠的方法。
【背景技術】
[0002]瓜爾膠，英文名為“guargum”，是從廣泛種植于印巴次大陸的一種豆科植物-瓜爾豆(Cyamopsistetragonoloba L.Taub)的胚乳中提取的一種高純化天然多糖。由于其獨特的分子結構特點及天然性，使其迅速成為性能優(yōu)越的新型環(huán)保造紙助劑；同時它還被廣泛應用于食品、石油、醫(yī)藥等領域。瓜爾膠就分子結構來說是一種非離子多糖，它以聚甘露糖為分子主鏈，D-吡喃甘露糖單元之間以β (1-4)苷鍵連接。而D-吡喃半乳糖則以α (1-6)鍵連接在聚甘露糖主鏈上。瓜爾膠中甘露糖與半乳糖單元之摩爾比為2: 1，即每隔一甘露糖單元連接著一個半乳糖分支，瓜爾膠的分子量在220000左右。瓜爾膠為大分子天然親水膠體，外觀是從白色到微黃色的自由流動粉末，能溶于冷水或熱水，遇水后及形成膠狀物質，達到迅速增稠的功效。廣泛用于石油壓裂、鉆井等增稠目的，以及食品添加劑，印染和建筑涂料等行業(yè)。瓜爾膠是已知的最有效和水溶性最好的天然聚合物，在低濃度下，可形成高粘稠溶液，表現(xiàn)出非牛頓流變特性，與硼砂形成酸可逆凝膠。由于它的獨特性能，目前已應用于食品、制藥、化妝品、個人保健、石油、粘蚊劑、造紙和紡織印染等行業(yè)。
[0003]現(xiàn)有技術都是依賴化學方法從瓜爾豆中提取和制備瓜爾膠，再加上瓜爾豆栽培對環(huán)境條件要求也非常嚴格，雖然現(xiàn)在在我國云南等地已經(jīng)引種成功，但普遍存在產(chǎn)量低、提取量少、地域要求高、季節(jié)性供應等缺陷，同時還侵占了大量的耕地，致使我國目前瓜爾膠還主要依靠進口的現(xiàn)狀。這不僅在很大程度上限制了它的應用，而且也加大了瓜爾膠的生產(chǎn)成本。如何才能有效地解決上述現(xiàn)有技術的缺陷，開發(fā)研究出一種具有適用范圍廣、生產(chǎn)工藝簡單、經(jīng)濟效益良好、無二次污染等特點的綠色、環(huán)境友好型的全新瓜爾膠生產(chǎn)和制備技術是一個亟待解決的問題。而且，微生物胞外多糖除具有大多數(shù)植物多糖和合成的高分子聚合物所特有的性質外，還具有低濃度下呈高粘度、假塑性、熱穩(wěn)定性，可與多種鹽類配伍及形成有用的膜，同時具有生產(chǎn)周期短，不受氣候和地理環(huán)境條件的限制，易于提取和應用面廣等特性，所以在工業(yè)生產(chǎn)與生活的許多領域具有廣闊的發(fā)展前景。而目前現(xiàn)有的專利和文獻中均是關于利用化學手段改變其理化特性，滿足工業(yè)生產(chǎn)需求的報道。迄今為止，尚未見到將微生物發(fā)酵技術應用于生產(chǎn)瓜爾膠方法的報道。
[0004]因此，現(xiàn)有技術存在缺陷，需要改進。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供了一種利用微生物發(fā)酵技術生產(chǎn)瓜爾膠的方法。
[0006]本發(fā)明的技 術方案如下:
[0007]—種利用微生物發(fā)酵技術生產(chǎn)瓜爾膠的方法，其步驟如下:[0008](I)菌種活化
[0009]將在4°C下保存的胞外多聚物鞘氨醇單胞菌菌株由斜面轉接到固體培養(yǎng)基中，30°C下，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~20h ；
[0010](2)制備種子液
[0011]取(I)中經(jīng)活化后的菌種，接種到種 子培養(yǎng)基中，裝液量100mL / 500mL三角瓶，搖床轉速180r / min，30°C震蕩培養(yǎng)12~20h ；
[0012](3)發(fā)酵
[0013]將(2)中制備的種子液按體積分數(shù)為2%~4%的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，發(fā)酵溫度為28~31°C，pH為7.0~7.2，通氣量的V: V為0.7-0.9: 1，攪拌速度為180-190r / min，保持溶氧飽和度12%以上，培養(yǎng)5d，收集發(fā)酵液；
[0014](4)去蛋白
[0015]在(3)中收集的發(fā)酵液中加入0.2倍發(fā)酵液體積的氯仿和0.04倍發(fā)酵液體積的正丁醇混合振蕩半個小時進行分離，重復處理2~3次，直至有機相和水相二者的界面無沉淀為止，有效除去瓜爾I父中的蛋白質；
[0016](5)后處理
[0017]將(4)中去蛋白的瓜爾膠組分經(jīng)過脫色、過濾、低壓濃縮、結晶和干燥后得到產(chǎn)物瓜爾膠。
[0018]所述胞外多聚物鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sanxanigehens)購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC N0.1.6417。
[0019]所述的方法，步驟(1)中，按照質量體積比，固體培養(yǎng)基的組成為:1%葡萄糖、0.25%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.06%硝酸銨、0.5% KH2P04、0.01% MgS04、l.5%瓊脂、其余為水；pH 為 7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。
[0020]所述的方法，步驟(2)中，按照質量體積比，種子培養(yǎng)基的組成為:1%葡萄糖、0.25%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.06%硝酸銨、0.5% KH2P04，0.01% MgS04、其余為水；pH為
7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。
[0021]所述的方法，步驟(3)中，按照質量體積比，培養(yǎng)基的組成為:4%~6%葡萄糖、0.06%硝酸銨、0.5% KH2P04、0.01 % MgS04、其余為水;pH 為 7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。
[0022]本發(fā)明中，脫色、過濾、低壓濃縮、結晶和干燥屬于現(xiàn)有技術，本領域技術人員可以根據(jù)產(chǎn)物需要合理選擇；本發(fā)明優(yōu)選將發(fā)酵液收集后，用活性炭5g / IOOmL吸附5min，經(jīng)過濾膜(孔徑為0.45μπι)過濾，取其濾液采用旋轉薄膜蒸發(fā)儀48°C減壓濃縮至無水分蒸出，在濃縮的瓜爾膠溶液中加入三倍體積的質量百分濃度為95%乙醇，于4°C下靜置12h，取其沉淀，并于真空干燥箱中，45°C真空干燥6h，即得瓜爾膠產(chǎn)品。
[0023]本發(fā)明中葡萄糖和瓜爾膠的測定方法:
[0024]I)最大吸收波長的確定
[0025]配制80 μ g / HiL葡萄糖標準溶液，80 μ g / mL多糖粗品溶液，蒽酮_比色法顯色，在波長550-700nm范圍內測定吸光值，得吸光值曲線。吸光值曲線的最大吸收值對應波長作為標準曲線的吸收波長。
[0026]2)標準曲線的建立[0027]將葡萄糖干燥至恒重，精密稱取該葡萄糖1.0g,定容于IOOmL容量瓶中，搖勻后取ImL定容于IOOmL容量瓶，即IOOyg / mL葡萄糖標準溶液。取20mL帶塞試管，編號，從0.2mg / mL開始,按每次增加0.2mg / mL濃度的值配制系列濃度的葡萄糖標準液,直至最大溶液濃度1.8mg/mL。然后分別向每支試管中加入IOmL事先已配好的蒽酮硫酸溶液(冰水浴)，混勻，蓋上塞子，在沸水浴中煮沸IOmin (水浴重沸后計時)，取出，立即用水冷卻至室溫，以第一管為空白對照，調零，在上述所測定的最大吸收波長下，分別測量各管的吸光值。以為葡萄糖含量橫坐標，對應的吸光值為縱坐標，建立葡萄糖標準曲線。
[0028]3)瓜爾膠含量測定
[0029]精密稱取100.0mg樣品，定容于1000mL容量瓶中，混勻后量取此樣品液2.0mL,重復3組，然后分別加入IOmL事先已配好的蒽酮-硫酸溶液，搖勻，沸水浴加熱lOmin。分別以葡萄糖標準曲線的第一管為空白對照，調零，于最大吸收波長處測量吸光值。由標準曲線查得發(fā)酵液中瓜爾膠的含量。
[0030]菌株發(fā)酵液黏度的測定方法:將步驟(3)中的發(fā)酵液以3000rpm離心20min，上清液黏度用NDJ-79型旋轉式黏度計進行測定。
[0031]本發(fā)明開創(chuàng)了利用微生物發(fā)酵方法制備瓜爾膠的規(guī)?；a(chǎn)新途徑；本發(fā)明優(yōu)化了瓜爾膠的分離純化技術與工藝參數(shù)，建立了一套下游加工方法，此方法具有工藝簡單，易于操作等優(yōu)點；同時具有生產(chǎn)周期短，不受氣候和地理環(huán)境條件的限制，易于提取和應用面廣等特性，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明利用葡萄糖為原料，通過微生物發(fā)酵技術制備瓜爾膠，發(fā)酵液組分簡單，產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，雜質少，易于純化，制備得到的瓜爾膠與瓜爾膠標準品一致。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為葡萄糖標準曲線。
[0033]圖2為發(fā)酵時間與瓜爾膠產(chǎn)量關系圖。
[0034]圖3為瓜爾膠產(chǎn)量與發(fā)酵液黏度的關系圖。
[0035]圖4為瓜爾膠和瓜爾膠標準品的Fourier變換紅外光譜圖；注:上圖是瓜爾膠，下圖是瓜爾膠標準品。
【具體實施方式】
[0036]以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0037]胞外多聚物鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC N0.1.6417。
[0038]實施例1以葡萄糖為碳源，用8L的發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)試驗
[0039]1、菌種活化
[0040]將在4°C下保存的胞外多聚物鞘氨醇單胞菌菌株由斜面轉接到固體培養(yǎng)基中，30°C下，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，其中，按照質量體積比，培養(yǎng)基的組成為:1 %葡萄糖，0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06%硝酸銨，0.5% KH2PO470.01% MgSO4,1.5%瓊脂，其余為水；pH 為 7.0 ~7.2 ，115°C滅菌 25min。
[0041]2、制備種子液[0042]取I中經(jīng)活化后的菌種，接種到種子培養(yǎng)基中(裝液量IOOmL / 500mL三角瓶)，搖床轉速180r / min，30°C震蕩培養(yǎng)16h。其中，按照質量體積比，種子培養(yǎng)基的組成為:1%葡萄糖、0.25%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.06%硝酸銨、0.5% KH2PO4,0.01 ^MgSO4、其余為水；pH 為 7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。
[0043]3、8L的發(fā)酵罐分批發(fā)酵
[0044]將2中制備的種子液按2%~4% (體積分數(shù))的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，控制溫度28~31°C，pH7.0~7.2，保持溶氧飽和度12%以上，培養(yǎng)5d，收集發(fā)酵液。其中，按照質量體積比，培養(yǎng)基的組成為:5%葡萄糖，0.06%硝酸銨，0.5% KH2PO4,0.01% MgSO4,其余為水；ρΗ7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。發(fā)酵溫度 28 ~31°〇，通氣量0.8: 1(V: V)，攪拌速度 180-190r / min，ρΗ7.0 ~7.2。
[0045]4、瓜爾膠的提取
[0046]用活性炭5g/100mL吸附5min,經(jīng)過濾膜(孔徑為0.45 μ m)過濾,取其濾液采用旋轉薄膜蒸發(fā)儀48°C減壓濃縮至無水分蒸出，在濃縮的瓜爾膠溶液中加入三倍體積的質量百分濃度為95%乙醇，于4°C靜置12h后，取其沉淀，并于真空干燥箱中，45°C真空干燥6h，SP得瓜爾膠產(chǎn)品。經(jīng)檢測，發(fā)酵至58h黏度可達9860MPa.s，該菌株的產(chǎn)糖量可達21.246g/L，其純度為95%。
[0047]實施例2
[0048]1、菌種活化
[0049]將在4°C下保存的胞外多聚物鞘氨醇單胞菌菌株由斜面轉接到固體培養(yǎng)基中，30°C下，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，其中，按照質量體積比，培養(yǎng)基的組成為:1 %葡萄糖，
0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06%硝酸銨，0.5% KH2PO470.01% MgSO4,1.5%瓊脂，其余為水。ρΗ7.0 ~7.2，115?滅菌 25min。
[0050]2、制備種子液，
[0051]取I中經(jīng)活化后的菌種，接種到種子培養(yǎng)基中(裝液量IOOmL / 500mL三角瓶)，搖床轉速180r/min，30°C震蕩培養(yǎng)16h。其中，按照質量體積比，種子培養(yǎng)基的組成為:1%葡萄糖、0.25%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.06%硝酸銨、0.5% KH2PO4,0.01 ^MgSO4、其余為水；pH 為 7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。
[0052]3、8L的發(fā)酵罐分批發(fā)酵
[0053]將2中制備的種子液按2%~4% (體積分數(shù))的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，控制溫度28~31°C，pH7.0~7.2，保持溶氧飽和度12%以上，培養(yǎng)5d，收集發(fā)酵液。其中，按照質量體積比，培養(yǎng)基的組成為:5%葡萄糖，0.06%硝酸銨，0.5% KH2PO4,0.01% MgSO4，其余為水。ρΗ7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。發(fā)酵溫度 28 ~31°〇，通氣量0.8: 1(V: V)，攪拌速度 180-190r / min，ρΗ7.0 ~7.2。
[0054]4、瓜爾膠的提取
[0055]用活性炭5g / IOOmL吸附5min,經(jīng)過濾膜(孔徑為0.45 μ m)過濾,取其濾液采用旋轉薄膜蒸發(fā)儀48°C減壓濃縮至無水分蒸出，在濃縮的瓜爾膠溶液中加入三倍體積的質量百分濃度為95%乙醇，于4°C靜置12h后，取其沉淀，并于真空干燥箱中，45°C真空干燥6h，即得瓜爾膠產(chǎn)品。
[0056] 附圖2為上述發(fā)酵罐中瓜爾膠平均含量、生物量與發(fā)酵時間的關系曲線圖。由圖中曲線可知該菌株在發(fā)酵的開始階段，菌體須經(jīng)過4h的延遲期，然后迅速進入對數(shù)生長期，從第6h開始合成瓜爾膠。在26h后菌體進入穩(wěn)定期，在44h進入穩(wěn)定期后期，其產(chǎn)量隨著時間的推移不斷加快，當發(fā)酵至58h時，瓜爾膠達到最高產(chǎn)量為21.246g / L0
[0057]實施例3
[0058]1、菌種活化
[0059]將在4°C下保存的胞外多聚物鞘氨醇單胞菌菌株由斜面轉接到固體培養(yǎng)基中，30°C下，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，其中，按照質量體積比，培養(yǎng)基的組成為:1 %葡萄糖，
0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06%硝酸銨，0.5% KH2PO470.01% MgSO4,1.5%瓊脂，其余為水。ρΗ7.0 ~7.2，115?滅菌 25min。
[0060]2、制備種子液，
[0061]取I中經(jīng)活化后的菌種，接種到種子培養(yǎng)基中(裝液量IOOmL / 500mL三角瓶)，搖床轉速180r / min，30°C震蕩培養(yǎng)16h。其中，按照質量體積比，種子培養(yǎng)基的組成為:1%葡萄糖、0.25%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.06%硝酸銨、0.5% KH2PO4,0.01 ^MgSO4、其余為水；pH 為 7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。
[0062]3、8L的發(fā)酵罐分批發(fā)酵
[0063]將2中制備的 種子液按2%~4% (體積分數(shù))的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，控制溫度28~31°C，pH7.0~7.2，保持溶氧飽和度12%以上，培養(yǎng)5d，收集發(fā)酵液。。其中，按照質量體積比，培養(yǎng)基的組成為:5%葡萄糖，0.06%硝酸銨，0.5% KH2PO4,0.01% MgSO4，其余為水。ρΗ7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。發(fā)酵溫度 28 ~31°〇，通氣量0.8: 1(V: V)，攪拌速度 180-190r / min，ρΗ7.0 ~7.2。
[0064]4、瓜爾膠的提取
[0065]用活性炭5g/100mL吸附5min,經(jīng)過濾膜(孔徑為0.45 μ m)過濾,取其濾液采用旋轉薄膜蒸發(fā)儀48°C減壓濃縮至無水分蒸出，在濃縮的瓜爾膠溶液中加入三倍體積的質量百分濃度95%乙醇，于4°C靜置12h后，取其沉淀，并于真空干燥箱中，45°C真空干燥6h，即得瓜爾膠產(chǎn)品。
[0066]附圖3是瓜爾膠產(chǎn)量與發(fā)酵液黏度的關系圖。由圖中表明，瓜爾膠含量與發(fā)酵液黏度之間的模型方程為:y=0.0Ollx2-0.0038x+4.3262，R2=0.9789。式中，x是瓜爾膠含量，y是發(fā)酵液黏度，R是回歸系數(shù)。發(fā)酵上清液的黏度隨著瓜爾膠含量的增加而增加，從而說明瓜爾膠產(chǎn)量與發(fā)酵上清液黏度在一定程度上存在極為顯著的線性正相關性。
[0067]實施例4本發(fā)明制備的瓜爾膠的檢測
[0068](I)取實施例3中制備的瓜爾膠，進行紅外光譜測試。附圖4為瓜爾膠和瓜爾膠標準品的紅外光譜圖，通過分析兩者各主要峰的位置和形態(tài)基本一致，可以證明本發(fā)明制備的產(chǎn)品為高純度瓜爾膠。
[0069](2)瓜爾膠其它理化性質
[0070]本發(fā)明所提取的瓜爾膠為淺棕色晶體，無氣味，不溶于95%的乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑，溶于熱水；碘-碘化鉀反應為陰性，說明該多糖為非淀粉類和纖維素類物質；多糖與斐林試劑反應為陽性，有磚紅沉淀生成，說明其中含有還原性糖；與考馬斯亮藍G-250反應為陰性、與茚三酮反應陰性、雙縮脲反應陰性，證明其中不含有蛋白質成分。
[0071]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都 應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
【權利要求】
1.一種利用微生物發(fā)酵技術生產(chǎn)瓜爾膠的方法，其特征是，其步驟如下: (1)菌種活化 將在4°C下保存的胞外多聚物鞘氨醇單胞菌菌株由斜面轉接到固體培養(yǎng)基中，30°C下，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~20h ； (2)制備種子液 取(I)中經(jīng)活化后的菌種，接種到種子培養(yǎng)基中，裝液量IOOmL / 500mL三角瓶，搖床轉速180r / min，30°C震蕩培養(yǎng)12~20h ； (3)發(fā)酵 將(2)中制備的種子液按體積分數(shù)為2%~4%的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，發(fā)酵溫度為28~31 °C，pH為7.0~7.2，通氣量的V: V為0.7-0.9: 1，攪拌速度為180-190r / min，保持溶氧飽和度12%以上，培養(yǎng)5d，收集發(fā)酵液； (4)去蛋白 在(3)中收集的發(fā)酵液中加入0.2倍發(fā)酵液體積的氯仿和0.04倍發(fā)酵液體積的正丁醇混合振蕩半個小時進行分離，重復處理2~3次，直至發(fā)酵液中有機相和水相二者的界面無沉淀為止，有效除去 瓜爾膠中的蛋白質； (5)后處理 將(4)中去蛋白的瓜爾膠組分經(jīng)過脫色、過濾、低壓濃縮、結晶和干燥后得到產(chǎn)物瓜爾膠。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是，所述胞外多聚物鞘氨醇單胞菌的保藏編號為 CGMCC N0.1.6417。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是，步驟(1)中，按照質量體積比，固體培養(yǎng)基的組成為:1%葡萄糖、0.25%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.06%硝酸銨、0.5% KH2PO4^0.01%MgSO4U.5%瓊脂、其余為水;pH 為 7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是，步驟(2)中，按照質量體積比，種子培養(yǎng)基的組成為:1%葡萄糖、0.25%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.06%硝酸銨、0.5% KH2PO470.01%MgSO4、其余為水；pH 為 7.0 ~7.2，115°C滅菌 25min。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是，步驟(3)中，按照質量體積比，培養(yǎng)基的組成為:4%~6%葡萄糖、0.06%硝酸銨、0.5% ΚΗ2Ρ04、0.01% MgS04、其余為水；pH為7.0~.7.2，115°C滅菌 25min。
【文檔編號】C12R1/01GK103952450SQ201410047055
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年2月11日 優(yōu)先權日:2014年2月11日
【發(fā)明者】鄧振山, 李軍 申請人:鄧振山, 李軍