不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明中的不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的編碼基因A4-Oxa的核苷酸序列如SEQ?IDNO.5所示。本發(fā)明的不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa對(duì)真菌毒素玉米赤霉烯酮有較強(qiáng)的降解能力；原核重組表達(dá)的Oxa酶可在12h內(nèi)降解30%以上的ZEN毒素。本發(fā)明確定了Acinetobacter?sp.SM04降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶編碼序列，即A4-Oxa基因，為將來研究酶的活性位點(diǎn)和通過定點(diǎn)突變Oxa酶奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種不動(dòng)桿菌Acinetobacter sp.SM04的玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN, ZEA)毒素降解酶非過氧化物酶(命名為Oxa)及其編碼基因
與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN,ZEA)是一種雌激素類真菌毒素，由玉米赤霉菌、禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等真菌產(chǎn)生，主要污染小麥、大麥、燕麥、玉米等農(nóng)作物及動(dòng)物飼料。從全國(guó)倉庫和飼料廠中抽樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)玉米等農(nóng)作物和飼料中ZEN的檢出率高達(dá)100%,檢出濃度超標(biāo)嚴(yán)重。謝良民等對(duì)上海市大型超市中多類食品調(diào)查結(jié)果表明，ZEN的檢出率極高，其中調(diào)味品均超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(食品中ZEN含量≤60μ g/kg)，且最高達(dá)150μ g/kg (謝良民，葛懿云，李俊旋.上海零售食品中玉米赤霉烯酮含量初步研究[J].中國(guó)科協(xié)第五屆青年學(xué)術(shù)年會(huì)文集，2004，756.)。此外，有研究表明十余種市售谷物相關(guān)食品中ZEN檢出率也高達(dá)76.90%。因ZEN殘留時(shí)間長(zhǎng)、難處理，已引起國(guó)內(nèi)外科研工作者的極大關(guān)注。FAO和世界衛(wèi)生組織已將解決ZEA問題作為全世界的當(dāng)務(wù)之急，各國(guó)對(duì)糧食中ZEA含量有嚴(yán)格限量標(biāo)準(zhǔn)。
[0003]ZEN會(huì)引起種豬或家禽早熟，生殖周期紊亂，給種豬等養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失，進(jìn)一步對(duì)攝入被ZEN污染的農(nóng)、畜產(chǎn)品的人引發(fā)多種中毒癥、中樞神經(jīng)受損，甚至死亡。目前，ZEN脫毒技術(shù)根據(jù)其作用原理可分為3類:物理脫毒法(加熱、紫外線照射、有機(jī)粘土，活性炭，甘露低聚糖等)；化學(xué)脫毒法(酸堿處理，氮化處理，有機(jī)溶劑等)；生物轉(zhuǎn)化脫毒法。
[0004]物理方法是通過脫毒劑(主要包括活性炭、硅藻土、蒙脫石等)的吸附作用來達(dá)到去除ZEN的目的，但這類脫毒劑的吸附效率很低，達(dá)不到真正有效、徹底降解真菌毒素的目的。而且高劑量的吸附劑，會(huì)吸附營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也無法被家禽家畜消化，同時(shí)帶來環(huán)境污染?；瘜W(xué)方法包括氨化法、堿法、臭氧處理、雙氧水處理、碳酸鈉浸泡等，此法雖效果顯著，但后續(xù)處理繁瑣，生成的產(chǎn)物可能存在潛在毒性，且此方法效果不穩(wěn)定，營(yíng)養(yǎng)成分損失較大，難以廣泛規(guī)?；瘧?yīng)用(熊凱華，程波財(cái)，胡威等.玉米赤霉烯酮降解的研究進(jìn)展[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2010，25 (I): 138-140)。
[0005]由于物理法和化學(xué)法的種種局限性，生物降解法顯示出其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，受到國(guó)內(nèi)外研究者的青睞。生物降解脫毒是以微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物分解破壞霉菌毒素，生成無毒的降解產(chǎn)物。生物降解法高效、特異性強(qiáng)，不破壞原料中的營(yíng)養(yǎng)成分，無二次污染產(chǎn)生，已成為研究熱點(diǎn)和主要趨勢(shì)。
[0006]日本Takahash1-Ando等人對(duì)粉紅粘帚霉(Clonostachys rosea)的研究較為全面，分離出的內(nèi)酯水解酶zhdlOl可破壞ZEN結(jié)構(gòu)，使其轉(zhuǎn)化為雌激素毒性較弱的化合物，且 ZEN 的降解率在 80 ~90% 之間(Kimara M, Naoko T, Nishiu-chi T.MolecularBiology and Biotechnology for Reduction of Fusarium Mycotoxin Contamination.Pesticide Biochemistry and Physiology, 2006，86 (3): 117-123.)。大腸桿菌和釀酒酵母表達(dá)的重組zhdlOl表現(xiàn)出了內(nèi)酯水解酶的能力，對(duì)ZEN的降解率可達(dá)75%，具有zhdlOl的轉(zhuǎn)基因玉米也具備降解ZEN的能力(Tomoko I, Naoko T, Noriyuki O, et al.Reducedcontamination by the fusarium mycotoxin zearalenone in maize kernels throughgenetic modification with a detoxification gene.Applied and Environmental Microbiology, 2007，73 (5): 1622-1629.)。ZHDlOl主要作用于ZEA的內(nèi)酯鍵，將ZEA的球形結(jié)構(gòu)打開變成直鏈形結(jié)構(gòu)，使之不能與雌激素受體結(jié)合，從而消除其高雌激素癥。但酯鍵的水解并不能完全降解ZEA，該反應(yīng)仍然可逆，而且經(jīng)過降解產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)ZHDlOl將部分ZEA降解成為β-ZEA,仍具有較高的雌激素毒性。
[0007]此外，奧地利Molnar從白蟻后腸中分離出了一種新酵母菌一毛孢子菌屬Trichosporon mycotoxinivorans,它的培養(yǎng)物能將ZEN降解為二氧化碳和其它弱紫外吸收的代謝物，從而降低其毒性(Molnar O, Schatzmayr G, Fuchs E, etal.Trichosporon mycotoxinivorans sp.nov., a new yeast species useful inbiological detoxification of various mycotoxins.Systematic and AppliedMicrobiology, 2004, 27:661-671.)。該過程降解ZEA效率較低，而且較難進(jìn)一步水解成為小分子物質(zhì)，也未能避免雌激素毒性物的生成。
[0008]Abdullah從玉米地里分離出的假單胞菌ZEA-1可利用ZEN為唯一碳源，并且在12h內(nèi)可將ZEN減少一半，編碼此ZEN降解酶的基因在大腸桿菌中也獲得了活性表達(dá)(Abdulla D.Altalhi, Bahig El-Deeb.Localization of zearalenone detoxificationgene(s)in pZEA-1plasmid of Pseudomonas putida ZEA-1and expressed in Escherichiacol1.J Hazard Mater, 2009, 161:1166-1172.)。
[0009]與此同時(shí)，其他研究主要集中于篩選獲得各種能降解ZEA的微生物，包括棉花枯萎病菌、假單胞菌、根霉 菌、乳酸細(xì)菌、枯草芽孢桿菌等，對(duì)相關(guān)作用酶的發(fā)現(xiàn)及降解途徑分析較少。
[0010]唐語謙等從玉米耕種的土壤中分離獲得了一株可高效降解ZEN的不動(dòng)桿菌Acinetobacter.sp.SM04,可將ZEA徹底分解成無雌激素毒性的降解產(chǎn)物，降解效率高出國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)所報(bào)道的其他菌株(Yuanshan Yu, Liping Qiu, Hui ffu, Yuqian Tang, etal.Degradation of zearalenone by the extracellular extracts of Acinetobactersp.SM041iquid cultures.Biodegradation, 2011, 22:613 - 622.),并從中分離出一個(gè)在該過程中起關(guān)鍵作用的過氧化物酶Prx (Yuanshan Yu, Liping Qiu, Hui ffu, Yuqian Tang,et al.0xidation of zearalenone by extracellular enzymes from Acinetobactersp.SM04into smaller estrogenic products.World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 27:2675-2681.)。至今還沒有關(guān)于非過氧化物酶(Oxa)相關(guān)信息的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa。本發(fā)明所用的不動(dòng)桿菌為Acinetobacter sp.SM04。
[0012]本發(fā)明的另一目的在于提供上述不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的編碼基因。
[0013]本發(fā)明的再一目的在于提供上述不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa，其氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015]所述的不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的編碼基因A4_0xa，其核苷酸序列如SEQID N0.5 所示。
[0016]所述的不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa在降解霉變農(nóng)作物和飼料及其它食物中的玉米赤霉烯酮毒素上的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明通過培養(yǎng)不動(dòng)桿菌Acinetobacter sp.SM04,從其培養(yǎng)上清液中分離、純化得到降解ZEN毒素的非過氧化物酶，經(jīng)過SDS-PAGE和MALD1-T0F-T0F/MS分析和鑒定得到該非過氧化物酶的兩段特異性氨基酸序列。
[0018]基于MALD1-T0F-T0F/MS酶蛋白分析鑒定的蛋白序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Acinetobacter sp.SM04ZEN 降解酶基因的部分序列，米用 High-efficiency Tail-PCR 技術(shù)多次擴(kuò)增、拼接后，得到該酶的全基因核苷酸序列，并翻譯成氨基酸序列，同時(shí)對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)和蛋白功能的驗(yàn)證。
[0019]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:從編碼Oxa的基因序列SEQ ID N0.5和其氨基酸序列SEQ ID N0.6可知，本發(fā)明的不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa是一種全新的酶，區(qū)別于前期研究成果中從不動(dòng)桿菌SM04中分離的過氧化物酶Prx，不需過氧化氫的輔助也對(duì)真菌毒素玉米赤霉烯酮有較強(qiáng)的降解能力。
[0020]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0021](I)不動(dòng)桿菌SM04將ZEN降解成為無雌激素毒性產(chǎn)物的過程為一系列酶共同作用的結(jié)果，本發(fā)明采取一種新方法從中分離得另一個(gè)新酶，在無H2O2的作用下降解ZEN，是一種新的非過氧化物酶，并已獲得該酶的氨基酸序列及編碼基因序列，且在大腸桿菌宿主中表達(dá),表達(dá)后的重組Oxa粗酶液具有ZEN降解活力。
[0022](2)本發(fā)明的不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa對(duì)真菌毒素玉米赤霉烯酮有較強(qiáng)的降解能力，原核重組表達(dá)的Oxa酶可在12h內(nèi)降解30%以上的ZEN毒素。
[0023](3)本發(fā)明確定了 Acinetobacter sp.SMO4的玉米赤霉烯酮毒素降解酶Oxa的編碼序列，即A4-0xa基因，不同于過氧化物酶Prx的編碼基因序列，且通過Genbank中比對(duì)，是一種新的序列，為將來研究酶的活性位點(diǎn)和通過定點(diǎn)突變Oxa酶奠定了基礎(chǔ)。
[0024](4)本發(fā)明的不動(dòng)桿菌ZEN毒素降解酶Oxa在降解玉米赤霉烯酮的過程中，不需要雙氧水的協(xié)同作用，完全區(qū)別于已公開的來源于不動(dòng)桿菌Acinetobacter sp.SMO4的過氧化物酶Prx。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是實(shí)施例1中Acinetobacter sp.SMO4的M2培養(yǎng)物上清液的經(jīng)過DEAESephadex A-50柱(洗脫液:20mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)、Sephadex G-50柱(洗脫液:IOmM Tris-HCl 緩沖液，pH7.0)、DEAE Sephadex A-50 柱(洗脫液:20mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)洗脫后各組分的蛋白質(zhì)吸收峰圖譜。
[0026]圖2是實(shí)施例1中ZEN毒素降解酶Oxa酶組分(圖1中P2)降解ZEN產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)圖；其中，圖A =ZEN (標(biāo)準(zhǔn)品);圖B =ZEN毒素降解酶Oxa酶組分+ZEN,反應(yīng)時(shí)間12h。
[0027]圖3是實(shí)施例1中獲得的ZEN毒素降解酶Oxa酶組分(圖1中P2)SDS_PAGE電泳分析結(jié)果；M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量marker (14.4kDa~98kDa) ;A1、A2:ZEN毒素降解酶Oxa酶組分。
[0028]圖4是實(shí)施例4中重組質(zhì)粒pET_32a (+) -A4_0xa的雙酶切瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果圖；M1:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker (250~1000Obp) ；M2:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker (200~2000bp) ；A:質(zhì)粒 pET-32a(+) ;B1、B2:重組質(zhì)粒 pET_32a (+) _A4_0xa (BamHI 和 XhoI 雙酶切)。
[0029]圖5是實(shí)施例4中A4_0xa基因在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果圖；M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker(14.4kDa~116kDa) ;A:未誘導(dǎo)的重組菌BL21 (DE3)/pET-32a(+) -A4-0xa 粗酶液；B1、B2:IPTG 誘導(dǎo)的重組菌 BL21 (DE3)/pET_32a(+) _A4_0xa 粗酶液；C:重組菌BL21(DE3)/pET-32a(+)粗酶液。
[0030]圖6是測(cè)定實(shí)施例4中重組Oxa酶ZEN降解活力的HPLC檢測(cè)結(jié)果圖；其中，圖A:超純水+ZEN;圖B:重組菌BL21(DE3)/pET-32a(+)粗酶液+ZEN;圖C:1PTG誘導(dǎo)的重組菌BL21 (DE3)/pET-32a (+)-A4-0xa 粗酶液 +ZEN，反應(yīng)時(shí)間 12h。
[0031]圖7是ZEN毒素濃度與液相色譜吸收峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0032]圖8是重組Oxa粗酶液降解玉米酒精糟中的ZEN毒素的HPLC檢測(cè)圖，其中，圖A是對(duì)照組，未加酶液+玉米酒精糟；圖B是實(shí)驗(yàn)組，重組Oxa粗酶液+玉米酒精糟。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0034]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。
[0035]不動(dòng)桿菌Acinetobacter sp.SMO4為2011年12月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5524。
[0036]玉米酒精糟購自濱州金通飼料原料加工廠。
[0037]實(shí)施例1
[0038]一種新的不動(dòng)桿菌降解ZEN的非過氧化物酶酶組分的制備，包括以下步驟:
[0039]1.培養(yǎng):將接種有 2%(v/v) Acinetobacter sp.SM04菌懸液(0D600=0.8)的培養(yǎng)物(M2培養(yǎng)基)在30°C的氣浴搖床中培養(yǎng)(180r/min) 36h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，將液體培養(yǎng)物離心12min (9000 X g，5°C )，離心后的上清液用0.22 μ m濾膜過濾，濾過液在50°C使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮9倍成為粗酶液；
[0040]所用培養(yǎng)基的配方如下:
[0041]M2 培養(yǎng)基:15g 乙酸鈉，2.75g NH4NO3,1.35g K2HPO4.3H20,1.25g KCl，0.5gMgSO4.7H20,加入IOmL微量元素儲(chǔ)備液，加蒸餾水定容至1000mL,混合后調(diào)節(jié)pH至7.3 ;
[0042]微量元素儲(chǔ)備液的配方:2g/LFeSO4.7Η20，0.5g/L MnSO4.4Η20，0.4g/LCuSO4.5Η20，0.5g/L CoCl6.6Η20 和 0.4g/L ZnCl2。
[0043]2.將步驟I中的粗酶液加入陰離子型葡聚糖凝膠柱DEAE Sephadex A-50柱(2.0cmX 15cm)中，用pH7.0,6.5,6.0,5.5,5.0的磷酸鈉鹽緩沖液(20mM)進(jìn)行梯度洗脫(流速為0.5mL/min),分段收集(每管5mL),測(cè)定各管組分的A28tlnm值,選取A28tlnm ^1.0的收集管進(jìn)行ZEN降解酶活力測(cè)定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0044]3.將步驟2獲得的ZEN降解酶液在50°C下濃縮9倍，加入到陽離子型葡聚糖凝膠柱 Sephadex G-50 柱(2.0cmX 30cm)中，用 20mM Tris-HCl 緩沖液(pH7.0)洗脫(流速為
0.5mL/min),分段收集(每管5mL),測(cè)定各管的A28tlnm值,選取A28tlnm≥1.0的收集管進(jìn)行ZEN降解酶活力測(cè)定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0045]4.將步驟3獲得的ZEN降解酶組分在50°C下濃縮9倍，重新加入到陰離子型葡聚糖凝膠柱 DEAE Sephadex A-50 柱(2.0cmX 15cm)中，用 ρΗ7.0、6.5、6.0、5.5、5.0 的磷酸鈉鹽緩沖液(20mM)進(jìn)行梯度洗脫(流速為0.5mL/min)，分段收集(每管5mL);測(cè)定各管組分的八28-值，得到蛋白質(zhì)吸收峰圖譜，如圖1 ;取蛋白質(zhì)吸收峰圖譜中P2所在吸收峰的各管進(jìn)行ZEN降解活力檢測(cè)；合并ZEN降解活力高于50%的各管；
[0046]5.將步驟4所得的ZEN降解酶組分在50°C下濃縮9倍，即為最終的不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa酶組分。取此非過氧化物酶Oxa酶組分進(jìn)行ZEN毒素降解活力檢測(cè)。結(jié)果表明此組分可在12h內(nèi)降解71.2%的ZEN毒素，其液相實(shí)驗(yàn)圖見圖2。
[0047]各管組分的ZEN降解酶活力測(cè)定方法如下:
[0048]將0.40mL 各管收集液、0.1OmL0.25mol/L 的 Tris-HCl (ρΗ9.0)緩沖液和20 μ L0.5mol/L H2O2溶液混合均勻，添加10 μ L ZEN甲醇儲(chǔ)備液(ZEN濃度為lmg/mL)，置于40°C恒溫水浴溫育12h，添加0.5mL甲醇終止反應(yīng)，在12000 X g下離心5min，取30 μ L上清液用HPLC檢測(cè)其ZEN殘量。以去離子水作為空白對(duì)照。結(jié)果以相對(duì)降解活力表示，相對(duì)降解活力(％) = (ZEN的添加量-處理后ZEN的殘留量)/ZEN的添加量X 100。
[0049]高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)ZEN的條件:色譜柱采用Waters XTerraE MS C18柱(4.6 X 150mm，5 μ m)。流動(dòng)相為乙腈:水:甲醇=46:46:8。柱溫30°C，流量為lmL/min。結(jié)果采用熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)274nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm。采用外標(biāo)法定量ZEN的濃度，計(jì)算各組分的降解效率。
[0050]實(shí)施例2
[0051]ZEN毒素降解酶Oxa酶組分的分析及鑒定，包括以下步驟:
[0052]1、將實(shí)施例1中最終得到的ZEN毒素降解酶Oxa酶組分用12.5%(w/v) SDS-PAGE凝膠電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色后，結(jié)果如圖3。
[0053]SDS-PAGE蛋白電泳液:10% (w/v)十二烷基苯磺酸鈉(SDS)溶液；1%(v/v)四甲基乙二胺(TEMED) ； 10%(w/v)過硫酸銨(AP)；
[0054]樣品溶解液:2%(w/V) SDS, 5% (v/v) β -巰基乙醇，10% (v/v)甘油，0.02% (w/ν)溴酹藍(lán)，IOmM pH8.0Tris-HCl 緩沖液；
[0055]凝膠貯液:30%分離膠貯液，10%濃縮膠貯液；
[0056]分離膠配方:4.9mL 單體,5.0mL buffer, 3.5mL 蒸懼水，2.0mL 甘油，50 μ L10%(w/v)AP,10 μ L TEMED0
[0057]濃縮膠配方:1.62mL單體，3.1OmL buffer, 7.78mL蒸懼水，25 μ L10%(w/v) AP, 5 μ LTEMED。
[0058]其中，單體:30%(w/v)聚丙烯酰胺，0.8%(w/v)交聯(lián)劑；buffer:3M Tris, 0.3% (w/v) SDS, ρΗ8.45。[0059]凝膠緩沖液:分離膠緩沖液(3.0mol/L pH8.9Tris_HCI緩沖液)，濃縮膠緩沖液(0.5mol/L ρΗ6.7Tris_HCI 緩沖液)；
[0060]電極緩沖液:0.l%(w/v) SDS, 0.05mol/L Tris-HCl ；
[0061]染色液:考馬斯亮藍(lán)R2500.125g，加入50mL甲醇，IOmL冰乙酸，定容至100mL。
[0062]脫色液:冰乙酸75mL,甲醇50mL,加入蒸懼水定容至1000mL。
[0063]2、取出圖3凝膠中蛋白條帶2進(jìn)行酶解。酶解條件如下:50%(v/v)乙腈，25mmol/L順4!10)3，0.02^/^胰蛋白酶的水溶液，371:，1611。將酶解上清液萃取凍干。
[0064]3、完全凍干的樣品重新用0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液溶解，然后使用MALD1-T0F-T0F質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。
[0065]表1Acinetobacter sp.SMO4中降解ZEN非過氧化物酶酶組分的蛋白條帶2的鑒
定結(jié)果
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0.6所示。
2.權(quán)利要求1所述的不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的編碼基因A4-0xa，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
3.權(quán)利要求1所述的不動(dòng)桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa在降解霉變農(nóng)作物和飼料及其它食物中的玉米赤霉烯酮毒素上的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C12N9/00GK103881986SQ201410047870
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】唐語謙, 鐘鳳, 陳藝, 吳暉 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)