具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于通過調(diào)節(jié)編碼RHL1(無根毛1)的核酸在植物中的表達而增強多種植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼RHL1的核酸的受調(diào)節(jié)表達的植物，所述植物相對于對應(yīng)的野生型植物或其他對照植物具有增強的多種植物產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明也提供了在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
【專利說明】具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法
[0001]本申請為2009年6月22日提交的、發(fā)明名稱為“具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法”的PCT申請PCT / EP2009 / 057722的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為2011年2月25日，申請?zhí)枮?00980133067.X。
[0002]本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于通過調(diào)節(jié)編碼RHLl (無根毛(RootHairless) I)的核酸在植物中的表達而增強多種植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼RHLl的核酸的受調(diào)節(jié)表達的植物，所述植物相對于對應(yīng)的野生型植物或其他對照植物具有增強的多種植物產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明也提供了在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
[0003]本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于通過增加編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)多肽的核酸序列在植物中的表達而增加多種植物種子產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼TGase多肽的核酸序列的增加表達的植物，所述植物相對于對照植物具有增加的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還涉及包含該核酸序列的核酸序列、核酸構(gòu)建體、載體和植物。
[0004]本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于通過調(diào)節(jié)編碼TRY-樣(Tryptichon)多肽的核酸在植物中的表達而改良多種植物生長特征的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼TRY-樣多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達的植物，所述植物相對于對應(yīng)的野生型植物或其他對照植物具有改良的生長特征。本發(fā)明也提供了在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
[0005]本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于增加植物中種子產(chǎn)量的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于通過調(diào)節(jié)編碼BZR(SRASSINA卻LE-SESISTANT (抗性))多肽的核酸在植物中的表達而增加植物中種子產(chǎn)量的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼BZR多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達的植物，所述植物相對于對照植物具有增加的種子產(chǎn)量。本發(fā)明還提供用于實施本發(fā)明方法的迄今未知的BZR-編碼核酸，和包含此核酸的構(gòu)建體。
[0006]持續(xù)增長的世界人口和農(nóng)業(yè)用可耕地供應(yīng)萎縮刺激了有關(guān)提高農(nóng)業(yè)效率的研究。常規(guī)的作物及園藝學(xué)改良手段利用選擇育種技術(shù)以鑒定具有受歡迎特征的植物。然而，此類選擇育種技術(shù)具有幾個缺陷，即這些技術(shù)一般耗費很多勞動并且產(chǎn)生這樣的植物，其經(jīng)常含有可能并不總導(dǎo)致受歡迎性狀從親代植物傳遞下去的異源遺傳組分。分子生物學(xué)進展已經(jīng)允許人類改良動物及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(zhì)(一般處于DNA或RNA形式)并且隨后引入該遺傳物質(zhì)至植物中。此類技術(shù)具有產(chǎn)生具備多種經(jīng)濟學(xué)、農(nóng)學(xué)或園藝學(xué)改良性狀的作物或植物的能力。
[0007]具有特殊經(jīng)濟意義的性狀是提高的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為來自作物的經(jīng)濟價值的可測量結(jié)果。該結(jié)果可以就數(shù)量和/或品質(zhì)方面進行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個因素，例如器官的數(shù)目和大小、植物構(gòu)造(例如枝的數(shù)目)、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、養(yǎng)分攝入、脅迫耐受性和早期生長勢(early vigor)也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化前述因素因而可以有助于提高作物產(chǎn)量。
[0008]種子產(chǎn)量是特別重要的性狀，因為許多植物的種子對人和動物營養(yǎng)是重要的。作物如谷物、稻、小麥、卡諾拉油菜和大豆占超過一半的人類總熱量攝入，無論通過直接消費種子本身或通過消費基于加工的種子而產(chǎn)生的肉產(chǎn)品。作物也是糖、油及工業(yè)加工中所用許多類型代謝物的來源。種子含有胚(新莖干(Shoot)和新根的來源)和胚乳(萌發(fā)期間和幼苗早期生長期間用于胚生長的養(yǎng)分來源)。種子發(fā)育涉及多種基因并且需要代謝物從根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長的種子中。胚乳尤其同化糖類、油和蛋白質(zhì)的代謝前體并且將它們合成為貯藏大分子以灌滿籽粒。
[0009]植物生物量是飼料作物如苜蓿、飼用谷物和干草的產(chǎn)量。產(chǎn)量的許多代用物已經(jīng)用于谷物作物。它們當中主要是對植物尺寸的估計。植物尺寸可以根據(jù)物種和發(fā)育階段以多種方式測量，不過包括總植物干重、地上部分干重、地上部分鮮重、葉面積、莖體積、植物高度、蓮座叢直徑、葉長度、根長度、根質(zhì)量、分蘗數(shù)和葉數(shù)。許多物種維持在給定發(fā)育階段上植物不同部分的尺寸之間的保守比率。這些異速增長關(guān)系用來從這些尺寸量值之一外推至另一種尺寸量值(例如 Tittonell 等，2005Agric Ecosys&Environl05:213)。在發(fā)育早期的植物尺寸一般與發(fā)育中稍后的植物尺寸相關(guān)。具有較大葉面積的較大植物通常可以比較小的植物吸收更多光線和二氧化碳并且因而可能會在相同的時段期間獲得更大重量(Fasoula和Tollenaar2005Maydica50:39)。此外，這也是植物應(yīng)當初始實現(xiàn)較大尺寸的微環(huán)境優(yōu)勢或遺傳優(yōu)勢的潛在延續(xù)。存在針對植物尺寸和生長速率的強遺傳組分(例如ter Steege等，2005Plant Physiologyl39:1078),并且因而對于一系列各異遺傳表型，在一種環(huán)境條件下的植物尺寸很可能關(guān)聯(lián)于另一種環(huán)境條件下的尺寸(Hittalmani等，2003Theoretical Applied Geneticsl07:679)。以這種方式，使用標準環(huán)境作為作物在田間于不同位置及時間所遭遇的多樣且動態(tài)環(huán)境的代用物。
[0010]對于許多作物的另一個重要性狀是早期生長勢。改良早期生長勢是現(xiàn)代稻育種計劃在溫帶和熱帶稻品種方面 的重要目標。長根對于水栽稻中正確土壤固定是重要的。在稻直接播種至被淹沒田地的情況下，以及在植物必須從水中迅速出苗的情況下，較長的苗與生長勢相關(guān)。在實施條播的情況下，較長的中胚軸和胚芽鞘對良好出苗是重要的。將早期生長勢人工改造到植物內(nèi)的能力在農(nóng)業(yè)中將是極重要的。例如，不良的早期生長勢已經(jīng)限制了基于玉米帶種質(zhì)(Corn Belt germplasm)在歐洲大西洋地區(qū)引種玉米(Zea mayes L.)雜種。
[0011]收獲指數(shù)即種子產(chǎn)量對地上部分干重的比率在許多環(huán)境條件下是相對穩(wěn)定的并且因而可以經(jīng)常獲得植物尺寸與谷物產(chǎn)量之間的強相關(guān)(例如Rebetzke等，2002CropScience42:739)。這些過程是內(nèi)在聯(lián)系的，因為谷物生物量的主要部分取決于植物葉和莖的現(xiàn)有和儲備光合生產(chǎn)率(Gardener 等，1985Physiology of Crop Plants.1owa StateUniversity Press,第68-73頁)。因此,選擇植物尺寸(甚至在發(fā)育的早期)已經(jīng)用作未來潛在產(chǎn)能的指示物(例如 Tittonell 等，2005Agric Ecosys & Environl05:213)。當檢驗遺傳差異對脅迫耐受性的影響時，使土壤屬性、溫度、水和養(yǎng)分有效性和光強度標準化的能力是溫室或植物生長室環(huán)境與田間相比的固有優(yōu)勢。然而，產(chǎn)量因不良授粉所致的人為限制可能限制這些受控環(huán)境檢驗產(chǎn)量差異的用途，其中所述的不良授粉因缺少風和昆蟲或成熟根或根冠生長的足夠空間引起。因此，在標準化條件下在生長室或溫室測量發(fā)育早期的植物尺寸是提供潛在遺傳產(chǎn)量優(yōu)勢指示的標準操作。
[0012]另一個重要性狀是改良的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是世界范圍作物損失的主要原因，對于大多數(shù)主要作物植物而言平均產(chǎn)量降低超過50% (Wang等，Planta(2003) 218:1_14)。非生物脅迫可以由干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性養(yǎng)分和氧化脅迫引起。改良植物的非生物脅迫耐受性能力將在世界范圍對農(nóng)民是巨大的經(jīng)濟優(yōu)勢并且將允許在不利條件期間及在本來不可能栽培作物的陸地上栽培作物。
[0013]因而可以通過優(yōu)化前述因素之一提高作物產(chǎn)量。
[0014]取決于最終用途，對某些產(chǎn)量性狀的改良可能優(yōu)先于其他產(chǎn)量性狀。例如對于應(yīng)用如飼料或木材生產(chǎn)或生物燃料資源而言，增加植物營養(yǎng)體部分可能是希望的，而對于應(yīng)用如面粉、淀粉或油生產(chǎn)而言，種子參數(shù)提高可能是特別希望的。即便在種子參數(shù)當中，某些參數(shù)可以更優(yōu)先于其他參數(shù)，這取決于用途。多種機制可以有助于提高種子產(chǎn)量，無論其形式為提高的種子尺寸或提高的種子數(shù)目。
[0015]提高植物中產(chǎn)量(種子產(chǎn)量和/或生物量)的一種方法可以是通過改良植物的內(nèi)在生長機制如細胞周期或參與植物生長或參與防御機制的多種信號傳導(dǎo)途徑。
[0016]關(guān)于BZR，取決于最終用途，對某些產(chǎn)量性狀的改良可能優(yōu)先于其他產(chǎn)量性狀。例如對于應(yīng)用如飼料或木材生產(chǎn)或生物燃料資源而言，增加植物營養(yǎng)體部分可能是希望的，而對于應(yīng)用如面粉、淀粉或油生產(chǎn)而言，種子參數(shù)提高可能是特別希望的。即便在種子參數(shù)當中，某些參數(shù)可以更優(yōu)先于其他參數(shù)，這取決于用途。多種機制可以有助于提高種子產(chǎn)量，無論其形式為提高的種子尺寸或提高的種子數(shù)目或提高的花序數(shù)。
[0017]現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)節(jié)編碼RHLl (無根毛I)的核酸在植物中的表達而改良植物中的多種植物產(chǎn)量相關(guān)性狀。
[0018]另外，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過增加編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)多肽的核酸序列在植物中的表達而相對于對照植物增強植物中的多種種子產(chǎn)量相關(guān)性狀。增強的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀包含以下一項或多項:提高的每株植物總種子產(chǎn)量、提高的飽滿種子數(shù)和提高的收獲指數(shù)。
[0019]另外,現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)節(jié)編碼TRY-樣(Tryptichon)的核酸在植物中的表達而改良植物中的多種生長特征。
[0020]此外，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)節(jié)編碼BZR(SRASSINA卻LE-SESISTANT (抗性))多肽的核酸在植物中的表達而改良植物中的種子產(chǎn)量。
【背景技術(shù)】
[0021]1.無根毛 I (RHLl)
[0022]RHLl 多肽首先由 Schneider 等(Genes Dev.12,2013-2021)于 I"8 年描述為擬南芥(Arabidopsis thaliana)中根毛發(fā)生(initiation)所需的核革巴向蛋白質(zhì)。RHLl對植物界(Viridiplantae)是遍在的。源自不同組織的RHLl的序列比較顯示RHLl多肽具有約30-80%同一性的全序列相似性。RHLl多肽包含大量推定的核定位信號、磷酸化位點和PEST序列，PEST序列是推定的蛋白酶體依賴性蛋白降解基序。據(jù)報導(dǎo)此類基序的出現(xiàn)可通過調(diào)節(jié)topos的亞細胞定位和/或它們與其他蛋白的相互作用賦予一些調(diào)節(jié)性功能。RHLl蛋白質(zhì)的C端與哺乳動物Topo ΙΙ-α蛋白質(zhì)具有弱的但顯著的序列類似性(Sugimoto-Shir asu 等，2005 PNAS 102,18736-17741)。真核 topo II 蛋白質(zhì)屬于解旋復(fù)制雙螺旋DNA所需要的II型topo (IIA型)的子類。在T0P6B，RHLl多肽與植物topo VI蛋白質(zhì)間的物理相互作用已有報導(dǎo)(Sugimoto-Shirasu等,2005)。已建議RHLl多肽在植物細胞的有絲分裂細胞周期和內(nèi)周期(endocycle)內(nèi)對植物topo VI活性復(fù)合體起作用。在RHLl基因中攜帶突變的擬南芥hyp7在核內(nèi)再復(fù)制中展示出極端drawf表型和缺陷(Sugimoto-Shirasu 等，2005)。
[0023]2.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)
[0024]轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase，EC2.3.2.13 ;蛋白質(zhì)-谷氨酸-Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶)是具有一定鈣(Ca)-依賴催化活性范圍的酶家族，其中大部分涉及蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。它們催化與一系列含有伯胺基團的物質(zhì)的蛋白質(zhì)和多肽的共價結(jié)合，例如他它們通常以Ca-依賴模式促進在胺供體底物的伯胺和作為胺受體的蛋白質(zhì)或多肽中肽鍵內(nèi)源谷氨酰胺殘基的Y-羧酰胺基團間的酰胺鍵的形成:
[0025]蛋白谷氨酰胺+烷基胺=蛋白N5-烷基谷氨酰胺+NH3。
[0026]已顯示多胺用作TGases的生理學(xué)底物。多胺在動物、微組織和植物的生長和細胞分裂過程中呈現(xiàn)出重要作用。多胺的作用之一是它們的調(diào)節(jié)作用，這通過酶和結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯后修飾(增加多胺部分)的TGase-介導(dǎo)過程。
[0027]TGases酶在細胞內(nèi)和細胞外發(fā)現(xiàn)，且廣泛分布在細菌、動物和植物中。植物中，在葉綠體中發(fā)現(xiàn)TGase活性。已顯示天線復(fù)合物的核酮糖二磷酸羧化酶_加氧酶和脫輔基蛋白質(zhì)為TGase活性的底物，從而暗示這些酶在光合作用有關(guān)過程中的作用，例如光合系統(tǒng)天線蛋白的保護(Villalobos 等，(2004)Gene336:93-104)。
[0028]在玉米組成型啟動子的調(diào)控下表達編碼大鼠前列腺鈣依賴轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶多肽的基因的轉(zhuǎn)基因稻植物(Claparols 等，(2004)Transgenic Researchl3:195-199)在非活性形式下積累重組酶。
[0029]國際專利申請W02003 / 102128描述了編碼包含此類核酸序列的谷物TGas多肽、載體、微生物和植物的核酸序列，和在食物操控、加工和轉(zhuǎn)化中具有此類TGase活性的多肽的用途。
[0030]出人意料地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn):增加編碼如本文定義的TGase多肽的核酸序列在植物中的表達產(chǎn)生了相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。
[0031]根據(jù)一個實施方案，提供了用于相對于對照植物增強植物中種子產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括增加編碼如本文定義的TGase多肽的核酸序列在植物中的表達。增強的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀包含以下一項或多項:提高的每株植物總種子產(chǎn)量、提高的飽滿種子數(shù)和提高的收獲指數(shù)。
[0032]3.Tryptichon (TRY-樣)
[0033]擬南芥基因Tryptichon編碼據(jù)報導(dǎo)負調(diào)節(jié)trychome發(fā)育并正調(diào)節(jié)根毛發(fā)育的蛋白質(zhì)。擬南芥中的Trichome圖示發(fā)育是用于從初始等價細胞中產(chǎn)生空間模式的模型。Schellmann等(ΕΜΒ0 J.21，5036-5046，2002)表示對側(cè)抑制起作用的Tryptichon基因編碼缺乏可識別活性結(jié)構(gòu)域的單重復(fù)MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。其與基因Caprice的根毛圖示發(fā)育有高度序列相似性。兩種基因都在trichomes中表達并一起在側(cè)抑制中起作用。它們又表示Tryptichon和Caprice豐余性作用于根表皮中位置依賴的細胞命運決定。這樣，從頭圖示發(fā)育和位置依賴的細胞決定似乎都涉及同一種側(cè)抑制機制(Schellmann等，2002)。
[0034]4.BRASSINAZOLE 抗性 I (BZRl)
[0035]基因表達的調(diào)節(jié)是任何細胞存活的關(guān)鍵。幾百種蛋白質(zhì)參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。尤其轉(zhuǎn)錄因子具有主要作用并直接作用于基因啟動子。植物基因組將它們的約7%編碼序列是轉(zhuǎn)錄因子(TF ;Rushton 等，2008Plant Physiologyl47:280-295 (2008))。
[0036]植物編碼特定類的轉(zhuǎn)錄因子，BES或BZR蛋白，其調(diào)芐基因?qū)χ参镱惞檀技に厝缬筒怂仡惞檀?BR)的變動的響應(yīng)。BZR轉(zhuǎn)錄因子(BZRTF)由一般在蛋白質(zhì)的N端發(fā)現(xiàn)并參與與靶定基因啟動子結(jié)合的保守BZRl阻抑物結(jié)構(gòu)域的出現(xiàn)來表征。植物一般編碼少數(shù)BZRTF0例如，擬南芥基因組只包含6個編碼BZR TF基因，而煙草植物中這類TF的家族擴大至編碼19個BZR TF0所有TF包含保守BZRl阻抑物結(jié)構(gòu)域并預(yù)測在BR信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)中起作用。
[0037]擬南芥中，BR信號傳導(dǎo)中的級聯(lián)事件在引起B(yǎng)Kll釋放的BR與BRASSIN0STER0ID不敏感I (BRIl) / BKIl受體復(fù)合物在質(zhì)膜處的結(jié)合時觸發(fā)。隨后BRIl和BRIl相關(guān)受體激酶I (BAKl)的二聚化激活導(dǎo)向BRIIEMS抑制子I (BESl)和BRASSINAZOLE抗性I (BZRl)的下游信號傳導(dǎo)途徑。由激酶磷酸化的BESl和BZRl會通過對蛋白質(zhì)的亞細胞定位和穩(wěn)定的作用調(diào)控它們的信號傳導(dǎo)活性。由激酶BIN2脫磷后的BZRl積累在作為執(zhí)行轉(zhuǎn)錄作用的位點的細胞核中(Wang等，2006Cell Res.16:427-434)。機械地，BZRl家族的轉(zhuǎn)錄因子直接與靶定基因的啟動子結(jié)合并可起激活或抑制表達的作用。
[0038]用于調(diào)節(jié)油菜素類固醇響應(yīng)途徑以修飾植物中大量性狀的方法已公開(US6, 921，848)。如US6，921，848中所定義的性狀包括提高的生長和多種器官和組織中的細胞伸長。然而，這些效果并不導(dǎo)致諸如產(chǎn)生的種子數(shù)量的器官數(shù)量的增加，和/或植物種子廣量的提聞。
[0039]發(fā)明概述
[0040]1.無根毛 I (RHLl)
[0041]出人意料地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn):調(diào)節(jié)編碼RHLl多肽的核酸的表達產(chǎn)生了相對于對照植物具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。
[0042]根據(jù)一個實施方案，提供了用于相對于對照植物增強植物的產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼RHLl多肽的核酸在植物中的表達。增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含植物的提高的早期生長勢、種子產(chǎn)量、種子數(shù)量和收獲指數(shù)。
[0043]2.Tryptichon (TRY-樣)
[0044]出人意料地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn):調(diào)節(jié)編碼TRY-樣多肽的核酸的表達產(chǎn)生了相對于對照植物具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，尤其是提高的出苗生長勢和/或提高的產(chǎn)量的植物。
[0045]根據(jù)一個實施方案，提供了用于相對于對照植物改良產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼TRY-樣多肽的核酸在植物中的表達。改良的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含提高的種子產(chǎn)量，包括總種子重。
[0046]3.BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZRl)
[0047]出人意料地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn):調(diào)節(jié)編碼BZR多肽的核酸的表達產(chǎn)生了相對于對照植物具有提高的種子產(chǎn)量的植物。
[0048]根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，提供了用于相對于對照植物提高植物種子產(chǎn)量的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼BZR多肽的核酸在植物中的表達。
[0049]定義
[0050]多肽/蛋白質(zhì)[0051]術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可相互交換地使用并且指由肽鍵連接起來的任意長度聚合物形式的氨基酸。
[0052]多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
[0053]術(shù)語“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可相互交換地使用并且指任意長度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二者的組合。
[0054]對照棺物
[0055]選擇合適的對照植物是實驗設(shè)計的例行部分并且可以包括對應(yīng)的野生型植物或無目的基因的相應(yīng)植物。對照植物一般是相同的植物物種或甚至是與待評估植物相同的品種。對照植物也可以是待評估植物的失效合子。失效合子是因分離而丟失轉(zhuǎn)基因的個體。如本文中所用的“對照植物”不僅指完整植物，也指植物部分，包括種子和種子部分。
[0056]同源物
[0057]蛋白質(zhì)的“同源物”包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，它們相對于非修飾的所討論蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且與衍生它們的非修飾蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性和功能活性。
[0058]缺失指從蛋白質(zhì)中移除一個或多個氨基酸。
[0059]插入指一個或多個氨基酸殘基被引入蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列內(nèi)插入單個或多個氨基酸。通常，在氨基酸序列內(nèi)部的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小約I至10個殘基級別。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的實例包括如酵母雙雜交系統(tǒng)中所用的轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6-標簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標簽、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag.100表位、c-myc表位、JTLAG?._表位、IacZ, CMP (鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
[0060]取代指以具有相似特性(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α -螺旋結(jié)構(gòu)或β-折疊結(jié)構(gòu)的傾向性)的其他氨基酸替代蛋白質(zhì)的氨基酸。氨基酸取代一般是單個殘基的，但是根據(jù)給予多肽的功能性約束條件，可以是簇集的；插入通常是約I至10個氨基酸殘基級別。氨基酸取代優(yōu)選是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本領(lǐng)域熟知的(見例如 Creighton (1984) Proteins, ff.H.Freeman and Company (編著)和下表 I)。
[0061]表1:保守性氨基酸取代的實例
[0062]
【權(quán)利要求】
1.相對于對照植物在植物中提高種子產(chǎn)量的方法，其包括在植物中調(diào)節(jié)編碼BZR、BRASSINAZOLE-抗性多肽的核酸的表達和任選地選擇具有提高的種子產(chǎn)量的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述BZR多肽包含: (i)SEQ ID NO:239的氨基酸序列； (?)以增加的優(yōu)選順序與SEQ ID NO:239中位于氨基酸定位10-157間的結(jié)構(gòu)域具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性的結(jié)構(gòu)域和/或 (iii)以增加的優(yōu)選順序與SEQID NO:326所代表的bHLH樣結(jié)構(gòu)域具有至少50 %、51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、或99%的序列同一性的結(jié)構(gòu)域和/或 (iv)與表A4的任意多肽的氨基酸序列的50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性；和/或 (V)由 SEQ ID NO:323,SEQ ID NO:324、SEQ ID NO:325 中任一個代表的基序，其中 1、2、3或4殘基可由任意氨基酸取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述調(diào)節(jié)的表達通過在植物中引入和表達編碼BZR多肽的核酸來實現(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的方法，其中所述編碼BZR多肽的核酸編碼表A4中所列的任一蛋白質(zhì)或者是此類核酸的部分，或者是能夠與此類核酸雜交的核酸。
5.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述核酸序列編碼表A4中所給出的任意蛋白質(zhì)的直向同源物或旁系同源物。
6.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述編碼BZR多肽的核酸序列如SEQID NO:238所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的方法，其中所述提高的種子產(chǎn)量選自總種子重、飽滿種子數(shù)和千粒重。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項的方法，其中所述提高的種子產(chǎn)量在非脅迫條件下獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其中所述核酸有效連接至衍生自組成型啟動子的植物，優(yōu)選至GOS2啟動子，最優(yōu)選至來自稻的GOS2啟動子。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的方法，其中所述編碼BZR多肽的核酸是植物來源的，優(yōu)選來自雙子葉植物，進一步優(yōu)選來自十字花科，最優(yōu)選來自擬南芥。
11.植物或其部分，其包括種子，通過根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的方法可獲得，其中所述植物或其部分包含編碼BZR多肽的重組核酸。
12.分離的核酸分子，其包括任一以下特征: (i)SEQID NO:250、252、254、256 中任一個所代表的核酸; (ii)與SEQID NO:250、252、254、256中任一個互補的核酸或其片段;(iii)編碼與SEQID NO:250、252、254、256中之一項以增加的優(yōu)選順序具有至少80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性的BZR多肽的核酸； (iv)能夠在嚴格條件下與上文(i)、(ii)或(iii)中給出的任一核酸雜交的核酸。
13.分尚的多肽,其包括: ⑴氨基酸序列，其與SEQ ID NO:250、252、254、256中之一項以增加的優(yōu)選順序具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性的氨基酸序列；和/或(ii) (i)中給出的任意氨基酸序列的衍生物。
14.構(gòu)建體，其包含 (i)編碼在權(quán)利要求12或13中定義的BZR多肽的核酸、或根據(jù)權(quán)利要求4-6或12中的任一項的核酸； (ii)一個或多個調(diào)控序列，其能夠驅(qū)動(a)的核酸序列的表達；以及任選地 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中所述調(diào)控序列之一是組成型啟動子，優(yōu)選G0S2啟動子，最優(yōu)選來自稻的G0S2啟動子。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的構(gòu)建體在方法中的用途，所述方法用于制備相對于對照植物具有提高的種子產(chǎn)量的植物。
17.用根據(jù)權(quán)利要求14或15的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細胞。
18.用于產(chǎn)生相對于對照植物具有提高的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括: (i)在植物中引入和表達編碼如權(quán)利要求1、2或13中所定義的BZR多肽的核酸、或根據(jù)權(quán)利要求4-6或12中的任一項的核酸；和 (ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細胞；和任選地 (iii)選擇具有種子產(chǎn)量的植物。
19.具有提高的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，其產(chǎn)生自如權(quán)利要求1、2或13中所定義的BZR多肽的編碼核酸的受調(diào)節(jié)表達，或來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求11、17或19的轉(zhuǎn)基因植物或來自其的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、稷、裸麥、黑小麥、高粱和燕麥。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是莖干生物量和/或種子。
22.產(chǎn)物，其來自根據(jù)權(quán)利要求20的植物和/或來自根據(jù)權(quán)利要求21的植物可收獲部分。
23.編碼BZR多肽的核酸在相對于對照植物在植物中提高種子產(chǎn)量中的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中所述BZR多肽如權(quán)利要求1、2或13中任一項所定義，或由根據(jù)權(quán)利要求4-6或12中的任一項的核酸所編碼。
25.用于相對于對照植物增強植物中種子產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括增加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)多肽的編碼核酸序列在植物中表達，其中所述TGase多肽包含(i)質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽；(ii)與如SEQ ID NO:27所代表的包含至少一個卷曲螺旋的結(jié)構(gòu)域以增加的優(yōu)選順序具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多氨基酸序列同一性；(iii)和用于蛋白質(zhì)-谷氨酸-Y -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的綜合相關(guān)酶數(shù)據(jù)庫登錄號 EC2.3.2.13。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述的TGase多肽具有:⑴質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽；(ii)與如SEQ ID NO:45所代表的多肽以增加的優(yōu)選順序具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多氨基酸序列同一性。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法，其中所述TGase多肽與如SEQID NO:45所代表的TGase多肽或與本文表A2中給出的任意多肽序列以增加的優(yōu)選順序具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更多氨基酸序列同一性。
28.根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項的方法，其中所述TGase多肽是這樣的任意多肽，當其在構(gòu)建TGase進化系統(tǒng)樹(如圖5中所繪制的一個進化系統(tǒng)樹)中使用時，與包含SEQID NO:45所代表的多肽序列的TGase多肽進化枝聚類，而不與任何其他進化枝聚類。
29.根據(jù)權(quán)利要求25至28中任一項的方法，其中所述TGase多肽是具有酶活性的多肽，其活性在于通常在Ca-依賴模式下催化在胺供體底物的伯胺和作為胺受體的蛋白質(zhì)或多肽中肽鍵內(nèi)源谷氨酰胺殘基的I—羧酰胺基團間的酰胺鍵的形成。
30.根據(jù)權(quán)利要求25至29中任一項的方法，其中所述的編碼TGase多肽的核酸序列由表A中給出的任一核酸序列SEQ ID NO或其部分、或由能夠與表A2中給出的任一核酸序列SEQ ID NO或其互補序列雜交的序列代表。
31.根據(jù)權(quán)利要求25至30中任一項的方法，其中所述的核酸序列編碼表A2中給出的任意多肽序列SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
32.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一項的方法，其中所述增加的表達由以下任意一種或多種方法實現(xiàn)=T-DNA活化標簽技術(shù)、TILLING或同源重組。
33.根據(jù)權(quán)利要求25至32中任一項的方法，其中所述增加的表達通過在植物中引入并表達編碼TGase多肽的核酸序列實現(xiàn)。
34.根據(jù)權(quán)利要求25至33中任一項的方法，其中所述增強的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀是以下一項或多項:提聞的每株植物總種子廣量、提聞的飽滿種子數(shù)，和提聞的收獲指數(shù)。
35.根據(jù)權(quán)利要求25至34中任一項的方法，其中所述核酸序列有效地連接種子特異性啟動子。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述的種子特異性啟動子是α-球蛋白啟動子，優(yōu)選是稻α -球蛋白啟動子，更優(yōu)選是如SEQ ID NO -J2所代表的α -球蛋白啟動子。
37.根據(jù)權(quán)利要求25至36中任一項的方法，其中所述編碼TGase多肽的核酸序列來自植物，進一步優(yōu)選來自單子葉植物，更優(yōu)選來自禾本科，該核酸序列最優(yōu)選來自稻。
38.由根據(jù)權(quán)利要求25至37中任一項的方法可獲得的植物、其部分(包括種子)或植物細胞，其中所述的植物、其部分或細胞包含編碼TGase多肽的分離的核酸轉(zhuǎn)基因。
39.構(gòu)建體，其包含: (a)編碼如權(quán)利要求25至31任一項中定義的TGase多肽的核酸序列； (b)能夠驅(qū)動(a)的核酸序列表達的一個或多個調(diào)控序列；和任選地 (C)轉(zhuǎn)錄終止序列。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的構(gòu)建體，其中所述的調(diào)控序列是種子特異性啟動子。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的構(gòu)建體，其中所述的種子特異性啟動子是α-球蛋白啟動子，優(yōu)選是稻α-球蛋白啟動子，更優(yōu)選是如SEQ ID ΝΟ:72所代表的α-球蛋白啟動子。
42.根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一項的構(gòu)建體在用于制備植物的方法中的用途，所述植物相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀，其中所述增強的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀是以下一項或多項:提聞的每株植物總種子廣量、提聞的飽滿種子數(shù)和提聞的收獲指數(shù)。
43.用根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一項的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細胞。
44.用于產(chǎn)生相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括: (i)在植物、植物部分或植物細胞中引入并表達的編碼如權(quán)利要求25至31任一項中定義的TGase多肽的核酸序列；和 (ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培育所述植物細胞、植物部分或植物。
45.轉(zhuǎn)基因植物，其相對于對照植物具有因編碼如權(quán)利要求25至31任一項中所定義的TGase多肽的分離核酸序列表達增加引起的增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，或者從所述轉(zhuǎn)基因植物衍生的轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物部分。
46.根據(jù)權(quán)利要求38、43或45的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的植物是作物植物或單子葉植物或谷物植物，如稻、玉米、小麥、大麥、稷、黑麥、小黑麥、高粱和燕麥，或從所述轉(zhuǎn)基因植物衍生的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
47.包含分離的核酸序列的可收獲部分，所述分離的核酸序列編碼根據(jù)權(quán)利要求46的植物的TGase多肽，其中所述的可收獲部分優(yōu)選是種子。
48.產(chǎn)物，其來自根據(jù)權(quán)利要求46的植物和/或從根據(jù)權(quán)利要求47的植物的可收獲部分。
49.編碼如權(quán)利要求25至31任一項中所定義TGase多肽的核酸序列在增強種子產(chǎn)量相關(guān)性狀中的用途，其中所述的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含以下一項或多項:提高的每株植物總種子產(chǎn)量、提高的飽滿種子數(shù)和提高的收獲指數(shù)。
50.相對于對照植物在植物中增強產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中調(diào)節(jié)編碼TRY樣多肽的核酸的表達，其中所述TRY樣多肽包含Myb樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PantherPTHR10641:SF26 ；Gene3D G3DSA:1.10.10.60)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述TRY樣多肽包含基序12至15中的一個或多個(SEQ ID NO:229 至 SEQ ID NO:232)。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51的方法，其中所述調(diào)節(jié)的表達通過在植物中引入和表達編碼TRY樣多肽的核酸來實現(xiàn)。
53.根據(jù)權(quán)利要求50至52任一項的方法，其中所述編碼TRY樣多肽的核酸編碼表A3中所列的任一蛋白質(zhì)或者是此類核酸的部分、或者是能夠與此類核酸雜交的核酸。
54.根據(jù)權(quán)利要求50至53任一項的方法，其中所述核酸序列編碼表A3中所給出的任意蛋白質(zhì)的直向同源物或旁系同源物。
55.根據(jù)權(quán)利要求50至54任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀包括相對于對照植物提高的出苗生長勢和/或提高的產(chǎn)量。
56.根據(jù)權(quán)利要求50至55任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀在非脅迫條件下或在缺氮條件下獲得。
57.根據(jù)權(quán)利要求52至56任一項的方法，其中所述核酸有效連接至根特異性啟動子，優(yōu)選至RCc3啟動子，最優(yōu)選至來自稻的RCc3啟動子，或其中所述核酸與組成型啟動子，優(yōu)選與G0S2啟動子，最優(yōu)選與來自稻的G0S2啟動子有效連接。
58.根據(jù)權(quán)利要求50至57任一項的方法，其中所述編碼TRY樣多肽的核酸是植物來源的，優(yōu)選來自雙子葉植物，進一步優(yōu)選來自十字花科，更優(yōu)選來自擬南芥屬，最優(yōu)選來自擬南芥。
59.通過根據(jù)權(quán)利要求50至52任一項的方法可獲得的植物或其部分，其包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼TRY樣多肽的重組核酸。
60.構(gòu)建體，其包含 (a)編碼在權(quán)利要求50或51中定義的TRY樣多肽的核酸； (b)一個或多個調(diào)控序列，其能夠驅(qū)動(a)的核酸序列的表達；以及任選地 (c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的構(gòu)建體，其中所述調(diào)控序列之一是組成型啟動子，優(yōu)選RCc3啟動子，最優(yōu)選來自稻的RCc3啟動子，或所述調(diào)控序列之一是組成型啟動子，優(yōu)選RCc3啟動子，最優(yōu)選來自稻的RCc3啟動子。
62.根據(jù)權(quán)利要求60或61的構(gòu)建體在方法中的用途，所述方法用于制備相對于對照植物具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，特 別是提高的出苗生長勢和/或提高的種子產(chǎn)量的植物。
63.用根據(jù)權(quán)利要求60或61的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細胞。
64.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述植物相對于對照植物具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，特別是提高的出苗生長勢和/或提高的種子產(chǎn)量，所述方法包括: (i)在植物中引入和表達編碼如權(quán)利要求50或51中所定義的TRY樣多肽的核酸；和 (ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細胞。
65.相對于對照植物具有提高的出苗生長勢和/或提高的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物獲得自編碼如權(quán)利要求50或51所定義的TRY樣多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達，或來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
66.根據(jù)權(quán)利要求59、63或65的轉(zhuǎn)基因植物或來自其的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、稷、裸麥(rye)、黑小麥、高粱、二粒小麥(emmer)、斯佩爾特小麥(spelt)、黑麥屬(secale)、單粒小麥(einkorn)、埃塞俄比亞畫眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麥。
67.根據(jù)66的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。
68.產(chǎn)物，其來自根據(jù)權(quán)利要求66的植物和/或來自根據(jù)權(quán)利要求67的植物可收獲部分。
69.編碼TRY樣多肽的核酸在相對于對照植物在植物中提高出苗生長勢和/或提高產(chǎn)量中的用途。
【文檔編號】C12N15/54GK103789343SQ201410047976
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日:2008年6月26日
【發(fā)明者】Y·海茨費爾德, V·弗蘭卡德, S·范德納比利 申請人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司