具有催化活性的人源尿酸氧化酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一系列具有催化活性的人源尿酸氧化酶，編碼它們的DNA序列，含有該DNA序列的表達(dá)載體，以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。該人源尿酸氧化酶具有以SEQ?ID?NO:17為基礎(chǔ)進(jìn)行具體位點(diǎn)氨基酸殘基替換、或者進(jìn)行外顯子位點(diǎn)氨基酸殘基替換得到的重組氨基酸殘基序列。本發(fā)明成功復(fù)活了人類尿酸氧化酶假基因，使之表達(dá)出具有催化活性的人源尿酸氧化酶，具有制備低免疫原性甚至無免疫原性降尿酸藥物的良好前景。
【專利說明】具有催化活性的人源尿酸氧化酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一系列具有催化活性的人源尿酸氧化酶，編碼它們的DNA序列，含有該DNA序列的表達(dá)載體，以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù) 申請人:了解，尿酸氧化酶(Uricase, Urate oxidase, ECl.7.3.3)參與生物體嘌呤代謝途徑，它可結(jié)合分子氧和水分子將尿酸催化降解成尿囊素、CO2和H2O2 (Ramazzina I, Folli C，Secchi A et al.Nat.Chem Biol.2006.2:144 - 148)。由于結(jié)構(gòu)域搜索發(fā)現(xiàn)尿酸氧化酶含有銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，研究者一度認(rèn)為尿酸氧化酶屬于銅離子結(jié)合酶，然而后來的研究表明，尿酸氧化酶行使催化功能并不需要銅離子參與(ChuRYj Lin YLj Rao MS et al.Annals of the New York Academy of Sciences.1996.804:781-786)。目前研究者普遍認(rèn)為，尿酸氧化酶為同源四聚體蛋白，它具有四個(gè)活性中心，且各活性中心分別位于二聚體界面處(Retailleau P, Vivares D, BonneteF et al.ActaCrystallogr.2004.60:453 - 462)。
[0003]在人科動(dòng)物[指人類(HomoSpiens),黑猩猩(Pan troglodytes),猩猩(Pongopygmaeus abelii)，大猩猩(Gorilla gorilla)和長臂猿(Nomascus Ieucogenys)]漫長的進(jìn)化過程中，尿酸氧化酶基因突變成為假基因，導(dǎo)致人科動(dòng)物體內(nèi)缺少活性尿酸氧化酶。目前，尿酸氧化酶在人類等人科動(dòng)物體內(nèi)功能缺失的進(jìn)化意義仍然未知，較多研究者認(rèn)為這種功能缺失由于在人類早期進(jìn)化中具有優(yōu)勢而被保留(KEILIN，Biol.Rev.J.1959.34:265 - 296)，然而現(xiàn)代人類卻因此承受著體內(nèi)尿酸水平過高導(dǎo)致的諸多病癥。
[0004]人體內(nèi)的嘌呤經(jīng)過一系列酶的催化形成尿酸。尿酸是pKa為5.75的二元有機(jī)弱酸，在生理?xiàng)l件下，98%的尿酸以單鈉尿酸鹽的形式存在。由于人體內(nèi)缺乏活性尿酸氧化酶，導(dǎo)致人的血漿中尿酸含量高于具有活性尿酸氧化酶的動(dòng)物的血漿中尿酸含量。在正常嘌呤飲食狀態(tài)下，兩次空腹血尿酸水平男性高于420ymol/L,女性高于360ymol/L，即稱為高尿酸血癥。造成高尿酸血癥的因素有多種，一般與飲食行為(如過食嘌呤含量高的食物，酗酒)、服用 藥物(如利尿藥物，免疫抑制藥物)、腎功能以及性別和年齡等有關(guān)。高尿酸血癥可分為急性和慢性兩種:(1)急性高尿酸血癥通常并發(fā)于血液惡性腫瘤化療；由于血液惡性腫瘤化療造成機(jī)體細(xì)胞大量凋亡并釋放大量嘌呤，短時(shí)間內(nèi)，嘌呤代謝形成大量尿酸，導(dǎo)致血漿尿酸水平急劇升高，造成急性高尿酸血癥；由于人體內(nèi)大部分尿酸經(jīng)腎臟排出體外，因此若不針對急性高尿酸血癥進(jìn)行及時(shí)有效地處理，則很可能造成急性腎衰竭(StampLK, O’Donnell JL, Chapman PT.1ntern.Med.J.2007.37:258 - 266)。(2)慢性高尿酸血癥通常由人體內(nèi)嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致血漿內(nèi)尿酸水平長期過高而導(dǎo)致；慢性高尿酸血癥常?？梢猿掷m(xù)數(shù)年或者數(shù)十年，由于尿酸鹽在血液中的溶解度很低，慢性高尿酸血癥往往導(dǎo)致尿酸結(jié)晶堆積在組織和關(guān)節(jié)處，進(jìn)而引起急性炎癥反應(yīng)，并最終演變成嚴(yán)重的痛風(fēng)；尿酸結(jié)晶沉積于腎臟、關(guān)節(jié)和軟組織會(huì)導(dǎo)致慢性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)炎和/或腎病變；尿酸結(jié)晶沉積于結(jié)締組織會(huì)形成肉芽腫，并發(fā)展成痛風(fēng)石。此外，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥與高血壓、高甘油三脂血癥、腎臟損害、糖尿病、冠心病、代謝綜合征等疾病也密切相關(guān)；如Ruggiero等報(bào)道,血液中尿酸參與了多種炎癥反應(yīng)(Ruggiero C，CherubiniA, BlelA et al.European Heart Journal.2006.27:1174 - 1181)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，高尿酸血癥導(dǎo)致亞洲人群高血壓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加57%，總死亡風(fēng)險(xiǎn)增加8%，心血管疾病死亡風(fēng)險(xiǎn)增加21%，冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加9%，冠心病死亡風(fēng)險(xiǎn)增加16%，腎功能降低風(fēng)險(xiǎn)增加21%，因慢性腎病死亡風(fēng)險(xiǎn)增加68%，卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加47%，卒中死亡風(fēng)險(xiǎn)增加26%。
[0005]近年來，隨人們生活水平的提高，痛風(fēng)和高尿酸血癥的發(fā)病率有增高趨勢，且發(fā)病年齡有低齡化趨勢，其臨床治療手段主要有:改變病人生活方式(如戒酒、少食富含嘌呤的食物)，使用利尿藥物加快尿酸的排泄，使用黃嘌呤氧化酶抑制劑抑制尿酸的生物合成，輔以抗炎藥物提高病人生活質(zhì)量，等等。目前針對痛風(fēng)和高尿酸血癥并沒有很好的治療方案，直到2008、2009年，歐洲和美國才分別出臺(tái)了關(guān)于痛風(fēng)診斷和治療的守則。由于缺乏有效的治療藥物，迄今為止別嘌呤醇依然是治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的首選藥物，但是別嘌呤醇具有較強(qiáng)的腎臟毒性，長期服用會(huì)降低病人的治療依從性，且對于腎功能不全者必須降低使用劑量，而在亞治療劑量條件下卻無法滿足降低尿酸水平至360 μ mol/L的治療目標(biāo)，導(dǎo)致這些患者會(huì)逐漸發(fā)展成難治性痛風(fēng)，患有難治性痛風(fēng)的患者其痛風(fēng)發(fā)作頻率提高，并發(fā)癥也增加，患者的生活質(zhì)量受到很大影響。除別嘌呤醇外，苯溴馬隆和丙磺舒作為促尿酸排泄藥物也已應(yīng)用數(shù)年，但是它們在高尿酸癥治療方案中的真正地位尚未明確；2008年，歐洲藥物協(xié)會(huì)批準(zhǔn)了 Febuxostat (—種非嘌呤性黃嘌呤氧化酶抑制劑)用于治療痛風(fēng)，這才使痛風(fēng)的治療多了一種選擇。痛風(fēng)治療的目的是通過藥物來降低血漿內(nèi)尿酸水平并形成尿酸負(fù)平衡，進(jìn)而阻止尿酸晶體形成，降低痛風(fēng)發(fā)作頻率。從理論上來說，使用傳統(tǒng)治療方案溶解痛風(fēng)石通常需要數(shù)年時(shí)間，然而目前事實(shí)上還沒有以傳統(tǒng)治療方案完全溶解痛風(fēng)石的案例。
[0006]尿酸氧化酶可將尿酸降解成溶解度更高的尿囊素，能快速降低人體血漿尿酸水平，并促進(jìn)痛風(fēng)石溶解，具有研制成高尿酸血癥和痛風(fēng)治療藥物的良好前景。目前已有由具有高效尿酸分解活性的黃曲霉來源重組尿酸氧化酶研制而成的拉布立酶和ELITEK，它們先后于2001年、2002年用于治療腫瘤溶解綜合征引起的高尿酸血癥，然而，黃曲霉來源重組尿酸氧化酶的免疫原性問題限制了它們在痛風(fēng)治療中的應(yīng)用。
[0007]非人源的尿酸氧化酶作為外源治療蛋白，可誘發(fā)快速而強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)、溶血反應(yīng)，并產(chǎn)生抗體影響該藥物體內(nèi)生物活性和藥物療效的發(fā)揮，如何降低或消除尿酸氧化酶的免疫原性已成為擴(kuò)大尿酸氧化酶應(yīng)用規(guī)模必須突破的重要課題。研究者曾考慮修飾尿酸氧化酶以降低其免疫原性，但在修飾后尿酸氧化酶催化活性大大降低，同時(shí)其免疫原性卻未能完全消除(Chen RH-L, Abuchowski A, Es TV et al.Biochim.Biophys.Acta.1981.660:293 - 298;Tsuji J, Hirose K, Kasahara E et al.1nt.J.1mmunopharmaco
1.1985.7:725-730)。比較成功的修飾是以PEG (即聚乙二醇)對尿酸氧化酶進(jìn)行共價(jià)修飾；2010年,美國FDA批準(zhǔn)PEG修飾的豬-狒狒尿酸氧化酶的嵌合體Krystexxa上市,Krystexxa用于治療傳統(tǒng)治療方法無效或者不耐受的痛風(fēng)病人，在為期一年的臨床I期、II期試驗(yàn)中，共有212位有痛風(fēng)癥狀的病人參加，試驗(yàn)證明Krystexxa能有效地降低血液中尿酸水平，減少尿酸結(jié)晶在關(guān)節(jié)和軟組織的沉積；但在臨床試驗(yàn)中，有四分之一的病人經(jīng)歷了嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，以及其它的不良反應(yīng):如痛風(fēng)發(fā)作、惡心、注射部位瘀傷、便秘、胸痛和嘔吐等(Corinne SY, William H, Michelle AB et al.J.Clin.Pharmacol.2008.48:708 - 718)。長期以來，研究者認(rèn)為PEG對人體沒有免疫原性，將PEG與蛋白質(zhì)藥物共價(jià)連接，不但能延長蛋白質(zhì)藥物的半衰期，而且能減少蛋白質(zhì)藥物的免疫原性，但Ganson等在進(jìn)行皮下注射PEG修飾尿酸氧化酶的I期臨床實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，有的病人血清中產(chǎn)生了抗PEG的抗體，這就限制了某些病人治療的有效性(Ganson N, Kelly S，Scarlett E et al.ArthritisResearch&Therapy2005.8:R12)。因此，PEG對人體的免疫原性尚未定論，還需要做進(jìn)一步調(diào)查研究，確保PEG修飾的蛋白質(zhì)藥物臨床使用的安全性和有效性。
[0008]根據(jù)免疫學(xué)理論，抗原來源和人類的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與抗原的免疫原性相關(guān):抗原來源與人類親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，則抗原的組成成分(如蛋白質(zhì)或多肽等)與人類的同源程度越低，免疫原性則越強(qiáng)，越易被人類淋巴細(xì)胞克隆作為抗原異物識(shí)別，產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答；反之，抗原來源與人類的親緣關(guān)系越近，則免疫原性越弱(呂昌龍，李殿俊，李一.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)(第六版)，高等教育出版社)。有基于此，若能改造人類尿酸氧化酶假基因，使之“復(fù)活”，能表達(dá)出具有催化活性的人源尿酸氧化酶，則必然能降低其在人體應(yīng)用中的免疫原性，甚至不產(chǎn)生免疫原性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一系列具有催化活性的人源尿酸氧化酶及其用途。
[0010]本發(fā)明的其它目的是:提供與上述人源尿酸氧化酶相關(guān)的編碼基因、表達(dá)載體及宿主細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0012]一種具有催化活性的人源尿酸氧化酶，其特征是，具有將SEQ ID NO: 17所示序列進(jìn)行若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換所得的重組氨基酸殘基序列；所述若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換至少包括8個(gè)主要位點(diǎn)替換；
[0013]所述主要位點(diǎn)替換選自:第112位甲硫氨酸替換為纈氨酸或異亮氨酸；第119位組氨酸替換為精氨酸；第208位賴氨酸替換為谷氨酸或天冬氨酸；第219位甲硫氨酸替換為亮氨酸；第222位絲氨酸替換為苯丙氨酸；第232位賴氨酸替換為絲氨酸；第233位蘇氨酸替換為丙氨酸?’第240位半胱氨酸替換為酪氨酸。
[0014]優(yōu)選地，所述若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換由8個(gè)主要位點(diǎn)替換、0-1個(gè)二級(jí)位點(diǎn)替換、0-1個(gè)三級(jí)位點(diǎn)替換、0-4個(gè)四級(jí)位點(diǎn)替換、0-3個(gè)五級(jí)位點(diǎn)替換組成；
[0015]所述二級(jí)位點(diǎn)替換選自:第151位谷氨酰胺替換為脯氨酸或者異亮氨酸；
[0016]所述三級(jí)位點(diǎn)替換選自:第24位谷氨酸替換為天冬氨酸或者丙氨酸；
[0017]所述四級(jí)位點(diǎn)替換選自:第115位異亮氨酸替換為組氨酸；第141位半胱氨酸替換為纈氨酸；第145位谷氨酰胺替換為纈氨酸；第214位異亮氨酸替換為丙氨酸；
[0018]所述五級(jí)位點(diǎn)替換選自:第83位谷氨酸替換為甘氨酸;第121位甘氨酸替換為谷氨酸；第252位丙氨酸替換為谷氨酸；
[0019]當(dāng)所述二級(jí)位點(diǎn)替換數(shù)量為O時(shí),所述三級(jí)、四級(jí)、五級(jí)位點(diǎn)替換數(shù)量均為O ;當(dāng)所述三級(jí)位點(diǎn)替換數(shù)量為O時(shí),所述四級(jí)、五級(jí)位點(diǎn)替換數(shù)量均為O。
[0020]優(yōu)選地，所述重組氨基酸殘基序列為SEQ ID N0:8至SEQ ID NO: 16之一。[0021]本發(fā)明還提供:一種具有催化活性的人源尿酸氧化酶，其特征是，具有將SEQ IDNO: 17所示序列進(jìn)行若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換所得的重組氨基酸殘基序列；所述若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換由I個(gè)主外顯子位點(diǎn)替換、2至7個(gè)次外顯子位點(diǎn)替換組成；
[0022]所述主外顯子位點(diǎn)替換選自--第212至252位氨基酸殘基序列替換為SEQ IDNO: 18的第212至252位氨基酸殘基序列；
[0023]所述次外顯子位點(diǎn)替換選自:第I至10位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第I至10位氨基酸殘基序列；第11至83位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第11至83位氨基酸殘基序列；第84至122位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第84至122位氨基酸殘基序列；第123至148位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第123至148位氨基酸殘基序列；第149至211位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第149至211位氨基酸殘基序列；第253至280位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第253至280位氨基酸殘基序列；第281至305位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第281至305位氨基酸殘基序列。[0024]優(yōu)選地，所述重組氨基酸殘基序列為SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 7之一。
[0025]需要指出的是，主外顯子位點(diǎn)替換中包括--第222位絲氨酸替換為苯丙氨酸；第232位賴氨酸替換為絲氨酸；第240位半胱氨酸替換為酪氨酸；而這三個(gè)位點(diǎn)同樣包含于主要位點(diǎn)替換之中。
[0026]本發(fā)明還涉及:
[0027]上述人源尿酸氧化酶用于制備降尿酸藥物的用途。
[0028]含有上述人源尿酸氧化酶的藥物組合物。
[0029]編碼上述人源尿酸氧化酶的基因序列。
[0030]含有上述基因序列的表達(dá)載體。
[0031]含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0032]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明成功復(fù)活了人類尿酸氧化酶假基因，使之表達(dá)出具有催化活性的人源尿酸氧化酶，具有制備低免疫原性甚至無免疫原性降尿酸藥物的良好前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1為人尿酸氧化酶假基因各外顯子及應(yīng)用SOE-PCR技術(shù)獲得的全長人尿酸氧化酶基因瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中，Ml為50-500bp標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker ；1為外顯子1_2 ；2為外顯子3 ；3為外顯子4 ；4為外顯子5 ；5為外顯子6 ；6為外顯子7 ；7為外顯子8 ；8為全長人尿酸氧化酶基因；M2為100-1200bp標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量MarkerII。
[0034]圖2為消除了第33位和187位終止突變的人尿酸氧化酶SDS-PAGE凝膠蛋白電泳圖。圖中，I為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker ；2為無IPTG誘導(dǎo)；3為IPTG誘導(dǎo)的dHU蛋白；4為空宿主菌。
[0035]圖3為豬尿酸氧化酶基因瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中,M為標(biāo)準(zhǔn)分子量marker ；1為豬尿酸氧化酶基因。
[0036]圖4為豬尿酸氧化酶SDS-PAGE凝膠蛋白電泳圖。圖中，I為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker ；2 為無 IPTG 誘導(dǎo)；3 為 0.1mM IPTG 誘導(dǎo)；4 為 0.2mM IPTG 誘導(dǎo)；5 為 0.4mM IPTG誘導(dǎo)；6為0.6mM IPTG誘導(dǎo)；7為0.8mM IPTG誘導(dǎo)。[0037]圖5為14種不同來源的尿酸氧化酶氨基酸殘基序列比對圖。圖中，蛋白質(zhì)序列用標(biāo)準(zhǔn)的單字母表示，“一”表示終止密碼子，序列上面的數(shù)字與消除了 33位及187位終止密碼子的人尿酸氧化酶(dHU) —致；人類(human)、黑猩猩(chimpanzee)、大猩猩(gorilla)、紅毛猩猩(orangutan)和長臂猿(gibbon)的尿酸氧化酶氨基酸殘基序列是利用生物信息學(xué)軟件根據(jù)其假基因序列的外顯子進(jìn)行推導(dǎo)得出的，它們的假基因序列分別來自 GenBank(GenBank ID:AB074326.2, AB074334.2, AB074342.2, AB074350.2, andAB074358.2);狒狒(baboon)、恒河猴(rhesus)、食蟹猴(crabeating)、夜猴(Aotus)、兔子(rabbit)、小鼠(mice)、狗(canine)、牛(bovine)、豬(porcine)的尿酸氧化酶氨基酸殘基序列來自于 GenBank (GenBank ID:BAB91554.1,ΒΑΒ91555.1,ΒΑΒ91556.1，ΒΑΒ91557.I, ΝΡ_001121545.1, ΝΡ_033500.1, ΝΡ_001069116.1, ΝΡ_001011886.1, ΝΡ_999435.1)。
【具體實(shí)施方式】
[0038]1.本發(fā)明的主要技術(shù)構(gòu)思
[0039]據(jù)發(fā)明人所知，人尿酸氧化酶假基因由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，作為復(fù)制型假基因，它保留了功能基因完整的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
[0040]為研究人尿酸氧化酶假基因失活的機(jī)制，發(fā)明人將從培養(yǎng)的人肝臟細(xì)胞中提取得到的人類基因組作為模板，根據(jù)GenBank中公布的人尿酸氧化酶假基因各外顯子序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到人尿酸氧化酶假基因的8個(gè)外顯子基因序列，接著應(yīng)用SOE-PCR技術(shù)將人尿酸氧化酶假基因的8個(gè)外顯子基因序列連接起來，并設(shè)計(jì)引物消除了位于第33和187位的終止突變，最后構(gòu)建得到重組人尿酸氧化酶基因工程菌，所得人尿酸氧化酶的氨基酸殘基序列如SEQ ID NO: 17所示。
[0041]但是，恢復(fù)人尿酸氧化酶假基因的功能絕非僅僅將編碼區(qū)終止密碼子回復(fù)突變就能實(shí)現(xiàn)，上述工程菌表達(dá)的重組人尿酸氧化酶根本沒有尿酸分解活性。
[0042]發(fā)明人據(jù)此推斷，在人類漫長的進(jìn)化過程中，尿酸氧化酶基因因發(fā)生有害的初級(jí)突變而導(dǎo)致體內(nèi)尿酸氧化酶失活，形成假基因；此后，由于該基因無法像正常基因一樣經(jīng)歷進(jìn)化選擇，相當(dāng)于逃避了選擇壓力，導(dǎo)致有害的次級(jí)突變不斷積累，這無疑為人尿酸氧化酶基因失活機(jī)制的研究、及復(fù)活人尿酸氧化酶假基因增大了難度。
[0043]為尋找人尿酸氧化酶基因中引起尿酸分解活性下降以致失活的有害突變在人尿酸氧化酶假基因外顯子中的分布區(qū)域，發(fā)明人采用了以下方法:用有活性的哺乳動(dòng)物尿酸氧化酶為模板，與沒有活性的人尿酸氧化酶基因進(jìn)行對應(yīng)外顯子替換，構(gòu)建人尿酸氧化酶嵌合體， 從而確定有害突變的分布區(qū)域。
[0044]本發(fā)明中，由于豬尿酸氧化酶具有高尿酸分解活性，且與人尿酸氧化酶假基因有高達(dá)90%的同源性，因此發(fā)明人選擇豬尿酸氧化酶基因作為外顯子替換的模板，具體過程為:發(fā)明人從豬肝組織中提取得到豬肝臟細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法得到豬尿酸氧化酶基因，構(gòu)建獲得重組豬尿酸氧化酶基因工程菌，重組豬尿酸氧化酶能夠表達(dá)并且表現(xiàn)出較高的尿酸分解活性。
[0045]本發(fā)明中，根據(jù)豬尿酸氧化酶和人尿酸氧化酶各外顯子序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用SOE-PCR技術(shù)，發(fā)明人成功構(gòu)建了 10個(gè)重組人-豬尿酸氧化酶基因工程菌，并獲得10個(gè)人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白(氏_丨3_8、Pp2H3P4I ΡηΗ4Ρ5_8、PhH5P6_8、Pp5H6P7I Pp6H7I!V5P6H7^ H1H H1_2P3H4P5_6H7_8, H1P2H8)，這10個(gè)人-豬尿酸氧化酶嵌合蛋白表現(xiàn)出了不同的尿酸分解活性。需要說明的是，人尿酸氧化酶與豬尿酸氧化酶基因具有相同的外顯子數(shù)目，均為八個(gè)外顯子，共表達(dá)304個(gè)氨基酸(人尿酸氧化酶的氨基酸殘基序列如SEQ ID NO: 17所示，豬尿酸氧化酶的氨基酸殘基序列如SEQ ID NO: 18所示)，且每個(gè)外顯子
對應(yīng)的氨基酸殘基數(shù)目也一致洱、4........H8分別表示I至8號(hào)人尿酸氧化酶外顯子對
應(yīng)的氨基酸殘基序列；P1、P2........P8分別表示I至8號(hào)豬尿酸氧化酶外顯子對應(yīng)的氨基酸殘基序列；其中，第I至10位氨基酸殘基對應(yīng)于I號(hào)外顯子，第11至83位氨基酸殘基對應(yīng)于2號(hào)外顯子，第84至122位氨基酸殘基對應(yīng)于3號(hào)外顯子，第123至148位氨基酸殘基對應(yīng)于4號(hào)外顯子，第149至211位氨基酸殘基對應(yīng)于5號(hào)外顯子，第212至252位氨基酸殘基對應(yīng)于6號(hào)外顯子，第253至280位氨基酸殘基對應(yīng)于7號(hào)外顯子，第281至305位氨基酸殘基對應(yīng)于8號(hào)外顯子。
[0046]根據(jù)上述各嵌合蛋白尿酸分解活性的高低，發(fā)明人確定了有害的錯(cuò)義突變在人尿酸氧化酶假基因各外顯子中的分布區(qū)域。
[0047]接著，發(fā)明人應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)，對14種不同生物來源(人、黑猩猩、猩猩、大猩猩、長臂猿、狒狒、獼猴、食蟹猴、夜猴、家兔、小鼠、狗、牛、豬)的尿酸氧化酶氨基酸殘基序列進(jìn)行了比對(如圖5所示)，除第33和187位終止突變位點(diǎn)以外，在人尿酸氧化酶假基因上發(fā)現(xiàn)了另外13個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，分別位于第24、83、112、119、121、151、208、219、222、232、233,240,252 位。
[0048]發(fā)明人認(rèn)為，復(fù)活人尿酸氧化酶假基因的前提條件是必須首先鑒別出13個(gè)錯(cuò)義突變中的有害突變，然后對這些有害突變逐一進(jìn)行修復(fù)。
[0049]根據(jù)蛋白質(zhì)聞級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，可逐一考察上述13個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)氣基酸殘基在蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置及其發(fā)揮的功能。由于哺乳動(dòng)物來源的尿酸氧化酶在PH9以下不穩(wěn)定且溶解度低，獲得蛋白質(zhì)結(jié)晶非常困難，因此難以應(yīng)用X-射線晶體衍射技術(shù)測定哺乳動(dòng)物來源尿酸氧化酶的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0050]同源模建是預(yù)測哺乳動(dòng)物來源尿酸氧化酶的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的有效方法，發(fā)明人將已知的黃曲霉來源尿酸氧化酶(AFU)晶體結(jié)構(gòu)作為模板，模建得到了無活性人尿酸氧化酶(dHU)的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，通過對比分析13個(gè)突變位點(diǎn)氨基酸殘基在AFU和dHU高級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置及功能，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)13個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)中，某些位點(diǎn)的突變對于尿酸氧化酶尿酸分解活性影響較小，而有些位點(diǎn)的突變對于尿酸氧化酶活性起著至關(guān)重要的作用，這些突變將直接導(dǎo)致尿酸氧化酶的尿酸分解活性降低甚至消失。
[0051]在確定了人尿酸氧化酶假基因中的有害突變位點(diǎn)后，發(fā)明人根據(jù)這些有害突變在人尿酸氧化酶假基因外顯子中的分布區(qū)域、以及外顯子替換實(shí)驗(yàn)中得到的一系列人-豬嵌合蛋白尿酸氧化酶活性的分析結(jié)果，應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)，先后構(gòu)建了一系列重組人尿酸氧化酶突變體基因工程菌，獲得了一系列重組人尿酸氧化酶突變體，在這些突變體中，有的尿酸分解活性略低于豬尿酸氧化酶，有的尿酸分解活性與豬尿酸氧化酶相當(dāng)。至此，本發(fā)明即成功復(fù)活了人尿酸氧化酶假基因，獲得了有活性的人尿酸氧化酶?？梢詳喽ǖ氖?，本發(fā)明復(fù)活得到的活性人尿酸氧化酶應(yīng)為人類的祖先蛋白，與現(xiàn)代人類的親緣關(guān)系最為接近，根據(jù)免疫學(xué)原理，該蛋白作為痛風(fēng)及高尿酸血癥的治療藥物應(yīng)在人體中具有較低甚至沒有免疫原性。[0052]至此，本發(fā)明可提供兩種有活性的人源尿酸氧化酶:一種為在無活性人源尿酸氧化酶基礎(chǔ)上，于具體位點(diǎn)替換氨基酸后獲得的人源尿酸氧化酶；另一種為在無活性人源尿酸氧化酶基礎(chǔ)上，將具體外顯子替換為豬尿酸氧化酶的相應(yīng)外顯子獲得的人源尿酸氧化酶。
[0053]本發(fā)明還涉及編碼上述人源尿酸氧化酶的基因序列，包括RNA、DNA等多核苷酸，其中DNA包括cDNA以及人工合成DNA等，DNA可以為雙鏈或單鏈。具體的基因序列可因冗余或遺傳密碼的兼并而有所不同。上述基因序列可包括:(I)僅上述人源尿酸氧化酶的編碼基因序列；(2)含有上述人源尿酸氧化酶的編碼基因序列及額外的編碼基因序列(如前導(dǎo)或分泌序列或前蛋白質(zhì)序列)；(3)上述人源尿酸氧化酶的編碼基因序列及非編碼基因序列(如內(nèi)含子，或突變蛋白編碼序列5’和/或3’端的非編碼序列)。因此，術(shù)語“編碼上述人源尿酸氧化酶的基因序列”所指的多核苷酸可能不僅含有上述人源尿酸氧化酶的編碼基因序列，還含有包括額外編碼基因序列和/或非編碼基因序列的多核苷酸。
[0054]本發(fā)明將上述基因序列與相應(yīng)表達(dá)載體進(jìn)行有效連接后，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中表達(dá)。上述載體能以附加體或整合到宿主染色體的形式在宿主生物中進(jìn)行復(fù)制；在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下，上述人源尿酸氧化酶可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá),也可以利用由本發(fā)明DNA構(gòu)建體衍生的RNA、通過無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生上述人源尿酸氧化酶。[0055]對于宿主，優(yōu)選大腸桿菌來克隆本發(fā)明上述基因序列；其它適用的微生物宿主包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、假單胞菌菌屬(Pseudomonas)和葡萄球菌屬(Staphy lococcus)等。此外，也可以在這些原核宿主中制備表達(dá)載體，還可具有眾多公知啟動(dòng)子中的任一種，如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸啟動(dòng)子系統(tǒng)、β -內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)或噬菌體λ或Τ7來源的啟動(dòng)子系統(tǒng)；通常這些啟動(dòng)子會(huì)控制表達(dá)，且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等，以便起始和完成轉(zhuǎn)錄及翻譯。
[0056]酵母或真菌等其它微生物也可用于表達(dá)本發(fā)明上述人源尿酸氧化酶。優(yōu)選的酵母宿主有畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)以及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia angusta);真菌宿主包括黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei )及裂裙菌(Schizophyllumcommune),也可選擇使用其它真菌。
[0057]哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液可用于表達(dá)本發(fā)明上述人源尿酸氧化酶。優(yōu)選的細(xì)胞包括:CHO細(xì)胞系、多種COS細(xì)胞系、NOS細(xì)胞、敘利亞地鼠(Syrian Hamster)卵巢細(xì)胞系、Hela細(xì)胞或人肽細(xì)胞系(即HEK293、HEK293EBNA)。
[0058]此外，可以通過公知方法將含有上述基因序列的載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)，所采用的具體方法取決于細(xì)胞宿主的類型。例如，對原核細(xì)胞通常采用氯化鈣轉(zhuǎn)化法，而對于其它細(xì)胞宿主可以使用磷酸鈣處理或電穿孔法。
[0059]2.本發(fā)明已獲得的活性人源尿酸氧化酶氨基酸殘基序列
[0060](I)人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白H8，其序列為SEQ ID:1 ；
[0061](2)人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白Pp2H3P^8，其序列為SEQ ID:2 ；
[0062](3)人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白PnH4Pp8，其序列為SEQ ID:3 ；
[0063](4)人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白PhH5P6^，其序列為SEQ ID:4 ；[0064](5)人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白PhIV8，其序列為SEQ ID:5 ；
[0065](6)人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白^3呀5_6!17_8，其序列為SEQ ID:6 ；
[0066](7)人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白！^2_3!^5_6!17_8，其序列為SEQ ID:7 ；
[0067](8)對 SEQ ID NO: 17 的第 112、119、208、219、222、232、233、240 位進(jìn)行氨基酸殘基替換得到的人源尿酸氧化酶，表示為 M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，其序列為SEQ ID:8 ；
[0068](9)對 M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y (SEQ ID:8)的第112,208位進(jìn)行氨基酸殘基替換得到的人源尿酸氧化酶，表示為M1121-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，其序列為 SEQ ID:9 ；
[0069](10)對 M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y (SEQ ID:8)的第151位進(jìn)行氨基酸殘基替換得到的人源尿酸氧化酶，表示為M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，其序列為 SEQ ID:10 ；
[0070](11)對 M1121-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y (SEQ ID:9)的第151位進(jìn)行氨基酸殘基替換得到的人源尿酸氧化酶，表示為M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，其序列為 SEQ ID:11 ；
[0071](12)對 M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y (SEQ ID:
10)的第24、83、121、252位進(jìn)行氨基酸殘基替換得到的人源尿酸氧化酶，表示為E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E，其序列為SEQ ID:12 ；
[0072](13)對 M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y (SEQ ID:
11)的第24位進(jìn)行氨基酸殘基替換得到的人源尿酸氧化酶，表示為E24A-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，其序列為 SEQ ID:13 ；
[0073](14)對 E24A-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y (SEQID:13)的第141、145位進(jìn)行氨基酸殘基替換得到的人源尿酸氧化酶，表示為Ε24Α-Μ112Ι-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,其序列為 SEQ ID:14；
[0074](15)對 M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y (SEQ ID:10)的第24、121、141、145、233、252位進(jìn)行氨基酸殘基替換得到的人源尿酸氧化酶，表示為E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-Α252Ε，其序 列為 SEQ ID:15 ；
[0075](16)對 E24A-M1121-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y (SEQ ID:14)的第115、214位進(jìn)行氨基酸殘基替換得到的人源尿酸氧化酶，表示為 E24A-M1121-1115H-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-1214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，其序列為 SEQ ID:16。
[0076]上述(8)至(16)的各替換位點(diǎn)采用三聯(lián)體表示方式:字母-數(shù)字-字母，數(shù)字表示替換氨基酸殘基的具體位點(diǎn)，數(shù)字前字母表示替換前的氨基酸殘基，數(shù)字后字母表示替換后氨基酸殘基。其中，E代表谷氨酸，S代表絲氨酸，M代表甲硫氨酸，V代表纈氨酸，H代表組氨酸，R代表精氨酸，G代表甘氨酸，Q代表谷氨酰胺，P代表脯氨酸，K代表賴氨酸，D代表天冬氨酸，L代表亮氨酸，F(xiàn)代表苯丙氨酸，T代表蘇氨酸，C代表半胱氨酸，Y代表酪氨酸，A代表丙氨酸，I代表異亮氨酸，N代表天冬酰胺，W代表色氨酸。
[0077]3.本發(fā)明具體實(shí)施例
[0078]下面參照附圖并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是本發(fā)明不限于所給出的例子。
[0079]以下各實(shí)施例中所提到的材料:
[0080](I)宿主菌和質(zhì)粒載體[0081]宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工程菌種，基因工程研究相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室一般都有保存。pET-22b ( + )載體為市售品。
[0082](2)酶和試劑
[0083]分子克隆工具酶為Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒為上海生工生物科技有限公司；PCR膠回收試劑盒為上海生工的產(chǎn)品，DAB顯色試劑盒為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
[0084](3)培養(yǎng)基
[0085]LB 培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn) Sambrook J, FristshE F，Maniatis T.MolecularCloningjA Laboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。
[0086]各實(shí)施例中涉及的質(zhì)粒提取、PCR反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，均為基因工程研究領(lǐng)域的常規(guī)操作方法，具體參見SambiOok J，F(xiàn)ristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning ；A Laboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989，pp.16-340。
[0087]實(shí)施例1人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白IV2Pp8DNA的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21中
重組表達(dá)
[0088]獲得含模板的質(zhì)粒:接種分別含有人尿酸氧化酶基因和豬尿酸氧化酶基因大腸桿菌工程菌甘油管，接種量為1%，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。
[0089]分別以上述含有人尿酸氧化酶DNA和豬尿酸氧化酶DNA序列的重組pET_22b(+ ) -HU、pET-22b ( + ) -13U為模板獲得民_2、P3_8片段，再使用重疊延伸PCR的方法獲得H 卜 2P3_8DNA。
[0090]獲得Hh2Pp8DNA:第一階段PCR:模板序列為含有人尿酸氧化酶基因的上述質(zhì)粒，引物為引物I和引物6，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 35s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物氏_2片段；第二階段PCR:模板序列為含有豬尿酸氧化酶基因的上述質(zhì)粒，引物為引物5和引物4，PCR條件為:95°C 30s,55°C 30s, 72°C lmin40s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物P3_8片段；第三階段PCR:模板為上述兩個(gè)階段獲得的片段的1:1混合液，引物為引物I和引物4，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物氏_#3_8片段。各引物序列見表1。
[0091 ] 將氏_#3_8片段和pET_22b( +)同時(shí)使用Nde I和Hind 111進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段，使用T4DNA連接酶連接兩個(gè)酶切片段，使用《分子克隆》(盧圣棟編)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21。
[0092]在含有AMP抗性的LB平板上，經(jīng)過16h小時(shí)的生長，挑取單克隆轉(zhuǎn)化菌落，在AMP+的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，進(jìn)行菌落PCR初步篩選出陽性克隆，經(jīng)測序確定含有IV2Pp8DNA的陽性重組質(zhì)粒中的尿酸氧化酶序列與理論完全一致。
[0093]將上述經(jīng)過測序正確的BL21表達(dá)重組菌，按照1%的甘油管接種量接入LB培養(yǎng)基裝液量為30ml的250ml的三角瓶中，且培養(yǎng)基中含有100 μ g/ml的AMP。37°C，220rpm搖床中培養(yǎng)至0D_約為1.7時(shí)，加入終濃度為0.2 μ M的IPTG進(jìn)行尿酸氧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)6h后收集菌體，離心得到濕菌體，并以SDS-PAGE監(jiān)測。
[0094]使用PH8.4的硼酸-硼酸鈉緩沖液洗滌收集的濕菌體，洗滌兩次，最終用緩沖液/濕菌體質(zhì)量=10/1 (V/m)重懸洗滌后的菌體。超聲破細(xì)胞，將超聲處理后的菌體懸浮液離心后，上清即為含有人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白iV2P3_8的粗酶液。
[0095]尿酸氧化酶的活性測定:酶活性單位定義:在pH8.4和37 °C時(shí)，每分鐘催化I μ mo I尿酸氧化所需的酶量為一個(gè)酶活單位。尿酸氧化酶催化尿酸降解，尿酸在293nm處具有特征吸收峰，但是尿酸降解后的產(chǎn)物在此波長無吸收峰，因此可以根據(jù)293nm處吸光值的減少量來確定尿酸被尿酸氧化酶降解的量，然后使用尿酸的摩爾消光系數(shù)算出尿酸濃度，根據(jù)尿酸濃度的變化可以計(jì)算出尿酸氧化酶的活性。[0096]實(shí)施例2人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白Pp2IyV8DNA的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21中重組表達(dá)
[0097]采用與實(shí)施例1相同的方法獲得含有人、豬尿酸氧化酶基因序列模板的質(zhì)粒。
[0098]獲得PUH3UNA:第一階段PCR:模板序列為pET_22b( + )_PU，引物為引物8和引物 3，PCR 條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 35s，共 30 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán) 95°C變性 5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物Pp2片段；第二階段PCR:模板序列為pET_22b( + )-HU，引物為引物7和引物9，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 20s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得H3片段；第三階段PCR:模板序列為pET-22b ( + )_PU，引物為引物10和引物4，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s，72°C IminlOs，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物P4-8片段；第四階段PCR:模板為P"片段、H3片段、P4_8片段1:1:1的混合液，弓丨物為引物3和引物4，PCR條件同實(shí)施例1第三階段PCR條件，最終獲得Pp2H3Pw片段。各引物序列見表1。
[0099]采用與實(shí)施例1相同的方法，將Ph2H3Pf8片段進(jìn)行雙酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)、獲得粗酶液并測定酶活。
[0100]實(shí)施例3人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白PmH4Pp8DNA的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21中重組表達(dá)
[0101]采用與實(shí)施例1相同的方法獲得含有人、豬尿酸氧化酶基因序列模板的質(zhì)粒。
[0102]獲得PhH4Pp8DNA:第一階段PCR:模板序列為pET_22b ( + ) -PU，引物為引物11和引物3，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物Pp3片段；第二階段PCR:模板序列為pET_22b( + )-HU，引物為引物12和引物13，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 15s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得H4片段；第三階段PCR:模板序列為pET-22b( + )-PU，引物為引物14和引物4，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s，72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物P5-8片段；第四階段PCR:模板為Pu片段、H4片段、P5_8片段1:1:1的混合液，引物為引物3和引物4，PCR條件同實(shí)施例1第三階段PCR條件，最終獲得PmH4Pp8片段。各引物序列見表1。
[0103]采用與實(shí)施例1相同的方法，將Ph3H4Pp8片段進(jìn)行雙酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)、獲得粗酶液并測定酶活。
[0104]實(shí)施例4人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白PhH5Pp8DNA的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21中重組表達(dá)
[0105]采用與實(shí)施例1相同的方法獲得含有人、豬尿酸氧化酶基因序列模板的質(zhì)粒。
[0106]獲得PhH5Pp8DNA:第一階段PCR:模板序列為pET_22b ( + ) -PU，引物為引物15和引物3，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 59s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物Ph片段；第二階段PCR:模板序列為pET_22b( + )-HU，引物為引物16和引物17，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 25s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得H5片段；第三階段PCR:模板序列為pET-22b( + )-PU，引物為引物18和引物14，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s,72°C 35s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物P6-8片段；第四階段PCR:模板為Py片段、H5片段、P6_8片段1:1:1的混合液，引物為引物3和引物4，PCR條件同實(shí)施例1第三階段PCR條件，最終獲得PhH5Pp8片段。各引物序列見表1。
[0107]采用與實(shí)施例1相同的方法，將PhH5Pm片段進(jìn)行雙酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)、獲得粗酶液并測定酶活。
[0108]實(shí)施例5人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白Pp6IV8DNA的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21中
重組表達(dá)
[0109]采用與實(shí)施例1相同的方法獲得含有人、豬尿酸氧化酶基因序列模板的質(zhì)粒。
[0110]獲得Pp6Hp8DNA:第一階段PCR:模板序列為pET_22b ( + ) -PU，引物為引物3和引物 19，PCR 條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，共 30 個(gè)循環(huán),第一個(gè)循環(huán) 95°C變性5min,最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物P^6片段；第二階段PCR:模板序列為pET-22b ( + )_HU，引物為引物 20 和引物 2，PCR 條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，共 30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得H7_8片段；第三階段PCR:模板為P1-6片段、H7-8片段1:1的混合液，引物為引物2和引物3，PCR條件同實(shí)施例1第三階段PCR條件，最終獲得Ph6Hp8片段。各引物序列見表1。
[0111]采用與實(shí)施例1相同的方法，將Ph6IV8片段進(jìn)行雙酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)、獲得粗酶液并測定酶活。
[0112]實(shí)施例6人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白HhP^JmHhDNA的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21中重組表達(dá)
[0113]采用與實(shí)施例1相同的方法獲得含有人、豬尿酸氧化酶基因序列的含模板的質(zhì)粒。
[0114]獲得!V2P3H4PmHhDNA:第一階段PCR同實(shí)施例1，最終獲得產(chǎn)物H"片段；第二階段PCR:模板為pET-22b ( + )_PU，引物為引物5和引物11，PCR條件同實(shí)施例2，最終獲得P3片段；第三階段PCR:模板為pET-22b ( + )_HU，引物為引物12和引物13，PCR條件同實(shí)施例3，最終獲得H4片段；第四階段PCR:模板為pET-22b ( + )_PU，引物為引物14和引物19，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得P5_6片段；第五階段PCR:模板為pET_22b ( + )_HU，引物為引物19和引物20，PCR條件同實(shí)施例5，最終獲得H7_8片段；第六階段PCR:模板序列為H"、P3、H4、P5_6、H7_8按照1:1:1:1:1的混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1，最終獲得片段。各引物序列見表1。
[0115]采用與實(shí)施例1相同的方法，將氏_#3!^5_6!17_8片段進(jìn)行雙酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)、獲得粗酶液并測定酶活。
[0116]實(shí)施例7人-豬尿酸氧化酶嵌合體蛋白H1P2IH4PmHp8DNA的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21中重組表達(dá)
[0117]采用與實(shí)施例1相同的方法獲得含有人、豬尿酸氧化酶基因序列模板的質(zhì)粒。
[0118]獲得H1P2^HH8DNA:第一階段PCR:模板為pET_22b ( + ) -PU,引物為引物49和引物50，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得H1P2片段；第二階段PCR:模板為pET_22b( + Η^Ρ^ΡηΗη 引物為引物 12 和引物 2，PCR 條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72 °C延伸lOmin，最終獲得P3H4P5_6H7_8片段；第三階段PCR:模板為以上兩個(gè)階段獲得的片段1:1的混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1，最終獲得H1Pp3HH8片段。各引物序列見表1。
[0119]采用與實(shí)施例1相同的方法，將H1PhH4Pp6Hh片段進(jìn)行雙酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)、獲得粗酶液并測定酶活。
[0120]實(shí)施例8人尿酸氧化酶HU突變體DNA的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21中重組表達(dá)
[0121]人尿酸氧化酶HU突變體DNA是在HU (即SEQ ID NO: 17的原始編碼基因序列)基礎(chǔ)上做的一系列點(diǎn)突變獲得的，包括:
[0122]N0.1:HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
[0123]N0.2:HU-M1121-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
[0124]N0.3:HU-Ml12V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
[0125]N0.4:HU-Ml121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
[0126]N0.5:HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E
[0127]N0.6:HU-E24A-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
[0128]N0.7 :HU-E24A-M1121-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
[0129]N0.8:HU-E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E
[0130]N0.9:HU-E24A-M1121-1115H-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-1214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y。
[0131]本實(shí)施例將逐一陳述這些突變體DNA分子的獲得及其在大腸桿菌BL21中重組表達(dá)。
[0132]采用與實(shí)施例1相同的方法獲得含有人、豬尿酸氧化酶基因序列模板的質(zhì)粒。[0133]獲得N0.1:HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA:第一階段PCR:模板序列為pET-22b(+)-HU，引物為引物I和引物21，PCR條件:95°C 30s,55 °C 30s, 72 °C lmin20s,共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72 °C延伸lOmin，最終獲得HU-M219L-S222F的上半段片段；第二階段PCR:模板序列為pET-22b(+)-HU，引物為引物2和引物22，PCR條件:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin,最終獲得HU-M219L-S222F的下半段片段；第三階段PCR:模板序列為以上兩個(gè)階段獲得的兩個(gè)片段的1:1混合液，引物為引物2和引物1，PCR條件:95°C 30s, 50 °C 30s, 72 °C 2min，共10個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，以上PCR結(jié)束以后在體系中加入引物32，PCR 條件為:95°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin30s，共 20 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán) 95°C變性 5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin,最終獲得含有HU-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段；第四階段PCR:引物添加之前步驟同本實(shí)施例第三階段，添加引物31，PCR條件:95°C 30s, 50°C 30s, 72°C 25s，共20個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin,最終獲得含有HU-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y下半段片段；第五階段PCR:模板序列為第三和第四階段PCR最終獲得的片段的1:1溶液，PCR體系及循環(huán)條件設(shè)置同第三階段前10個(gè)循環(huán)，以上PCR結(jié)束以后在體系中加入引物25，PCR條件為:950C 30s, 500C 30s, 72°C 45s，共20個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸 IOmin,最終獲得 HU-M112V-H119R-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的上半段片段；第六階段PCR:引物添加之前步驟同本實(shí)施例第三階段，添加引物26，PCR條件:95°C 30s,50°C 30s, 72°C IminlOs，共20個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin,最終獲得 HU-M112V-H119R-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 點(diǎn)突變的下半段片段；第七階段PCR:模板序列為第五和第六階段PCR最終獲得的片段的1:1溶液，PCR體系及循環(huán)條件設(shè)置同第三階段前10個(gè)循環(huán)，以上PCR結(jié)束以后在體系中加入引物27，PCR條件為:95°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin30s，共 20 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán) 95°C變性 5min，最后一個(gè)循環(huán) 72°C延伸 IOmin,最終獲 HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段；第八階段PCR:引物添加之前步驟同本實(shí)施例第三階段引物添加之前步驟，添加引物28，PCR條件:95°C 30s, 50°C 30s, 72°C 40s，共20個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán) 72°C延伸 IOmin,最終獲得 HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段；將第七、第八階段PCR得到的片段按照實(shí)施例1的第三階段PCR 設(shè)置，最終獲得含有設(shè)計(jì)點(diǎn)突變的 N0.1:HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA。
[0134]獲得N0.2:HU-M1121-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA:第一階段 PCR:模板序列為 pET-22b (+) -HU-Ml 12V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA，引物為引物 I 和引物 29，PCR 條件:95°C 30s，55°C 30s，72°C lmin20s，共 30 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得HU-M112V-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段；第二階段PCR:模板同第一階段PCR，引物為引物2和引物30，PCR條件:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得HU-M112V-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段；第三階段PCR:模板為第一第二階段最終獲得的兩個(gè)片段1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR反應(yīng)條件同實(shí)施例1的第三階段PCR條件，最終獲得 HU-Ml 12V-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA ;第四階段PCR:模板為第三階段獲得的片段，引物為引物I和引物34，PCR條件為:95°C30s，55°C30s，72°C 40s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得 HU-Ml 121-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的上半段片段；第五階段PCR:模板為第三階段獲得的片段，引物為引物I和引物33，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s,72°C lmin20s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得 HU-Ml 121-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的下半段片段；第六階段PCR:模板為第四第五階段PCR獲得的片段，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1最后一階段PCR，最終獲得N0.2:HU-M1121-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240YDNA。[0135]獲得N0.3:HU-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240YDNA:第一階段 PCR:模板序列為 pET-22b ( + ) -HU-Ml 12V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，平行的設(shè)置兩個(gè)相同的體系，命名為體系I和體系2，體系I的引物為引物I和引物36，體系2的引物為引物2和引物35，兩個(gè)PCR條件相同:95°C 30s, 55°C 30s，72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終，體系 I 和體系 2 分別獲得獲得 HU-Ml 12V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的上半段片段和 HU-Ml 12V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段；第二階段PCR:模板為第一階段獲得的兩個(gè)片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1最后一階段PCR條件，最終獲得N0.3:HU-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA。
[0136]獲得N0.4:HU-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240YDNA:第一階段 PCR:模板序列為 pET-22b ( + ) -HU-Ml 121-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，平行的設(shè)置兩個(gè)相同的體系，命名為體系I和體系2，體系I的引物為引物I和引物38，體系2的引物為引物2和引物37，兩個(gè)PCR條件相同:95°C 30s, 55°C 30s，72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終，體系 I 和體系 2 分別獲得獲得 HU-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的上半段片段和 HU-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段；第二階段PCR:模板為第一階段獲得的兩個(gè)片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1中的最后一階段PCR條件，最終獲得N0.4:HU-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA。
[0137]獲得N0.5:HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E DNA:第一階段 PCR:模板為 pET_22b ( + )-HU-M112V-H119R-Q151P_K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，引物為引物 I 和引物 40，PCR 條件為:95°C 30s,55 °C 30s, 72 °C 15s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin0 最終獲得 HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y上半段片段；第二階段PCR:模板同第一階段PCR，引物為引物2和引物39，PCR條件為:950C 30s, 550C 30s, 72°C lmin40s，共30個(gè)循環(huán),第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72 0C 延伸 lOmin，最終獲得 HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y下半段片段；第三階段PCR:模板為以上兩個(gè)階段獲得片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1中的第三階段PCR條件，最終獲得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y ;第四階段PCR:模板為第三階段PCR獲得的片段，引物為引物I和引物48，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin35s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E 上半段片段；第五階段 PCR:模板為第三階段PCR獲得的片段，引物為引物2和引物47，PCR條件為:95 °C 30s，55 °C 30s，72°C 25s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得 HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E 下半段片段；第六階段PCR:模板為第四第五階段獲得片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1中的第三階段PCR條件，最終獲得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E ;第七階段PCR:模板為第六階段PCR獲得的片段，引物為引物I和引物45，PCR條件為:95°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin，共30個(gè)循環(huán)，第個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得HU-E24D-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E 上半段片段；第八階段 PCR:模板為第六階段PCR獲得的片段，引物為引物I和引物46，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s,72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin。最終獲得 HU-E24D-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E下半段片段；第九階段PCR:模板為第七第八階段獲得片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1中的第三階段PCR條件，最終獲得HU-E24D-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E ;第十階段 PCR:模板為第九階段PCR獲得的片段，引物為引物I和引物52，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 35s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E 上半段片段；第十一階段PCR:模板為第九階段PCR獲得的片段，引物為引物I和引物51，PCR條件為:950C 30s, 550C 30s, 72°C lmin30s，共30個(gè)循環(huán),第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72 O 延伸 lOmin，最終獲得 HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E下半段片段；第十二階段PCR:模板為第十、第十一階段獲得片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1中的第三階段PCR條件，最終獲得 N0.5:HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E DNA。
[0138]獲得 N0.6:HU-E24A-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA:第一階段 PCR:模板為 pET-22b( + )-HU-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，引物為引物 I 和引物 42，PCR 條件同 HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y 獲得的第一階段 PCR，最終獲得 HU-E24A-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 上半段片段；第二階段 PCR:模板同第一階段 PCR，引物為引物 2 和引物 41，PCR 條件同 HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y 獲得的第二階段 PCR，最終獲得 HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y下半段片段；第三階段PCR:模板為以上兩個(gè)階段獲得片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1中的第三階段PCR條件，最終獲得 N0.6:HU-E24A-M1121-H119R-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240YDNA。
[0139]獲得N0.7:HU-E24A-M1121-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232
S-T233A-C240Y DNA:第一階段 PCR:模板為 pET-22b( + )-HU-E24A-M1121-H119R-Q151I_K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，PCR條件為:平行的設(shè)置兩個(gè)相同的體系，命名為體系I和體系2，體系I的引物為引物I和引物44，體系2的引物為引物2和引物43，兩個(gè)PCR條件相同:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終，體系I和體系2分別獲得獲得HU-E24A-M1121-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的上半段片段和 HU-E24A-M1121-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的下半段片段；第二階段PCR:模板為第一階段獲得的兩個(gè)片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1中的最后一階段PCR條件，最終獲得N0.7:HU-E24A-M1121-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240YDNA。
[0140]獲得N0.8:HU-E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E DNA:第一階段 PCR:模板為 pET-22b( + )-HU-M112V_H119R-Ql51P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，PCR條件為:平行的設(shè)置兩個(gè)相同的體系，命名為體系I和體系2，體系I的引物為引物I和引物44，體系2的引物為引物2和引物43，兩個(gè)PCR條件相同:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終，體系I和體系2分別獲得獲得HU-Ml 12V-H119R-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的上半段片段和 HU-M112V-H119R-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的下半段片段；第二階段PCR:模板為第一階段PCR獲得的兩個(gè)片段1:1混合液，引物為引物I和引物2，平行設(shè)置兩個(gè)體系命名為體系I和體系2，兩個(gè)體系PCR條件相同，為:95°C 30s，55°C 30s，72°C 2min,共10個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，循環(huán)結(jié)束以后分別在體系I和體系2中添加引物引物45、引物46，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s，72°C IminlOs，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終體系I和體系 2 分別獲得 HU-Ml 12V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的上 半段片段和 HU-Ml 12V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段；第三階段PCR:模板為第二階段PCR獲得的兩個(gè)片段1:1混合液，平行設(shè)置兩個(gè)體系，命名為體系3和體系4，引物為引物I和引物2，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，共10個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72 C延伸IOmin，10個(gè)循環(huán)結(jié)束以后分別在體系3和體系4添加引物48和47，體系3的PCR 條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，共 30 個(gè)循環(huán),第一個(gè)循環(huán) 95°C變性 5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，體系4的PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 20s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min,最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin,最終體系3和體系4分別獲得 HU-Ml 12V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E 的上半段片段和 HU-Ml 12V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E的下半段片段；第四階段PCR:模板為第三階段PCR獲得的兩個(gè)片段1:1混合液，平行設(shè)置兩個(gè)體系，命名為體系5和體系6，引物為引物I和引物2，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，共10個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，10個(gè)循環(huán)結(jié)束以后分別在體系5和體系6添加引物23和24，體系5的 PCR 條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，共 30 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán) 95°C變性 5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，體系6的PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min,最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin,最終體系5和體系6分別獲得 HU-Ml 12V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E 的上半段片段和 HU-Ml 12V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E的下半段片段；第五階段PCR:模板為第四階段PCR獲得的兩個(gè)片段1:1混合液，平行設(shè)置兩個(gè)體系，命名為體系7和體系8，引物為引物I和引物2，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，共10個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，10個(gè)循環(huán)結(jié)束以后分別在體系7和體系8添加引物40和39，體系7的PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 15s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán) 72°C延伸 lOmin，體系 8 的 PCR 條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin45s，共 30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min,最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin,最終體系7和體系8分別獲得 HU-E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E 的上半段片段和 HU-E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E的下半段片段；第六階段PCR:模板為第五階段獲得的兩個(gè)片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1的最后一階段PCR 條件，最終獲得 N0.8:HU-E24A-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E DNA。
[0141]獲得 N0.9:HU-E24A-M1121-1115H-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-1214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA:第一階段 PCR:模板為:pET-22b( + )-HU-E24A-M112I_Hl19R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y，平行設(shè)置兩個(gè)體系，命名為體系I和體系2,體系I引物為引物I和引物54,體系2引物為引物2和引物53 ；體系I的PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán) 72°C延伸 IOmin ;體系 2 的 PCR 條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin25s，共 30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min,最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin ;最終體系I和體系2分別獲得 HU-E24A-M1121-1115H-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 上半段片段和 HU-E24A-M1121-1115H-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y下半段片段；第二階段PCR:模板為第一階段PCR獲得的兩個(gè)片段1:1混合液，平行設(shè)置兩個(gè)體系，命名為體系3和體系4，引物為引物I和引物2，PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，共10個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin ;10個(gè)循環(huán)結(jié)束以后分別在體系3和體系4添加引物56和55，體系3的PCR 條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin20s，共 30 個(gè)循環(huán),第一個(gè)循環(huán) 95°C變性 5min，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin ;體系4的PCR條件為:95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°C變性5min,最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸IOmin ;最終體系3和體系4分別獲得 E24A-M1121-1115H-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-1214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y 的上半段片段和 E24A-M1121-1115H-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-1214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段；第三階段PCR:模板為第五階段獲得的兩 個(gè)片段的1:1混合液，引物為引物I和引物2，PCR條件同實(shí)施例1的最后一階段PCR條件， 最終獲得 N0.9:HU-E24A-M1121-1115H-H119R-C141V-Q145V-Q1511-K208D-1214A-M219L-S2 22F-L232S-T233A-C240Y DNA。
[0142]各引物序列見表1。
[0143]釆用與實(shí)施例1相同的方法，將以上9個(gè)人尿酸氧化酶HU突變體DNA分別進(jìn)行雙酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)、獲得粗酶液并測定酶活。
[0144]以上各實(shí)施例所得粗酶液的酶活數(shù)據(jù)如表2所示。
[0145]表1各實(shí)施例所用引物序列
[0146]
【權(quán)利要求】
1.一種具有催化活性的人源尿酸氧化酶，其特征是，具有將SEQ ID NO: 17所示序列進(jìn)行若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換所得的重組氨基酸殘基序列；所述若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換至少包括8個(gè)主要位點(diǎn)替換； 所述主要位點(diǎn)替換選自--第112位甲硫氨酸替換為纈氨酸或異亮氨酸；第119位組氨酸替換為精氨酸?’第208位賴氨酸替換為谷氨酸或天冬氨酸；第219位甲硫氨酸替換為亮氨酸；第222位絲氨酸替換為苯丙氨酸；第232位賴氨酸替換為絲氨酸；第233位蘇氨酸替換為丙氨酸；第240位半胱氨酸替換為酪氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有催化活性的人源尿酸氧化酶，其特征是，所述若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換由8個(gè)主要位點(diǎn)替換、0-1個(gè)二級(jí)位點(diǎn)替換、0-1個(gè)三級(jí)位點(diǎn)替換、0-4個(gè)四級(jí)位點(diǎn)替換、0-3個(gè)五級(jí)位點(diǎn)替換組成； 所述二級(jí)位點(diǎn)替換選自:第151位谷氨酰胺替換為脯氨酸或者異亮氨酸； 所述三級(jí)位點(diǎn)替換選自:第24位谷氨酸替換為天冬氨酸或者丙氨酸； 所述四級(jí)位點(diǎn)替換選自--第115位異亮氨酸替換為組氨酸；第141位半胱氨酸替換為纈氨酸；第145位谷氨酰胺替換為纈氨酸；第214位異亮氨酸替換為丙氨酸； 所述五級(jí)位點(diǎn)替換選自--第83位谷氨酸替換為甘氨酸;第121位甘氨酸替換為谷氨酸；第252位丙氨酸替換為谷氨酸； 當(dāng)所述二級(jí)位點(diǎn)替換數(shù)量為O時(shí),所述三級(jí)、四級(jí)、五級(jí)位點(diǎn)替換數(shù)量均為O ;當(dāng)所述三級(jí)位點(diǎn)替換數(shù)量為O時(shí),所述四級(jí)、五級(jí)位點(diǎn)替換數(shù)量均為O。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述具有催化活性的人源尿酸氧化酶，其特征是，所述重組氨基酸殘基序列為SEQ ID NO:8至SEQ ID NO: 16之一。
4.一種具有催化活性的人源尿酸氧化酶，其特征是，具有將SEQ ID NO: 17所示序列進(jìn)行若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換所得的重組氨基酸殘基序列；所述若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換由I個(gè)主外顯子位點(diǎn)替換、2至7個(gè)次外顯子位點(diǎn)替換組成； 所述主外顯子位點(diǎn)替換選自:第212至252位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第212至252位氨基酸殘基序列； 所述次外顯子位點(diǎn)替換選自:第I至10位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第I至10位氨基酸殘基序列；第11至83位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第11至83位氨基酸殘基序列；第84至122位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第84至122位氨基酸殘基序列；第123至148位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第123至148位氨基酸殘基序列；第149至211位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第149至211位氨基酸殘基序列；第253至280位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第253至280位氨基酸殘基序列；第281至305位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID NO: 18的第281至305位氨基酸殘基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述具有催化活性的人源尿酸氧化酶，其特征是，所述重組氨基酸殘基序列為SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 7之一。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述人源尿酸氧化酶用于制備降尿酸藥物的用途。
7.含有權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述人源尿酸氧化酶的藥物組合物。
8.編碼權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述人源尿酸氧化酶的基因序列。
9.含有權(quán)利要求8所述基因序列的表達(dá)載體。
10.含有權(quán)利要求9所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N9/06GK103834623SQ201410048071
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】陳建華, 謝光蓉, 趙百學(xué) 申請人:中國藥科大學(xué)