來自半片藻屬的脂肪酸脫飽和酶的利用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與脫飽和酶有關(guān)的方法和組合物，所述脫飽和酶調(diào)節(jié)長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)中雙鍵的數(shù)量和位置。特別地，本發(fā)明涉及利用外源的脫飽和酶和編碼這樣的酶的核酸，來改善植物產(chǎn)品和部分中ω-3脂肪酸分布的方法和組合物。在特定的實(shí)施方式中，利用的外源脫飽和酶是半片藻屬物種Δ5脫飽和酶。還提供的是改善的大豆油組合物，其具有衍生自帶有感興趣基因的植物的EPA。
【專利說明】來自半片藻屬的脂肪酸脫飽和酶的利用
[0001] 本申請是申請日為2009年10月14日和發(fā)明名稱為“來自半片藻屬的脂肪酸脫飽和酶的利用”的200980140691.2號發(fā)明專利申請的分案申請。
_2] 對相關(guān)申請的引用
[0003]本申請要求2008年10月14日提交的美國臨時申請N0.61 / 105，316的優(yōu)先權(quán)，通過引用將其完全合并在本文中。
[0004]序列表的引入
[0005]作為當(dāng)前的公開的一部分的序列表包括標(biāo)題為“M0NS219W0_ST25.txt”的36KB計(jì)算機(jī)可讀文件，其包含通過EFS-Web提交的本發(fā)明的核苷酸和/或氨基酸序列。序列表的內(nèi)容通過完全引用合并在本文中。
[0006]發(fā)明背景
[0007]1.發(fā)明領(lǐng)域
[0008]本發(fā)明一般地涉及脫飽和酶，其調(diào)節(jié)長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)中雙鍵的數(shù)量和位置。特別地， 本發(fā)明涉及利用△ 5脫飽和酶和編碼這樣的脫飽和酶的核酸來改變脂肪酸分布。
[0009]2.相關(guān)技術(shù)的說明
[0010]在大多數(shù)生物體中脂肪酸生物合成的主要產(chǎn)物是16-碳和18-碳化合物。這些脂肪酸的鏈長度與不飽和度的相對比例在物種之中廣泛地變化。例如,哺乳動物主要產(chǎn)生飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，而大多數(shù)高等植物生產(chǎn)具有一個、兩個或三個雙鍵的脂肪酸，后兩者包括多不飽和脂肪酸(PUFA)。
[0011]兩種主要的PUFA家族是ω-3脂肪酸(也稱為“n-3”脂肪酸)，例子是二十碳五烯酸(EPA，20: 5，n-3)，以及ω-6脂肪酸(也稱為“n-6”脂肪酸)，例子是花生四烯酸(ARA，20: 4，n-6)。PUFA是細(xì)胞的質(zhì)膜和脂肪組織的主要成分，在其中它們可以分別以磷脂和甘油三酯的形式存在。PUFA是哺乳動物中適當(dāng)?shù)陌l(fā)育所必需的，特別是在嬰兒腦部的發(fā)育中，以及對于組織形成和修復(fù)是必需的?；ㄉ南┧崾穷惢ㄉ犷愇镔|(zhì)的合成的主要前體，類花生酸類物質(zhì)包括白細(xì)胞三烯、前列腺素和凝血噁烷，其也在炎癥過程中起到重要作用。
[0012]幾種失調(diào)響應(yīng)于脂肪酸的治療。補(bǔ)充PUFA已經(jīng)顯示了降低血管成形術(shù)后再狹窄的幾率。證據(jù)表明，PUFA可能涉及鈣代謝，表明PUFA可能在骨質(zhì)疏松癥的治療或預(yù)防以及腎臟或泌尿道結(jié)石的治療或預(yù)防中是有用的。健康效益的大部分證據(jù)適用于長鏈ω-3脂肪、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸(DHA，22: 6，n-3)，它們在魚類和魚油中存在。
[0013]PUFA，例如，亞油酸(LA，18: 2，Λ 9，12)和 α -亞麻酸(ALA，18: 3, Δ9,12,15)被認(rèn)為是膳食中的必需脂肪酸，因?yàn)椴溉閯游锶狈铣蛇@些酸的能力。LA通過Λ12-脫飽和酶從油酸(0Α，18: 1，Λ 9)產(chǎn)生，而ALA通過Λ 15-脫飽和酶從LA產(chǎn)生。然而，當(dāng)攝食時，哺乳動物具有代謝LA和ALA以形成長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的η_6和η_3家族的能力。在哺乳動物中，LC-PUFA的形成由Λ 6脫飽和的步驟限速，這個步驟將LA轉(zhuǎn)化成GLA,將ALA轉(zhuǎn)化成SDA。許多生理學(xué)和病理學(xué)的狀況已經(jīng)顯示了甚至進(jìn)一步地降低這種代謝步驟，因而，降低LC-PUFA的產(chǎn)生。為了克服限速步驟和提高EPA的組織水平，人們可以消費(fèi)大量的ALA。作為選擇，通過飲食補(bǔ)充EPA或DHA來繞過Λ 6-脫飽和可以有效地減輕許多與低水平的PUFA相關(guān)的病理性疾病。然而，如以下更詳細(xì)地闡述的，PUFA的當(dāng)前可用的來源不是理想的。
[0014]主要的重要長鏈PUFA包括DHA和ΕΡΑ，其主要在不同類型的魚油中存在，以及ARA，其在絲狀真菌例如被孢霉屬(Mortierella)中發(fā)現(xiàn)。對于DHA，存在著商業(yè)生產(chǎn)的許多來源，包括多種海洋生物、從冷水海洋魚類獲得的油、以及蛋黃級分。然而，從天然來源商業(yè)生產(chǎn)PUFA存在幾個缺點(diǎn)。PUFA的天然來源傾向于具有高度異質(zhì)的油組成。因而從這些來源獲得的油可能需要大量的純化來分離出一種或多種期望的PUFA，或來產(chǎn)生富集了一種或多種PUFA的油。
[0015]其他天然的限制也希望獲得生產(chǎn)PUFA的新方法。天氣和疾病可以導(dǎo)致來自魚類和其他海洋來源的產(chǎn)量的變動。生物體例如被孢霉屬的大規(guī)模的發(fā)酵是昂貴的。天然的動物組織含有很低數(shù)量的ARA，并且難以被加工。
[0016]發(fā)明概沭
[0017]本發(fā)明的一個方面提供了編碼多肽的分離的核酸，所述多肽能夠在碳5使脂肪酸分子脫飽和。這些核酸可以用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞或修飾植物的脂肪酸組成或植物產(chǎn)生的油。本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了分離自具有獨(dú)特的脫飽和酶活性的半片藻屬物種(Hemiselmisspp.)的分離的多核苷酸序列。在本發(fā)明的某些進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述多核苷酸編碼與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列具有至少75%的序列同一性、包括與這些序列具有至少約80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、98%和99%同一性的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，由于這些序列是相關(guān)的，給定的序列可能同時與這些多肽序列的超過一種享有75%或更高的序列同一性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的半片藻屬物種的脫飽和酶進(jìn)一步被限定為ω-3 Λ 5脫飽和酶(即，具有ω-3底物偏愛的脫飽和酶)。
[0018]在另一個方面，本發(fā)明提供了編`碼多肽的分離的多核苷酸，所述多肽具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性，`所述多核苷酸包含選自以下的序列:(a)編碼SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列的多核苷酸；(c)在5XSSC、50%甲酰胺和42°C的條件下與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或其互補(bǔ)物雜交的多核苷酸；(d)編碼與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列具有至少75%、85%、95%、98%或99%的序列同一性的多肽的多核苷酸；和e)編碼具有至少一種以下氨基酸基序的多肽的多核苷酸:
【權(quán)利要求】
1.一種用多核苷酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分的細(xì)胞，所述多核苷酸分子包含選自以下的核酸序列: a)編碼SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列的核酸序列； b)SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列；和 c)編碼與SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列具有至少95%的序列同一性、具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性的多肽的核酸序列， 其中所述多核苷酸分子與異源啟動子可操作地連接。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分的細(xì)胞，所述植物選自芥花、菜苔、含油種子油菜、油菜籽、大豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕、亞麻、葵花、玉米、水稻、大麥、粟、黑麥、小麥、燕麥、苜蓿和高粱。
3.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分的細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼脂肪酸脫飽和酶或延伸酶的至少一種另外的多核苷酸。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分的細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼Λ6脫飽和酶、Λ 6延伸酶、Λ 18延伸酶、Λ 15脫飽和酶、Δ 9延伸酶、Λ 8脫飽和酶、Δ 17脫飽和酶、Λ 4脫飽和酶或C20延伸酶的多核苷酸。
5.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物的子代植物的細(xì)胞，其中所述子代植物包含所述多核苷酸分子。
6.從權(quán)利要求1的植物或植物部分獲得的商業(yè)產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品包含所述多核苷酸分子或由所述多核苷酸分子編碼的多肽，其中所述商業(yè)產(chǎn)品是食物或飼料。
7.權(quán)利要求6的商業(yè)產(chǎn)品,其中所述食物或飼料是油、青忙飼料、粗粉、谷粒、淀粉、細(xì)粉或蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求6的商業(yè)產(chǎn)品，其中所述商業(yè)產(chǎn)品包含EPA、ARA和/或DHA。
9.一種生產(chǎn)食物或飼料組合物的方法，包括步驟: (a)獲得根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分；和 (b)生產(chǎn)所述食物或飼料組合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述食物或飼料是油、青貯飼料、粗粉、谷粒、淀粉、細(xì)粉或蛋白質(zhì)。
【文檔編號】C12N5/10GK103756972SQ201410049582
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2009年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2008年10月14日
【發(fā)明者】V·厄辛, B·弗羅曼, S·斯克瑞恩, L·勒曼 申請人:孟山都技術(shù)公司