黃瓜est-ssr分子標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了黃瓜EST-SSR分子標(biāo)記，該方法以15個(gè)黃瓜種或品種的基因組DNA模板為研究對象，根據(jù)公布的黃瓜EST序列，采用Primer3.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)EST-SSR引物。經(jīng)過PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出4個(gè)具有多態(tài)性的EST-SSR分子標(biāo)記SSR003357、SSR005987、SSR003154和SSR9473。本發(fā)明可應(yīng)用于黃瓜的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異水平等的研究。
【專利說明】黃瓜EST-SSR分子標(biāo)記
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種黃瓜EST-SSR分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜sativus L.)是一種在全球范圍內(nèi)均有栽培的葫蘆科蔬菜作物,我國黃瓜的種植面積和生產(chǎn)總量均排名世界第一，其栽培面積已占世界黃瓜總體栽培面積的50%。
[0003]盡管黃瓜地理分布范圍廣，但其遺傳背景卻較為狹窄，同工酶、RFLP、RAPD、AFLP等標(biāo)記技術(shù)難以在黃瓜育種中提供大量有效的遺傳信息，不利于黃瓜有基因的發(fā)掘與利用。
[0004]從表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequence tag, EST)中開發(fā) SSR 標(biāo)記(EST-SSR)是近年來發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記，與基因組SSR相比，其免去了文庫的構(gòu)建和大量的序列測定，節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，具有高效、低花費(fèi)的特點(diǎn)。同時(shí)，EST作為基因轉(zhuǎn)錄本的一部分，更易獲得基因表達(dá)的信息，可為功能基因的直接鑒定提供重要依據(jù)。
[0005]目前，已相繼在葡萄、大豆、甘蔗、水稻、番茄和小麥等物種均已開展了 EST-SSR標(biāo)記的研究。與這些物種相比，黃瓜EST-SSR標(biāo)記開發(fā)滯后，目前僅利用少量黃瓜EST序列開發(fā)了一些SSR引物，標(biāo)記數(shù)量不足，限制了黃瓜的分子遺傳學(xué)研究。因此，迫切需要獲取更多EST-SSR標(biāo)記以進(jìn)行黃瓜遺傳多樣性和系譜認(rèn)證等方面的研究和應(yīng)用。
[0006]為開發(fā)更多的標(biāo)記，本發(fā)明利用GeneBank公布的黃瓜EST序列以及MISA軟件尋找SSR位點(diǎn)，合成了 30 對引物，經(jīng)15個(gè)不同基因型黃瓜篩選，得到4個(gè)具有多態(tài)性的通用型標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于:開發(fā)黃瓜EST-SSR分子標(biāo)記，提供多態(tài)性引物，建立黃瓜EST-SSR標(biāo)記開發(fā)的技術(shù)體系，為黃瓜的遺傳背景分析提供更多新的EST-SSR標(biāo)記，彌補(bǔ)目前黃瓜EST-SSR標(biāo)記較為缺乏的不足。
[0008]本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案:根據(jù)公布的黃瓜EST序列，設(shè)計(jì)EST-SSR引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出4個(gè)具有多態(tài)性的EST-SSR分子標(biāo)記。4個(gè)黃瓜分子標(biāo)記的編號為:SSR003357、SSR005987、SSR003154、SSR9473，其核苷酸序列分別如SEQID N0.1，SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.4 所示。
[0009]4 個(gè) EST-SSR 分子標(biāo)記 SSR003357，SSR005987，SSR003154，SSR9473 的引物序列分別為:
SSR003357-F:CGTTGAAAGATCAAGGGCAT
SSR003357-R:GAATCCGCGATTACAGAAGC
SSR005987-F:GGCAGTGCTTCCTCTACTCC
SSR005987-R:TTCACATGGATCTCAAGGCA
SSR003154-F:ATGTCTGTGAGATGCGATGGSSR003154-R:CTCTTCGTCAAGTTCCTCCG
SSR9473-F: GATATCAAGCCGTCGCAGAT
SSR9473-R: GGAAGGCGTTGGACAATAAA。
[0010]本發(fā)明可應(yīng)用于黃瓜的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異水平等的研究。
[0011]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是EST-SSR標(biāo)記SSR003357變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖2是EST-SSR標(biāo)記SSR005987變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖3是EST-SSR標(biāo)記SSR003154變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖4是EST-SSR標(biāo)記SSR009473變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果。
[0013](1-15分別表不:中農(nóng)9號，中農(nóng)29號，佳園玲瓏春，新津研4號，翠玉黃瓜，唐山秋瓜，白葉三，春秋黃瓜，麻皮老黃瓜， 日本小黃瓜，荷蘭小黃瓜，美國小黃瓜，西雙版納型，華南型栽培種，華北型栽培種)
【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例1:黃瓜EST-SSR標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)
開發(fā)引物所用的黃瓜EST序列來自GenBank (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)。采用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)的總體原則為:SSR序列的開始和結(jié)束位置分別距5’和3’端不少于50bp ;引物長度18~25bp ;Tm值52.0~60.(TC，而且上游和下游引物的Tm值相差不大于5°C ；GC含量40%~60% ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度100~300bp ;盡量避免引物二級結(jié)構(gòu)以及連續(xù)6個(gè)堿基配對的出現(xiàn)。引物設(shè)計(jì)完成以后，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，共合成30對EST-SSR引物，見下表:
【權(quán)利要求】
1.一種黃瓜EST-SSR分子標(biāo)記,其特征在于,所述EST-SSR分子標(biāo)記的標(biāo)號分別為:SSR003357、SSR005987、SSR003154、SSR9473，其核苷酸序列分別為:
SSR003357:
CGTTGAAAGATCAAGGGCATTTATGGAGGTTGAATAATAAGTATGGTGTGAGAGCAATTTCGTCTCATCACAACAAGCTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCGAAGTCTTCAGCTTCTGTAATCGCGGATTCCSSR005987:
GGCAGTGCTTCCTCTACTCCATCTTCACCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTAATTCACCTTATTCTCTTATGGGTTTCATCCTTACGCTGCTACCTTTCTATGCCTTGAGATCCATGTGAASSR003154:
ATGTCTGTGAGATGCGATGGCGATTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCGCGGCTGTGGATTCCAATTTTTGACGCCAAGGTGTTCCGGAGGAACTTGACGAAGAGSSR9473:
GATATCAAGCCGTCGCAGATTCCGTCGTTAATAAATTCAAGAAGGTTATTTCTTTGCTTGACCGCAACAGAACCGGCCATGCTCGTTTCAGAAGGGCTCCGGTTCTTACAACTACTACTACTACTACTACTCCGCCTCCTCCTCCTCCGCCAAAGGTCAAGCCCCAGCATCAAGATCCGAGTTCGTCGTCTCCGATTTCGGTACCTCCGGTTCAAGTAAAGAAACAAGAATCAGTTTCTGCTTTTAAGGTTTATTGTCCAACGCCTTCC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜EST-SSR分子標(biāo)記，其特征在于:所述的SSR003357、SSR005987, SSR003154, SSR9473四個(gè)位點(diǎn)的引物序列為:
SSR003357-F:CGTTGAAAGATCAAGGGCAT
SSR003357-R:GAATCCGCGATTACAGAAGC
SSR005987-F:GGCAGTGCTTCCTCTACTCC
SSR005987-R:TTCACATGGATCTCAAGGCA
SSR003154-F:ATGTCTGTGAGATGCGATGG
SSR003154-R:CTCTTCGTCAAGTTCCTCCG
SSR9473-F:GATATCAAGCCGTCGCAGAT
SSR9473-R:GGAAGG CGTTGGACAATAAA。
【文檔編號】C12N15/11GK103740712SQ201410052097
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】胡麗芳, 段紫英, 劉世強(qiáng), 黃長干, 賀浩華, 劉秋圓, 賀曉鵬 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)