-panx1雙表達(dá)載體、穩(wěn)定系細(xì)胞、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種P2X7-PANX1雙表達(dá)載體、穩(wěn)定系細(xì)胞、制備方法及應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明先構(gòu)建pP2X7-EGFP過表達(dá)載體和pPANX1-RFP過表達(dá)載體，再將兩個(gè)獨(dú)立的基因表達(dá)調(diào)控框整合于一個(gè)表達(dá)載體上，成功構(gòu)建pP2X7-PANX1雙表達(dá)載體，能實(shí)現(xiàn)一次轉(zhuǎn)染攜帶兩個(gè)不同的基因，并且利用各自的熒光篩選標(biāo)記實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定系的篩選。其中，雙轉(zhuǎn)染P2X7和PANX1的HEK細(xì)胞株具有以下特點(diǎn)：雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞上P2X7基因被綠色熒光蛋白基因EGFP標(biāo)記，該融合蛋白可用于對(duì)P2X7的示蹤，通過監(jiān)測(cè)GFP熒光即可實(shí)現(xiàn)對(duì)P2X7表達(dá)的鑒定；（2）雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞上PANX1基因同紅色熒光蛋白基因進(jìn)行融合，該融合蛋白既具有PANX1通道的功能，又具有紅色熒光，通過監(jiān)測(cè)RFP熒光即可實(shí)現(xiàn)對(duì)PANX1定位和表達(dá)的測(cè)定。
【專利說明】-種P2X7-PANX1雙表達(dá)載體、穩(wěn)定系細(xì)胞、制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種P2X7-PANX1雙表達(dá)載體，以及轉(zhuǎn)染P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的 穩(wěn)定系細(xì)胞，同時(shí)還涉及雙表達(dá)載體、穩(wěn)定系細(xì)胞的制備方法及穩(wěn)定系細(xì)胞應(yīng)用，屬于生物

【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 三磷酸腺苷（ATP)是細(xì)胞能量供應(yīng)和利用的物質(zhì)形式，正常情況下胞外ATP (ATPe)含量很低。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ATPe具有遞質(zhì)活性，往往稱為膠質(zhì)遞質(zhì)。與ATPe結(jié) 合的嘌呤能受體分P2Y和P2X兩類，前者屬于G-蛋白偶聯(lián)型受體，后者是離子通道型受體。 P2X嘌呤受體有7個(gè)亞型，其中P2X7受體（P2X7R)最有特點(diǎn)，受體屬陽離子通道，一價(jià)、二價(jià) 的陽離子均可通過。ATP是其天然配體，生理濃度(微摩爾水平）ATPe激活P2X 7R可選擇性 地引起Ca2+、Na+內(nèi)流，細(xì)胞去極化，神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生正常的興奮活動(dòng)。
[0003] 當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受損后，死亡的細(xì)胞大量ATP釋放到胞外，隨后損傷周圍區(qū)的ATPe濃 度和？2\1?表達(dá)上調(diào)，繼而引起神經(jīng)元繼發(fā)性損傷。最新的觀點(diǎn)表明ATP是一種死亡因 子，而P2X 7R是凋亡和壞死的主要介導(dǎo)者。同時(shí)也指出ATPe短暫作用于P2X7R，僅形成允 許陽離子透過的通道；而高濃度ATPe，反復(fù)持久作用于P2X 7R，形成允許各種陽離子和900D 以下的有機(jī)物質(zhì)通過的膜孔，結(jié)果導(dǎo)致大量小于900Da的物質(zhì)透出胞膜，而膜孔的形成基 礎(chǔ)是PANXl耦合在P2X7形成的復(fù)合體上，PANXl被激活后細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡而死亡，因此， PANX1-P2X7膜孔形成和激活是細(xì)胞死亡的最終通路。
[0004] 凡是能影響P2X7受體激活以及PANXl通道膜孔形成的因素均可以有效干預(yù)細(xì)胞 的凋亡和壞死，研究二者關(guān)系及激活模式是未來理論研究和藥物開發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種P2X7-PANX1雙表達(dá)載體。
[0006] 其次，本發(fā)明還提供一種P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的制備方法。
[0007] 同時(shí)，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)染P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞。
[0008] 最后，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)染P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞的應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0010] 一種P2X7-PANX1雙表達(dá)載體，含有如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序 列。
[0011] 具體的，P2X7-PANX1雙表達(dá)載體，含有如SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18所示的核 苷酸序列。
[0012] 一種P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的制備方法，包括以下步驟：
[0013] (1)利用PCR擴(kuò)增P2X7基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pEGFP-Nl載體上，獲得陽性重組 質(zhì)粒pP2X 7-EGFP，擴(kuò)增P2X7基因的引物序列如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示；
[0014] (2)利用PCR擴(kuò)增PANXl基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pDsRed-Nl載體上，獲得陽性重 組質(zhì)粒pPANXl-RFP，擴(kuò)增PANXl基因的引物序列如SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示；
[0015] (3)利用 PCR 擴(kuò)增 pPANXl-RFP 質(zhì)粒上 CMV:PANXl-dsRED-PloyA 完整調(diào)控框架，利 用PCR反向擴(kuò)增pP2X7-EGFP質(zhì)粒骨架，兩種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后直接轉(zhuǎn)化宿主菌，挑取陽性克 隆并提取質(zhì)粒，鑒定即得P2X 7-PANX1雙表達(dá)載體，用于pPANXl-RFP質(zhì)粒的引物序列如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 所示，用于 P2X7-GFP 質(zhì)粒的引物序列如 SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10 所示。
[0016] 一種轉(zhuǎn)染P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞，制備方法包括如下步驟：
[0017] (1)取ρΡ2Χ7-ΡΑΝΧ1雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)備用；
[0018] (2)利用G418誘殺細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆，再擴(kuò)大培養(yǎng)即得。
[0019] 所述步驟（1)中轉(zhuǎn)染的方法為：取ρΡ2Χ7_ΡΑΝΧ1質(zhì)粒DNA，與x-fect polymer及 x-fect緩沖液混合，靜置后再與DMEM培養(yǎng)基混勻；取混合物作為細(xì)胞培養(yǎng)液，于37°C、二氧 化碳?xì)夥罩信囵B(yǎng)細(xì)胞2?3天。
[0020] 所述步驟（2)中G418的濃度為600 μ g/ml細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0021] 一種轉(zhuǎn)染P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞的應(yīng)用，包括穩(wěn)定系細(xì)胞作為嘌呤 能死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究模型或死亡膜孔形成機(jī)制研究模型中的應(yīng)用，以及穩(wěn)定系 細(xì)胞作為抑制嘌呤能死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的藥物篩選中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] 本發(fā)明通過構(gòu)建具有綠色熒光蛋白標(biāo)記的P2X7過表達(dá)載體和具有紅色熒光標(biāo)記 的PANXl過表達(dá)載體，再將兩個(gè)獨(dú)立的基因表達(dá)調(diào)控框整合于一個(gè)表達(dá)載體上，能實(shí)現(xiàn)一 次轉(zhuǎn)染攜帶兩個(gè)不同的基因，并且利用各自的熒光篩選標(biāo)記實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定系的篩選。采用該載 體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定且高表達(dá)融合蛋白的單克隆細(xì)胞株，對(duì)重組蛋白的 高表達(dá)和產(chǎn)業(yè)化具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
[0024] 本發(fā)明中ρΡ2Χ7-ΡΑΝΧ1雙表達(dá)載體的制備方法具有可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
[0025] 本發(fā)明中雙轉(zhuǎn)染？2&和PANXl的HEK細(xì)胞株，具有以下特點(diǎn)：（1)雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞上 P2X7基因被綠色熒光蛋白基因 EGFP標(biāo)記，該融合蛋白可用于對(duì)P2X7的示蹤，通過監(jiān)測(cè)GFP 熒光即可實(shí)現(xiàn)對(duì)P2X7表達(dá)的鑒定；（2)雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞上PANXl基因同紅色熒光蛋白基因進(jìn)行 融合，該融合蛋白既具有PANXl通道的功能，又具有紅色熒光，通過監(jiān)測(cè)RFP熒光即可實(shí)現(xiàn) 對(duì)PANXl定位和表達(dá)的測(cè)定；（3)該雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)兩種融合蛋白，細(xì)胞具有紅色和 綠色兩種標(biāo)記顏色，通過熒光顯微鏡很容易將該細(xì)胞同其他細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。該細(xì)胞可用于 對(duì)PANXl和P2X 7的定位研究和兩者之間是否存在協(xié)同表達(dá)的定位研究，此外，該細(xì)胞模型 使得系統(tǒng)闡述PANX1-P2X7膜孔形成和激活機(jī)制成為可能，為藥物干預(yù)膜孔激活和膜孔形成 奠定應(yīng)用基礎(chǔ)，對(duì)研究細(xì)胞死亡的最后通路和藥物干預(yù)均有重大的研究意義，同時(shí)對(duì)了解 藥物的實(shí)際作用機(jī)理和效果評(píng)估有實(shí)際指導(dǎo)作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中過表達(dá)載體構(gòu)建及PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0027] 圖2為實(shí)施例1中雙表達(dá)載體ρΡ2Χ7-ΡΑΝΧ1構(gòu)建及PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0028] 圖3為實(shí)施例1中質(zhì)粒構(gòu)建模式圖；
[0029] 圖4為實(shí)施例2中熒光顯微鏡觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞圖像；
[0030] 圖5為實(shí)施例2中熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定系細(xì)胞C7、H3雙熒光圖像；
[0031] 圖6為實(shí)施例2中免疫印跡驗(yàn)證穩(wěn)定系細(xì)胞P2X7及PANXl重組蛋白表達(dá)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 本實(shí)施例中ρΡ2Χ7-ΡΑΝΧ1雙表達(dá)載體的構(gòu)建，包括以下步驟：
[0035] 1、構(gòu)建具有綠色熒光蛋白標(biāo)記的P2X7過表達(dá)載體：
[0036] 從人腦組織cDNA文庫中調(diào)取P2X7基因（GENBANK:BC011913. 2)，設(shè)計(jì)含Xhol/Kpnl 的引物，P2X7上下游引物如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示：
[0037] P2X7-P1 :5' -TCCGCTCGAGATGCCGGCCTGCTGCAGCTGCAGTGATG-3'，
[0038] P2X7-P2 :5, -ATGGGGTACCGTGTAAGGACTCTTGAAGCCACTG-3，。
[0039] 利用 PCR 擴(kuò)增 P2X7 基因 ，PCR 反應(yīng)體系如下：DDW31 μ I，5 X HE bufferlO μ 1， dNTP4y 1，Ρ2Χ7-Ρ12μ 1，Ρ2Χ7-Ρ22μ l，cDNAly l，Phusion polymeraseO. 5μ I ;PCR反應(yīng)條件 如下：98°C 30s，（98°C 5s，55°C 20s，72°C lmin) 25 個(gè)循環(huán)，72°C 5min，4°C。人腦組織 cDNA 文庫中P2X7基因 PCR結(jié)果見圖IA (圖IA中I為Marker，2為P2X7基因）。
[0040] 以質(zhì)粒pEGFP-Nl作為表達(dá)載體，用E. coli DH5a進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，天澤基因柱式 DNA提取試劑盒純化質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物和pEGFP-Nl質(zhì)粒經(jīng)XhoI、KpnI消化，雙酶切反應(yīng)體系 如下：DDW36y 1，10Xbuffer5y 1，PCR 產(chǎn)物或質(zhì)粒 5μ 1，XhoI2y 1，ΚρηΙ2μ 1，37°C消化過 夜。消化產(chǎn)物經(jīng)電泳和膠回收后，片段使用T4DNA ligase進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下： DDWll μ 1，10Xbuffer2y 1，T4DNA Iigasel μ 1，PCR 產(chǎn)物 3μ 1，pEGFP-Nl 片段 3μ 1，16? 連接過夜，取連接產(chǎn)物2 μ 1轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于含50 μ g/ml的卡納霉素 抗性板上，克隆經(jīng)菌液PCR進(jìn)行鑒定，引物為Pl和P2,陽性重組質(zhì)粒命名為pP2X7-EGFP， P2X7-EGFP完整開放閱讀框的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其中第1-6位堿基為XhoI 酶切識(shí)別序列，第7-1713位堿基為P2X7基因序列，第1714-1719位堿基為KpnI酶切識(shí)別 序列，第1720-2467位堿基為GFP基因序列。
[0041] 用于陽性菌落鑒定的引物P1、P2如SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示：
[0042] 上游引物 PI : 5 ' -TACATCGGCTCAACCCTCT-3 '，
[0043] 下游引物 P2 :5 ' -CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3 '。
[0044] 載體經(jīng)PCR驗(yàn)證結(jié)果參見圖IC(即P2X7插入pEGFP-Nl質(zhì)粒后的菌液PCR結(jié)果，圖 中1為Marker，2-9為菌液PCR鑒定結(jié)果，有條帶的是陽性克隆)，通過DNA測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)， 在表達(dá)載體中P2X 7無堿基突變。
[0045] 2、構(gòu)建具有紅色熒光標(biāo)記的PANXl過表達(dá)載體
[0046] 從人腦組織cDNA文庫中調(diào)取PANXl基因（GENBANK:NM_015368. 3)，設(shè)計(jì)含XhoI/ KpnI的引物，PANXl上下游引物如SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示：
[0047] PANXI-PI : 5，-TCCGCTCGAGATGGCCATCGCTCACCTGG-3，，
[0048] PANXI-P2 :5 ' -ATGGGGTACCGTGCAAGAAGAATCCAGAAG-3 '。
[0049] 利用 PCR 擴(kuò)增 PANXl 基因 ，PCR 反應(yīng)體系如下：DDW31 μ 1，5XHE bufferlOy 1， dNTP4y 1，ΡΑΝΧ1-Ρ12μ 1，ΡΑΝΧ1-Ρ22μ l，cDNAly l，Phusion polymerase0.5y 1。反應(yīng)條件 如下：98°C 30s，（98°C 5s，55°C 20s，72°C lmin) 25 個(gè)循環(huán)，72°C 5min，4°C。人腦組織 cDNA 文庫中PANXl基因 PCR結(jié)果見圖IB (圖IB中I為PANXl基因，2為Marker)。
[0050] 以質(zhì)粒pDsRed-Nl作為表達(dá)載體，用E. coli DH5a進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，天澤基因柱式 DNA提取試劑盒純化質(zhì)粒PCR。PCR產(chǎn)物和pDsRed-Nl質(zhì)粒經(jīng)XhoI、KpnI消化，雙酶切反應(yīng) 體系如下：DDW36y 1，IOX buffer5y 1，PCR 產(chǎn)物或質(zhì)粒 5μ 1，XhoI2y 1，ΚρηΙ2μ 1，37°C消 化過夜。消化產(chǎn)物經(jīng)電泳和膠回收后，片段使用T4DNA ligase進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)體系如 下：DDWll μ 1，10Xbuffer2y 1，T4DNA Iigasel μ 1，PCR 產(chǎn)物 3μ 1，pDsRed-Nl 片段 3μ 1， 16°C連接過夜，取連接產(chǎn)物2 μ 1轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于含50 μ g/ml的卡那抗 性板上，克隆經(jīng)菌液PCR進(jìn)行鑒定，引物為P3和P4,陽性重組質(zhì)粒命名pPANXl-RFP質(zhì)粒， PANX1-RFP開放閱讀框的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其中第1-6位堿基為XhoI酶切 識(shí)別序列，第7-1206位堿基為PANXl基因序列，第1207-1212位堿基為KpnI酶切識(shí)別序列， 第1213-1918位堿基為RFP基因序列。
[0051] 用于陽性菌落鑒定的引物P3、P4如SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14所示：
[0052] 上游引物 P3 :5 ' -TGTATCTACCTGGGCTATTACTTC-3 '，
[0053] 下游引物 P4 :5 ' -TTGGTCACCTTCAGCTTCAC-3 '。
[0054] 質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證結(jié)果參見圖ID (S卩PANXl插入pDsRED-Nl表達(dá)質(zhì)粒后的菌液PCR 結(jié)果，圖中1為Marker，2-9為菌液PCR鑒定結(jié)果，有條帶的是陽性克隆)，通過DNA測(cè)序比 對(duì)發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)載體中PANXl無堿基突變。
[0055] 3、基于pP2X7_EGFP質(zhì)粒骨架構(gòu)建雙表達(dá)載體
[0056] 利用PCR擴(kuò)增pPANXl-RFP質(zhì)粒上CMV:PANXl-dsRED-PloyA完整調(diào)控框架。用于 擴(kuò)增pPANXl-RFP質(zhì)粒的引物中加入16個(gè)堿基序列（見斜體）用于同源重組，其序列同用于 擴(kuò)增pP2X 7-EGFP骨架的引物是互補(bǔ)序列，引物如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8所示：
[0057] pPANXI-RFP-FWD : 5 ' -TCCTGGCCTTTTGCTGCTGTGGATAACCGTATTACC-3 '，
[0058] pPANXI-RFP-REV : 5 ' -GAAAGAACATGTGAGCCTTAAGATACATTGATGAG-3 '。
[0059] PCR 反應(yīng)條件如下：DDW31 μ 1，5XHE bufferlOy 1，dNTP4y 1，Ρ2Χ7-Ρ12μ 1， Ρ2Χ7-Ρ22 μ I，pPANXl-RFP 質(zhì)粒（50ng) 1 μ I，Phusion polymeraseO. 5 μ 1。PCR 反應(yīng)條件如 下：98°C 30s，（98°C 20s，55°C 20s，72°C 2min) 18 個(gè)循環(huán)，72°C 5min，4°C保存。
[0060] 擴(kuò)增得到的CMV:PANXl-dsRED-PloyA完整調(diào)控框架的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17 所示，其中第1-16位堿基為同源重組序列，第7-638位堿基為CMV基因序列，第639-644 位堿基為XhoI酶切識(shí)別序列，第645-1844位堿基為PANXl基因序列，第1845-1850位堿 基為KpnI酶切識(shí)別序列，第1851-2556位堿基為RFP基因序列，第2557-2800位堿基為 SV40early polyA基因序列，第2801-2816位堿基為同源重組序列。
[0061] 利用PCR設(shè)計(jì)引物反向擴(kuò)增pP2X7-EGFP質(zhì)粒，引物設(shè)計(jì)基于質(zhì)粒上pUC ori和 PCMV之間的間隔。用于擴(kuò)增pP2X7-EGFP質(zhì)粒的引物如SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10所示：
[0062] pP2X7-GFP-FWD-rv : 5，-CAGCAAAAGGCCAGGAACC-3，，
[0063] pP2X7-GFP-REV-fw : 5，-GCTCACATGTTCTTTCCTG-3，。
[0064] PCR 反應(yīng)條件如下：DDW30 μ I，5 X HE buffer 10 μ I，dNTP4 μ I，Primer 12 μ 1， Primer22y 1，pP2X7_EGFP 質(zhì)粒（50ng) 1μ 1，Phusion polymeraseO. 5μ 1。PCR 反應(yīng)條件 如下：98°C 30s，（98°C 15s，55°C 20s，72°C 3min) 18 個(gè)循環(huán)，72°C 5min，4°C保存。
[0065] 擴(kuò)增得到的P2X7-EGFP骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示，其中第1-16位堿 基為同源重組序列，第7-614位堿基為CMV基因序列，第615-620位堿基為XhoI酶切識(shí)別 序列，第621-2327位堿基為P2X 7基因序列，第2328-2333位堿基為KpnI酶切識(shí)別序列，第 2334-3081位堿基為GFP基因序列，第3082-6328位堿基為SV40early polyA基因序列，第 6329-6344位堿基為同源重組序列。
[0066] 上述兩種PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2A (S卩PCR反向擴(kuò)增pP2X7-EGFP骨架 和 CMV:PANXl-dsRED-PloyA 片段電泳圖），可見 7kb 的 pP2X7-EGFP 骨架和 3. 3kb 的 CMV = PANXl-RFP-PloyA片段。圖3為質(zhì)粒ρΡ2Χ7-ΡΑΝΧ1構(gòu)建的模式圖。
[0067] 兩種PCR產(chǎn)物末端有16個(gè)堿基互補(bǔ)用于重組克隆，在兩種PCR產(chǎn)物里各加入 1 μ lDpnl，于37°C消化3h，以消除原有的PCR模板。利用同源重組快速克隆方法進(jìn)行后續(xù) 的亞克隆，該方法不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、不需要膠回收以及連接反應(yīng)，直接各取兩種 經(jīng)過DpnI消化的PCR產(chǎn)物5 μ 1，混合后于室溫放置30min，取2 μ 1混合物轉(zhuǎn)化DH5a感受 態(tài)細(xì)胞，涂布卡納霉素抗性板。次日挑取數(shù)個(gè)克隆，利用引物對(duì)菌液進(jìn)行陽性克隆的鑒定。 引物設(shè)計(jì)：使用PANXl基因 C-末端核苷酸（18個(gè)堿基)為上游引物P5,使用P2X7基因 N-端 核苷酸（18個(gè)堿基)序列作為下游引物P6。只有同時(shí)具有PANXl和P2X7的質(zhì)粒才能擴(kuò)增出 條帶，菌液PCR的電泳結(jié)果見圖2B，圖中1為Marker，2-10為菌液PCR鑒定結(jié)果，結(jié)果顯示 3個(gè)克隆是陽性克隆。提取陽性克隆質(zhì)粒，并且使用菌液PCR引物進(jìn)行DNA的序列測(cè)定，結(jié) 果顯示序列完全正確，獲得重組質(zhì)粒命名為ρΡ2Χ 7-ΡΑΝΧ1。
[0068] 菌液PCR驗(yàn)證所用引物序列P5、P6如SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16所示：
[0069] 上游引物 P5 :5 ' -ACCAGAGCAAAGCAAACG-3 '，
[0070] 下游引物 P6 :5，-CATGTCTGCAGAGATGAG-3，。
[0071] 實(shí)施例2
[0072] 本實(shí)施例中轉(zhuǎn)染ρΡ2Χ7-ΡΑΝΧ1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞的構(gòu)建，包括以下步驟：
[0073] 1、雙轉(zhuǎn)染穩(wěn)定系細(xì)胞的構(gòu)建
[0074] 將HEK293細(xì)胞以5X105/孔接種于3. 5cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24小時(shí)，用x-fect轉(zhuǎn)染 試劑將雙表達(dá)載體ρΡ2Χ7-ΡΑΝΧ1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，步驟如下：取5 μ g質(zhì)粒DNA (8 μ 1)，同 1. 5 μ lx-fect polymer以及90 μ 1的x-fect緩沖液進(jìn)行混合，漩潤混合20s后，放置于室 溫IOmin ;將以上100 μ 1的混合液同Iml DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行混勻，將混合物加至經(jīng)過PBS洗 滌的3. 5cm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37°C培養(yǎng)4小時(shí)，隨后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正常 換液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
[0075] 2、雙轉(zhuǎn)染穩(wěn)定系細(xì)胞的篩選和擴(kuò)大培養(yǎng)
[0076] 使用熒光顯微鏡觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效果，鏡下可觀察到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后部分細(xì)胞同時(shí)具 有紅色熒光和綠色熒光，仍然有部分細(xì)胞無熒光。對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基換液，使用600ug/ ml的G418進(jìn)行誘殺，每48小時(shí)換培養(yǎng)基(含G418)，培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)處理14天。使用熒光顯 微鏡觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效果，圖4為熒光顯微鏡觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)的HEK細(xì)胞圖像，其中 a為明視野的未轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞；b為未轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞在488nm激發(fā)時(shí)的影像，無任何綠色呈 現(xiàn)；c為未轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞在543nm激發(fā)時(shí)的影像，無紅色呈現(xiàn)；d為轉(zhuǎn)染細(xì)胞的明視野成像； e為轉(zhuǎn)染細(xì)胞在488nm激發(fā)后的圖像，有綠色熒光呈現(xiàn)出來；f為轉(zhuǎn)染細(xì)胞在543nm激發(fā)后 的影像，有紅色熒光發(fā)射。
[0077] 對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基換液，使用600ug/ml的G418進(jìn)行誘殺，每48小時(shí)換培養(yǎng) 基(含G418)，培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)處理14天。對(duì)存活細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡觀察后，采用有效稀釋 法，步驟如下：梯度稀釋細(xì)胞至終濃度為100個(gè)細(xì)胞于IOml培養(yǎng)基(含600ug/mL G418,進(jìn) 行抗性維持)。IOOul接種培養(yǎng)基至96孔板內(nèi)，確保96孔板每孔等于或少于1個(gè)細(xì)胞。同 時(shí)做3個(gè)96孔板的平行接種。DMEM培養(yǎng)基(含600ug/mL G418)培養(yǎng)細(xì)胞2周，期間每48h 換培養(yǎng)基一次。
[0078] 待細(xì)胞繁殖成簇后，觀察細(xì)胞熒光，經(jīng)488nm激發(fā)后于512nm檢測(cè)GFP熒光，記錄 到2株最亮的單簇細(xì)胞同時(shí)具備強(qiáng)的綠色和紅色熒光，結(jié)果見圖5(即熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定 系細(xì)胞C7、H3雙熒光圖像)，a為編號(hào)為C7的單克隆細(xì)胞分裂出來的細(xì)胞簇的明視野成像； b為C7細(xì)胞于488nm激發(fā)后的成像；c為C7細(xì)胞于543nm激發(fā)后的成像；d為編號(hào)為H3的 單克隆細(xì)胞分裂出的細(xì)胞簇的明視野成像；e為H3細(xì)胞于488nm激發(fā)后的成像；f為H3細(xì) 胞于543nm激發(fā)后的成像。結(jié)果顯示穩(wěn)定系細(xì)胞均有雙熒光的表達(dá)。這兩族細(xì)胞隨后進(jìn)行 逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得具有抗性且可以穩(wěn)定共表達(dá)P2X 7-eGFP和PANX1-RFP的HEK293穩(wěn) 定系。
[0079] 3、Western blot 檢測(cè) P2X7 和 PANXl 的表達(dá)
[0080] 利用免疫印跡檢驗(yàn)穩(wěn)定系細(xì)胞P2XdPPANXl。收集培養(yǎng)細(xì)胞，PBS洗三次去除培 養(yǎng)基成分，細(xì)胞進(jìn)過冰上裂解液裂解后，采用12000g離心15分鐘。分裝上清液保存于-80 度冰箱備用。SDS-PAGE凝膠電泳用10%分離膠，每孔以40ug總蛋白上樣。100V電泳2小 時(shí)后，凝膠中的蛋白經(jīng)濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)移，100V電泳1.5小時(shí)。硝酸纖維素膜經(jīng)過TBST洗滌 三次后，膜經(jīng)過2%BSA封閉40分鐘后，再同兔抗P2X 7 -抗（1:1000稀釋）4°C過夜撫育，及 兔抗PANXl -抗（1:1000稀釋）4°C過夜撫育。次日硝酸纖維素膜經(jīng)過TBST洗滌三次后， 同1:1000稀釋的AP (堿性磷酸酶)標(biāo)記的抗兔二抗在37°C下孵育1小時(shí)。膜經(jīng)過TBST洗 滌后使用BCIP/NBT進(jìn)行顯示。結(jié)果顯示穩(wěn)定系C7細(xì)胞同時(shí)具有85kD重組P2X 7蛋白和微 弱的62kD野生型P2X7蛋白條帶見圖6左，P2X7抗體免疫印跡圖，其中1、2為穩(wěn)定系C7細(xì) 胞，3、4為未經(jīng)傳染的HEK野生細(xì)胞);此外，結(jié)果還顯示，穩(wěn)定系C7細(xì)胞同時(shí)具有68kD重組 PANXl蛋白和較弱的42kD野生型PANXl蛋白條帶（圖6右，PANXl抗體免疫印跡圖，其中1、 2為穩(wěn)定系C7細(xì)胞，3、4為未經(jīng)傳染的HEK野生細(xì)胞)，表明HEK細(xì)胞經(jīng)過雙基因的轉(zhuǎn)染后， 高表達(dá)P2X 7和PANXl，以上結(jié)果證實(shí)了雙表達(dá)穩(wěn)定系細(xì)胞構(gòu)建的成功。
【權(quán)利要求】
1. 一種P2X7-PANX1雙表達(dá)載體，其特征在于：含有如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示 的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的P2X7-PANX1雙表達(dá)載體，其特征在于：含有如SEQ ID NO. 17、 SEQ ID NO. 18所示的核苷酸序列。
3. -種如權(quán)利要求1或2所述的P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的制備方法，其特征在于：包 括以下步驟： (1) 利用PCR擴(kuò)增P2X7基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pEGFP-Nl載體上，獲得陽性重組質(zhì)粒 pP2X7-EGFP，擴(kuò)增P2X7基因的引物序列如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示； (2) 利用PCR擴(kuò)增PANX1基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pDsRed-Nl載體上，獲得陽性重組質(zhì) 粒pPANXl-RFP，擴(kuò)增PANX1基因的引物序列如SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示； (3) 利用PCR擴(kuò)增pPANXl-RFP質(zhì)粒上CMV:PANXl-dsRED-PloyA完整調(diào)控框架，利用 PCR反向擴(kuò)增pP2X7-EGFP質(zhì)粒骨架，兩種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后直接轉(zhuǎn)化宿主菌，挑取陽性克隆 并提取質(zhì)粒，鑒定即得P2X 7-PANX1雙表達(dá)載體，用于pPANXl-RFP質(zhì)粒的引物序列如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 所示，用于 pP2X7-GFP質(zhì)粒的引物序列如 SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10 所 /_J、1 o
4. 一種轉(zhuǎn)染如權(quán)利要求1或2所述的P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞，其特征在 于：制備方法包括如下步驟 ： (1) 取ρΡ2Χ7-ΡΑΝΧ1雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)備用； (2) 利用G418誘殺細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆，再擴(kuò)大培養(yǎng)即得。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)染P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞，其特征在于：所 述步驟（1)中轉(zhuǎn)染的方法為：取ρΡ2Χ 7-ΡΑΝΧ1質(zhì)粒DNA，與x-fect polymer及x-fect緩沖 液混合，靜置后再與DMEM培養(yǎng)基混勻；取混合物作為細(xì)胞培養(yǎng)液，于37°C、二氧化碳?xì)夥罩?培養(yǎng)細(xì)胞2?3天。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)染P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞，其特征在于：所 述步驟（2)中G418的濃度為600μ g/ml細(xì)胞培養(yǎng)基。
7. -種如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)染P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞的應(yīng) 用，其特征在于：穩(wěn)定系細(xì)胞作為嘌呤能死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究模型或死亡膜孔形 成機(jī)制研究模型中的應(yīng)用。
8. -種如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)染P2X7-PANX1雙表達(dá)載體的穩(wěn)定系細(xì)胞的應(yīng) 用，其特征在于：穩(wěn)定系細(xì)胞作為抑制嘌呤能死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的藥物篩選中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104293818SQ201410055164
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日
【發(fā)明者】李超堃, 魏林郁, 單琳琳, 李新娟, 王國紅, 李娜, 李超科, 李東亮 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院