肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法，通過從酸奶中分離到嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌四種乳酸菌，分別用中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解豬肉和雞肉后，通過OD622值比較得出乳酸菌的增殖效果，表明酶解物對四種乳酸菌的增殖作用均有影響，酶解時間為6h，酶解物添加量為3%時，對乳酸菌增殖作用最強；堿性蛋白酶的酶解物比中性蛋白酶的酶解物對乳酸菌的增殖效果好；酶解物對嗜熱鏈球菌的增殖效果最好，對干酪乳桿菌的增殖效果最差。本發(fā)明為提高乳酸菌增殖能力，縮短生產周期提供了理論基礎，為開發(fā)肉蛋白酶解物的營養(yǎng)保健食品奠定了理論基礎。
【專利說明】肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于乳酸菌增殖【技術領域】，尤其涉及一種肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法。
【背景技術】
[0002]目前，隨著人們對健康的重視，酸奶作為一種營養(yǎng)保健食品因具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境，促進胃腸的蠕動，抑制腸道內腐敗微生物的增長等功效越來越受到消費者的青睞，而酸奶中的菌種在調節(jié)腸道功能等方面起著重要作用，酸奶中主要菌種是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，某些酸奶中還有嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和雙歧桿菌這幾種益生菌，統(tǒng)稱為乳酸菌，肉類蛋白酶解物或多肽因具有多種生理功能近年來也成為研究開發(fā)的新型保健食品之一。
[0003]乳酸菌是指利用可發(fā)酵的糖類產生大量乳酸的細菌，呈革蘭氏陽性，在形態(tài)上分為桿菌和球菌，是兼性厭氧細菌，乳酸菌是我們腸道中主要的有益菌群，對人體有很多保健作用:
[0004](I)改善腸道微生物菌群的平衡，改善腸道微生物菌群的平衡是乳酸菌最早發(fā)現的功能之一，乳酸菌在進入腸道后會迅速生長繁殖，其產生的代謝物通過拮抗作用來維持腸道微生態(tài)菌群平衡，乳酸菌一般產生兩類物質:一是一些營養(yǎng)成分及酶系，包括能被人體充分吸收利用的多種維生素、氨基酸、乳糖、乳酸和多糖等及各種維生素等的特殊酶系，它們能夠促進宿主消化酶的分泌和胃腸道的蠕動，促進食物的消化吸收并預防便秘的發(fā)生；
二是抗菌物質，以生物拮抗作用來消除病原菌的存在，如過氧化氫具有明顯的抑菌作用；乳酸和乙酸等有機酸可降低腸道局部pH值抑菌或殺死腸道內的大腸埃希氏菌；許多乳酸菌在食物基質中可產細菌素，可抑制腐敗菌或致病菌等，乳酸菌還能防止病原菌在腸上皮細胞表面附著、定植并入侵 腸道細胞，這種機制有人稱為“粘附抗性”；
[0005](2)降低血清中的膽固醇含量，高的膽固醇含量意味著高風險心血管疾病的發(fā)生，國內外大量臨床實驗證實，乳酸菌具有不同程度降低膽固醇的效果，Gilliland[7]通過對腸道乳桿菌的降膽固醇作用的研究，提出了乳酸菌是由于在生長過程中降解膽鹽，促進膽固醇的分解代謝來降低膽固醇含量的觀點，趙麗捃，齊風蘭，陳有容在對腸道乳酸菌降低膽固醇作用的研究中，篩選出很多株具有降低膽同醇的乳酸菌菌株，肖琳琳和董明盛篩選出一株西藏干酪乳酸菌，實驗結果表明，其可以顯著降低高血脂小鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)濃度；
[0006](3)抗壓效果，高血壓是導致心臟疾病的另一個重要因素，高血壓主要是血管緊張肽轉化酶(ACE)間接引起，通常認為瑞士乳桿菌能產生較強的ACE抑制物質，從而降低高血壓患者的高壓和低壓；
[0007](4)抗癌效果，乳酸菌的抗癌效果主要是由于其具有抗突變的活性，乳酸菌的抗突變活性是由于乳酸菌本身及其代謝產物對可以將食物中的致癌物質前體轉化為致癌物的水解酶類起到抑制作用，實驗表明，給小鼠喂含有嗜酸乳桿菌的酸奶可以延長癌細胞出現的時間，飲用含有嗜酸乳桿菌的酸奶可以減少癌癥的發(fā)病指數；
[0008]( 5 )免疫調節(jié)作用，乳酸菌能夠提高機體的免疫活性，主要是由于乳酸菌及其代謝產物能通過誘導產生干擾素和促細胞分裂素來激活巨噬細胞和“NK”細胞活性，從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用，同時，乳酸菌在生長代謝過程中產生的乳酸、醋酸和過氧化氫等代謝產物，抑制了腸內腐敗及其他有害細菌的生長，減少了這些有害細菌產生的吲哚、毒胺、靛基質等致癌物質和其他毒性物質；
[0009](6)抗氧化效果，Verena等人研究發(fā)現乳酸菌能降低人結腸細胞(HT29)DNA的氧化性損傷，從而阻止結腸癌的發(fā)生，然而，對乳酸菌抗氧化活性的研究并不完善，有研究表明嗜酸乳桿菌有抗脂質過氧化和清除羥自由基的能力，具體抗氧化機制并不清楚，大部分研究者認為乳酸菌中可能有一些抗氧化的酶類物質(包括超氧化歧化酶和NADH氧化酶等)使其具有抗氧化活性；
[0010]蛋白質在酶的作用下水解得到的肽類以及更小分子量氨基酸等產物稱為蛋白酶解物，肉類蛋白酶解物或多肽是蛋白酶解物中的一種，它是由肉類蛋白經適當水解而得到，由于蛋白酶解物或者多肽具有比氨基酸或蛋白質更高的保健功能和營養(yǎng)價值，近年來成為研究的熱點，肉類蛋白酶解物或者多肽主要有以下幾點特性:
[0011](I)低過敏性，保留原蛋白的營養(yǎng)物質，更易被人體吸收利用；
[0012](2)改善蛋白質在加工利用過程中的溶解性、乳化性、凝膠性、起泡性等性質；
[0013](3)呈味更加豐富、突出，提高食品的風味；
[0014](4)諸多生理功能 ，如降血壓、促進胃腸道對鈣的吸收及防止腹瀉、改善脂質的代謝、增強免疫力、促進腸胃蠕動、保護胃粘膜防止胃潰瘍，防止骨質增生等；
[0015]由于這些特性，肉類蛋白酶解物或多肽作為新型的食品添加劑，用于生產高級調味品、食品的營養(yǎng)強化、功能性食品的基料而廣泛地應用于食品工業(yè)生產中。
[0016]國內外蛋白酶解物對乳酸菌增殖作用的影響研究:
[0017]張清麗研究表明酪蛋白用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶以及風味蛋白酶水解12h和用木瓜蛋白酶水解8h得到的酶解物對乳酸菌有較強的促生長活性；酪蛋白酶解物中的親水性氨基酸能更好的促進乳酸菌增殖，而含硫氨基酸對乳酸菌的促生長活性則沒有顯著的影響，01iveira、Lucas等研究表明在酸奶中添加酪蛋白酶解物可以明顯促進嗜熱鏈球菌的增殖，但對其他乳酸菌增殖影響很小，Bouhallab等報道了酪蛋白的胰蛋白酶酶解物對Lactococcus lactis subsp lactisCNRZ1076具有增殖作用，分子量小于3kDa段的酶解物能將該乳酸菌的生長速度提高兩倍；
[0018]曲杜娟，趙謀明研究表明:(1)乳清蛋白酶解物并未改變乳酸菌在酸奶中的生長曲線；(2)乳清蛋白酶解物可以顯著促進嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌的增殖，對保加利亞乳桿菌的增殖無顯著影響；(3)乳清蛋白酶解物可以提高嗜熱鏈球菌在保藏期的穩(wěn)定性，降低保加利亞乳桿菌在保藏期的穩(wěn)定性，從而降低了酸奶的后酸化，總之，乳清蛋白酶解物可以顯著提高乳酸菌的增殖；
[0019]樊秀花，何新益等人研究表明大豆蛋白水解多肽添加量為3%時，乳酸菌活菌數達到了最高，發(fā)酵終點時乳酸菌活菌數是對照組活菌數的1.3倍，結果表明大豆多肽可以明顯促進乳酸菌的增殖，可以提供乳酸菌生長必需的多肽和氨基酸，
[0020]張智，朱宏亮，鈕宏禹等人研究表明添加1.2%的玉米肽可以促進酸奶中乳酸菌的增殖，酸奶發(fā)酵時間比對照組縮短lh，乳酸菌的活菌數都能超過標準酸奶中含量；
[0021]李珂，楊秀華，扈麟等人研究表明豬骨蛋白酶解物對瑞士乳桿菌的增殖作用顯著，對保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖效果略低于酪蛋白酶解物，顯著高于大豆蛋白胨和魚粉蛋白胨；
[0022]乳酸菌本身蛋白質分解能力比較弱，生長比較緩慢，添加不同的蛋白質酶解物可以提供乳酸菌生長所需要的多肽和游離氨基酸，從而促進乳酸菌的增殖，提高乳酸菌的活菌數，縮短發(fā)酵時間，此外，蛋白質酶解物還可以提高保藏期乳酸菌的活菌數，提高酸奶的品質，影響乳酸菌增殖的因素是近年來在乳酸菌方面的研究熱點，大部分研究是一些蛋白質的酶解物或多肽對乳酸菌增殖作用的影響，如玉米肽、大豆多肽、酪蛋白酶解物、乳清蛋白酶解物和豬骨蛋白酶解物等，但尚未有研究肉類蛋白酶解物對乳酸菌增殖作用的影響。

【發(fā)明內容】

[0023]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法，旨在解決現有缺少肉類蛋白酶解物對乳酸菌增殖作用的影響實驗方法的問題。
[0024]本發(fā)明實施例是這樣實現的，一種肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法，該肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法通過鑒別性培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢和生化試驗鑒定從酸奶中分離嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌四種乳酸菌，分別用中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解豬肉和雞肉后，將2h、4h、6h酶解時間的酶解物以不同的1%、2%、3%的添加量添加到四種乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)72h后，通過OD622值比較得出乳酸菌的增殖效果。
[0025]進一步，酶解物對嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌四種乳酸菌的增殖作用均有影響，酶解時間為6h，酶解物添加量為3%時，對乳酸菌增殖作用最強；堿性蛋白酶的酶解物比中性蛋白酶的酶解`物對乳酸菌的增殖效果好；酶解物對嗜熱鏈球菌的增殖效果最好，對干酪乳桿菌的增殖效果最差。
[0026]進一步，嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌四種乳酸菌菌種的分離及純化包括以下步驟:
[0027]步驟一，將酸奶在超凈工作臺中用無菌移液管吸取ImL至無菌試管，加入無菌生理鹽水9mL,充分混勻后，吸取ImL菌液置于另一無菌試管中，再加入9mL無菌生理鹽水,如此稀釋4次，4支試管分別按順序記為10'10_2、10_3、10_4四個梯度；
[0028]步驟二，分別從4支試管中取0.2mL菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基平皿、麥芽糖-MRS培養(yǎng)基平皿、酸化MRS培養(yǎng)基平皿，每個梯度做3個平行，稀釋菌液置于4°C冰箱備用，平皿置恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)48h ；
[0029]步驟三，觀察麥芽糖-MRS培養(yǎng)基平皿上長出的菌落特征，對典型菌落進行革蘭氏染色和鏡檢后接于6種糖發(fā)酵管，進行生化鑒定；
[0030]步驟四，觀察酸化MRS培養(yǎng)基平皿上長出的菌落的菌落特征，對典型菌落進行革蘭氏染色和鏡檢后接于6種糖發(fā)酵管，進行生化鑒定；
[0031]步驟五，觀察MRS固體培養(yǎng)基平皿上長出的菌落的菌落特征，對幾種典型菌落分別進行革蘭氏染色和鏡檢，鏡檢為鏈球菌的菌落多次平板劃線，進行純化，鏡檢為桿菌的菌落接于6種糖發(fā)酵管，進行生化鑒定。
[0032]進一步，豬肉和雞肉的酶解包括以下步驟:
[0033]步驟一，將豬肉及雞肉各取六份，每份IOg置于50mL燒杯中，70°C熱水將肉燙漂后再用清水沖洗，置于沸水中煮沸25min，溫度降至常溫后切碎用研缽研細；
[0034]步驟二，每個燒杯加20mL蒸餾水，即肉水比為1:2，用Imo I/LNaOH溶液調節(jié)三份雞肉和三份豬肉的PH為7，另外三份雞肉和三份豬肉的pH為10 ;
[0035]步驟三，向pH為7的六份雞肉和豬肉樣品中分別加入中性蛋白酶0.2g,向pH為10的六份雞肉和豬肉樣品中分別加入堿性蛋白酶0.2g ；
[0036]步驟四，所有雞肉和豬肉樣品均置于50°C恒溫水浴鍋中保溫酶解，2h、4h、6h時各取出不同酶酶解的兩個雞肉酶解物、兩個豬肉酶解物于95°C水浴鍋中滅酶20min，滅酶后，酶解物在4000r/min下離心20min，取上清酶解液備用。
[0037]進一步，不同酶解物對菌種增殖作用影響的方法為:
[0038]將酶解物(上清酶解液)分別以1%、2%、3%添加于MRS液體培養(yǎng)基中，同時無菌生理鹽水以1%、2%、3%添加于MRS液體培養(yǎng)基中作為空白對照，分別從MRS固體培養(yǎng)基上用接種針挑取等量的單個菌落的每種菌接入已添加酶解物(上清酶解液)的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，以無菌生理鹽水為空白對照，在622nm波長下測定培養(yǎng)基OD值。
[0039]本發(fā)明提供的肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法，通過從酸奶中分離嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌四種乳酸菌，分別用中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解豬肉 和雞肉后，通過OD622值比較得出乳酸菌的增殖效果,表明酶解物對四種乳酸菌的增殖作用均有影響，酶解時間為6h，酶解物添加量為3%時，對乳酸菌增殖作用最強；堿性蛋白酶的酶解物比中性蛋白酶的酶解物對乳酸菌的增殖效果好；酶解物對嗜熱鏈球菌的增殖效果最好，對干酪乳桿菌的增殖效果最差。本發(fā)明通過研究肉類蛋白酶解物對乳酸菌增殖作用影響，為提高乳酸菌增殖能力，縮短生產周期提供了理論基礎，也可以為深入研究肉類蛋白食用后經人體內酶的水解，了解酶解物對腸道菌群增殖作用的影響提供了研究的方向，從而為開發(fā)肉蛋白酶解物的營養(yǎng)保健食品奠定了理論基礎，彌補了現有缺少肉類蛋白酶解物對乳酸菌增殖作用的影響實驗方法的空白。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1是本發(fā)明實施例提供的肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法流程圖；
[0041]圖2是本發(fā)明實施例提供的雞肉中性蛋白酶酶解物對嗜熱鏈球菌增殖作用影響示意圖；
[0042]圖3是本發(fā)明實施例提供的雞肉堿性蛋白酶酶解物對嗜熱鏈球菌增殖作用影響示意圖；
[0043]圖4是本發(fā)明實施例提供的豬肉中性蛋白酶酶解物對嗜熱鏈球菌增殖作用影響示意圖；
[0044]圖5是本發(fā)明實施例提供的豬肉堿性蛋白酶酶解物對嗜熱鏈球菌增殖作用影響示意圖；[0045]圖6是本發(fā)明實施例提供的酶解6h的酶解物對嗜熱鏈球菌增殖作用影響示意圖；
[0046]圖7是本發(fā)明實施例提供的雞肉中性蛋白酶酶解物對保加利亞乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0047]圖8是本發(fā)明實施例提供的雞肉堿性蛋白酶酶解物對保加利亞乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0048]圖9是本發(fā)明實施例提供的豬肉中性蛋白酶酶解物對保加利亞乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0049]圖10是本發(fā)明實施例提供的豬肉堿性蛋白酶酶解物對保加利亞乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0050]圖11是本發(fā)明實施例提供的酶解6h的酶解物對保加利亞乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0051]圖12是本發(fā)明實施例提供的雞肉中性蛋白酶酶解物對嗜酸乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0052]圖13是本發(fā)明實施例提供的雞肉堿性蛋白酶酶解物對嗜酸乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0053]圖14是本發(fā)明實施例提供的豬肉中性蛋白酶酶解物對嗜酸乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0054]圖15是本發(fā)明實施`例提供的豬肉堿性蛋白酶酶解物對嗜酸乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0055]圖16是本發(fā)明實施例提供的酶解6h的酶解物對嗜酸乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0056]圖17是本發(fā)明實施例提供的雞肉中性蛋白酶酶解物對干酪乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0057]圖18是本發(fā)明實施例提供的雞肉堿性蛋白酶酶解物對干酪乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0058]圖19是本發(fā)明實施例提供的豬肉中性蛋白酶酶解物對干酪乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0059]圖20是本發(fā)明實施例提供的豬肉堿性蛋白酶酶解物對干酪乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0060]圖21是本發(fā)明實施例提供的酶解6h的酶解物對干酪乳桿菌增殖作用影響示意圖；
[0061]圖22是本發(fā)明實施例提供的酶解6h的雞肉中性蛋白酶酶解物對四種乳酸菌增殖作用的影響示意圖；
[0062]圖23是本發(fā)明實施例提供的酶解6h的雞肉堿性蛋白酶酶解物對四種乳酸菌增殖作用的影響示意圖；
[0063]圖24是本發(fā)明實施例提供的酶解6h的豬肉中性蛋白酶酶解物對四種乳酸菌增殖作用的影響示意圖；
[0064]圖25是本發(fā)明實施例提供的酶解6h的豬肉堿性蛋白酶酶解物對四種乳酸菌增殖作用的影響示意圖。
【具體實施方式】
[0065]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0066]下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步描述。
[0067]本發(fā)明實施例的肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法包括以下步驟:
[0068]SlOl:通過鑒別性培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢和生化試驗鑒定從酸奶中分離嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌四種乳酸菌，分別用中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解豬肉和雞肉；
[0069]S102:將不同酶解時間(2h、4h、6h)的酶解物(上清酶解液)以不同的添加量(1%、2%、3%)添加到四種乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)72h后，通過OD622值比較得出乳酸菌的增殖效果。
[0070]本發(fā)明的結果表明，酶解物對四種乳酸菌的增殖作用均有影響,酶解時間為6h，酶解物添加量為3%時，對乳酸菌增殖作用最強；堿性蛋白酶的酶解物比中性蛋白酶的酶解物對乳酸菌的增殖效果好；酶解物對嗜熱鏈球菌的增殖效果最好，對干酪乳桿菌的增殖效果 最差。
[0071]結合以下的具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明:
[0072]1、材料與方法:
[0073]材料:
[0074]
【權利要求】
1.一種肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法，其特征在于，該肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法通過鑒別性培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢和生化試驗鑒定從酸奶中分離到的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌四種乳酸菌，分別用中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解豬肉和雞肉后，將2h、4h、6h酶解時間的酶解物以不同的1%、2%、3%的添加量添加到四種乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)72h后，通過OD622值比較得出乳酸菌的增殖效果。
2.如權利要求1所述的肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法，其特征在于，酶解物對嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌四種乳酸菌的增殖作用均有影響，酶解時間為6h，酶解物添加量為3%時，對乳酸菌增殖作用最強；堿性蛋白酶的酶解物比中性蛋白酶的酶解物對乳酸菌的增殖效果好；酶解物對嗜熱鏈球菌的增殖效果最好，對干酪乳桿菌的增殖效果最差。
3.如權利要求1所述的肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法，其特征在于，嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌四種乳酸菌菌種的分離及純化包括以下步驟: 步驟一，將酸奶在超凈工作臺中用無菌移液管吸取ImL至無菌試管，加入無菌生理鹽水9mL,充分混勻后,吸取ImL菌液置于另一無菌試管中，再加入9mL無菌生理鹽水,如此稀釋4次，4支試管分別按順序記為ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4四個梯度； 步驟二，分別從4支試管中取0.2mL菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基平皿、麥芽糖-MRS培養(yǎng)基平皿、酸化MRS培養(yǎng)基平皿，每個梯度做3個平行，稀釋菌液置于4°C冰箱備用，平皿置恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)48h ； 步驟三，觀察麥芽糖-MRS培養(yǎng)基平皿上長出的菌落特征，對典型菌落進行革蘭氏染色和鏡檢后接于6種糖發(fā)酵管，進行生化鑒定； 步驟四，觀察酸化MRS培養(yǎng) 基平皿上長出的菌落的菌落特征，對典型菌落進行革蘭氏染色和鏡檢后接于6種糖發(fā)酵管，進行生化鑒定； 步驟五，觀察MRS固體培養(yǎng)基平皿上長出的菌落的菌落特征，對幾種典型菌落分別進行革蘭氏染色和鏡檢，鏡檢為鏈球菌的菌落多次平板劃線，進行純化，鏡檢為桿菌的菌落接于6種糖發(fā)酵管，進行生化鑒定。
4.如權利要求1所述的肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法，其特征在于，豬肉和雞肉的酶解包括以下步驟: 步驟一，將豬肉及雞肉各取六份，每份IOg置于50mL燒杯中，70°C熱水將肉燙漂后再用清水沖洗，置于沸水中煮沸25min，溫度降至常溫后切碎用研缽研細； 步驟二，每個燒杯加20mL蒸餾水，即肉水比為1:2，用ImoI/LNaOH溶液調節(jié)三份雞肉和三份豬肉的PH為7，另外3份雞肉和3份豬肉的pH為10 ; 步驟三，向pH為7的六份雞肉和豬肉樣品中分別加入中性蛋白酶0.2g,向pH為10的六份雞肉和豬肉樣品中分別加入堿性蛋白酶0.2g ； 步驟四，所有雞肉和豬肉樣品均置于50°C恒溫水浴鍋中保溫酶解，2h、4h、6h時各取出不同酶酶解的兩個雞肉酶解物、兩個豬肉酶解物于95 °C水浴鍋中滅酶20min，滅酶后,酶解物在4000r/min下離心20min,取上清酶解液備用。
5.如權利要求1所述的肉類蛋白酶解物對酸奶中分離乳酸菌增殖作用的實驗方法，其特征在于，不同酶解物對菌種增殖作用影響的方法為: 將酶解物分別以1%、2%、3%添加于MRS液體培養(yǎng)基中，酶解物為上清酶解液，同時無菌生理鹽水以1%、2%、3%添加于MRS液體培養(yǎng)基中作為空白對照，分別從MRS固體培養(yǎng)基上用接種針挑取等量的單個菌落的每種菌接入已添加酶解物的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，以無菌生理鹽水為空白對照，在622nm波長下測定培養(yǎng)基OD值。
【文檔編號】C12R1/46GK103820379SQ201410056354
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月19日 優(yōu)先權日:2014年2月19日
【發(fā)明者】孫京新, 黃明, 徐幸蓮, 王淑玲, 李鵬, 劉功明, 呂新宇 申請人:青島農業(yè)大學