一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，包括以下步驟：a)將鮮海參去除內(nèi)臟，放入沸水中煮，得到海參蒸煮液；b)海參蒸煮液調(diào)節(jié)pH，離心得到上清液；c)上清液過柱，分別用去離子水和20%乙醇溶液沖洗樹脂，再用70%乙醇溶液進行洗脫，收集70%乙醇溶液洗脫組分；d)減壓濃縮所收集的洗脫組分，至浸膏狀，用去離子水復(fù)溶，離心取上清，上清液經(jīng)石油醚萃取脫脂，取水層再用水飽和正丁醇萃取，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥即得海參總皂苷；e)采用蝸牛酶酶解海參總皂苷；f)減壓濃縮后進行冷凍干燥，即得海參次生皂苷。本發(fā)明條件溫和，制備方法簡單。
【專利說明】一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海洋中蘊藏著極為豐富的資源和能源，而我國海區(qū)擁有的物種也十分多樣，隨著海洋產(chǎn)業(yè)不斷的快速發(fā)展，越來越多的企業(yè)家都把目光投向了海洋這塊市場，因此近十幾年來我國海洋制藥行業(yè)發(fā)展得十分迅猛，而國內(nèi)對棘皮動物門中海參的研究也是一大熱門的領(lǐng)域。
[0003]海參為棘皮動物門(Echinodenmata)海參綱(Holothunoider)生物，全世界的海參有1200多種，我國海域約有140多種。在海參體壁和內(nèi)臟中，能分泌出一些活性作用很強的物質(zhì)，即海參皂苷，它是海參主要次生代謝產(chǎn)物，也是其進行化學(xué)防御的物質(zhì)基礎(chǔ)。藥理實驗表明，海參皂苷大都具有強烈的生理活性作用，如抗腫瘤、抗真菌、抗炎、抗病毒、提高免疫力、溶血性及抗膽堿作用等。
[0004]目前，國內(nèi)外對海參體壁、海參加工廢液、海參體腔液中的皂苷提取工藝進行了研究，例如2011年8月17日公開的CN102150851A發(fā)明專利申請公開的“海參皂苷及其制備方法、在食品藥品中的應(yīng)用”；又如:2011年5月18日公開的CN102060905A發(fā)明專利申請公開的“利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holotoxin Al對照品的工藝方法”;還有，2012年6月27日公開的CN102512452A發(fā)明專利申請公開的“利用海參體腔液制備海參皂苷的工藝方法”。
[0005]至今為止，已經(jīng)從海參中分離出至少140多種的海參皂苷。海參皂苷由苷元和寡糖鏈兩部分組成，含有5個角甲基，苷元的3位上有羥基取代，與糖通過β -O糖苷鍵結(jié)合成苷。海參皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜多樣，側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)、內(nèi)酯環(huán)的變化、雙鍵的位置以及12、16、17位上的取代基上的變化都會引起苷元結(jié)構(gòu)的變化，而寡糖鏈的結(jié)構(gòu)會因單糖的連接位置和順序、單糖的組成和數(shù)目、硫酸酯基的連接位置和數(shù)目等發(fā)生變化。藥理活性研究表明，海參皂苷的活性與苷元、寡糖鏈的結(jié)構(gòu)都有關(guān)系。對于苷元結(jié)構(gòu)相同、而糖基側(cè)鏈不同的物質(zhì)，它們的藥理活性也有著顯著的差別。因此，改變海參皂苷糖基側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)，有可能得到藥用價值更高的次生皂苷。
[0006]對天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的修飾主要有化學(xué)法、微生物法和酶法?；瘜W(xué)法主要包括酸堿法，雖然操作簡單，但專一性差，且大量使用有機溶劑會對環(huán)境造成污染；而很多天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化采用微生物發(fā)酵法，即用微生物產(chǎn)生的代謝酶對底物進行水解，微生物法專屬性較強，條件溫和，環(huán)境污染小，但微生物發(fā)酵法培養(yǎng)條件苛刻，且發(fā)酵需要尋找高效的菌株以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此，相比于化學(xué)法和微生物發(fā)酵法，體外酶法專一性強，酶解效率高，操作簡單，只要確定酶反應(yīng)的最適條件即可。有關(guān)皂苷類的酶法轉(zhuǎn)化研究目前在人參皂苷、三七皂苷、大豆皂苷等取得較大的進展。2009年7月15日公開的CN101481725A發(fā)明專利申請公開的“酶促水解人參皂苷Rb1制備人參皂苷F2的方法”中就將含量較高、藥用價值較低的人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化成含量較低、藥用價值較高的人參皂苷F2。而對于海參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，目前都還未有相關(guān)的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，包括以下步驟:
[0010]a)將鮮海參去除內(nèi)臟，放入沸水中煮20— 30min，得到的即為海參蒸煮液；
[0011]b)海參蒸煮液調(diào)節(jié)pH至9.5-10.5,6000-10000r/min離心20_60min得到上清液；
[0012]c)上清液過AB-8型大孔樹脂柱，分別用3-4倍柱體積的去離子水和20%乙醇溶液沖洗樹脂，再用5-15倍柱體積的70%乙醇溶液進行洗脫，收集70%乙醇溶液洗脫組分；
[0013]d)減壓濃縮所收集的洗脫組分，至浸膏狀，用去離子水復(fù)溶，6000-10000r/min離心20-60min取上清，上清液經(jīng)石油醚萃取脫脂，取水層再用水飽和正丁醇萃取2_4次，合并正丁醇層，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥即得海參總皂苷；
[0014]e)采用蝸牛酶酶解海參總皂苷，緩沖液為ρΗ3.5-4.50.005-0.02 μ mol/L的磷酸檸檬酸緩沖液，蝸牛酶粗酶與海參總皂苷的重量比例為1:1_3，在水浴鍋中反應(yīng)24-48h，用甲醇終止反應(yīng)，并用0.5-2倍體積的乙醇萃取浸提12-36h ；
[0015]f)減壓濃縮后，用去離子水復(fù)溶，再用水飽和正丁醇萃取2-4次，合并正丁醇層，減壓濃縮后進行冷凍干燥，即得海參次生皂苷。
[0016]其中，本發(fā)明所用的海參優(yōu)選為刺參。
[0017]其中，本發(fā)明步驟a)加入的沸水體積優(yōu)選為:煮20— 30min后，每kg海參產(chǎn)生400-600ml倍蒸煮液。
[0018]其中，步驟d)去離子水復(fù)溶時，加入的體積優(yōu)選為浸膏體積的1-5倍。
[0019]其中，步驟e)蝸牛酶粗酶優(yōu)選在45°C水浴鍋中活化lh。
[0020]其中，步驟e)水浴鍋反應(yīng)溫度可以為40_50°C，優(yōu)選為45°C。
[0021]本發(fā)明充分利用新鮮海參加工煮制過程中所產(chǎn)生的蒸煮液，從而能夠分離提取出海參總皂苷，并用蝸牛酶粗酶對海參總皂苷進行轉(zhuǎn)化，得到次生皂苷。本發(fā)明提供了一種利用蝸牛酶粗酶在溫和的條件下選擇性的催化水解海參總皂苷，從而得到更有潛力、更稀有的次生皂苷的方法。酶具有高效性、專一性等特點，而對于海參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，到目前為止都還未見有相關(guān)的研究報道。因此，本發(fā)明有助于海參皂苷在醫(yī)學(xué)、制藥行業(yè)的進一步發(fā)展。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為海參總皂苷凍干品。圖1顯示的即為海參總皂苷過AB-8型大孔樹脂后得到的凍干樣品。
[0023]圖2為海參總皂苷酶解前后的薄層層析圖譜。從圖2中可以看出，在物料比1:2、pH4.0、45°C下反應(yīng)36h，蝸牛酶將海參總皂苷成功轉(zhuǎn)化為次生皂苷，酶解組分的遷移率為0.44±0.01。
[0024]圖3為海參蒸煮液過AB-8型大孔樹脂柱的薄層層析圖譜。從圖3可以看出，提取出的海參皂苷主要有兩種類型。[0025]圖4兩種類型的海參皂苷酶解前后的薄層層析圖譜。A、B表示兩種不同類型的海參皂苷。
【具體實施方式】
[0026]實施例1
[0027](I)將IOOkg的新鮮海參取出內(nèi)臟后，放入沸騰的開水中煮20_30min，IOOkg的海參產(chǎn)生約50kg的海參蒸煮液。取海參蒸煮液5L，調(diào)節(jié)pH值為10，8000r/min離心40min得到上清液。
[0028](2)將所得的上清液通過AB-8型大孔樹脂柱，流速為2BV/h，吸附飽和后，用2L的去離子水沖洗，再用2L20%的乙醇溶液沖洗，最后用6L70%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，用500mL的去離子水復(fù)溶,8000r/min離心40min取上清,上清液經(jīng)石油醚萃取脫脂，取水層再用水飽和正丁醇萃取三次，合并正丁醇層，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥即得海參總皂苷。
[0029](3)配制500mL pH4.0，0.01 μ mol/L的磷酸檸檬酸鹽緩沖液。首先，稱取125mg的蝸牛酶粗酶，加入少量緩沖液，在45°C活化lh。另外，稱取冷凍干燥得到的海參總皂苷250mg，用剩余的緩沖液溶解。將活化的蝸牛酶粗酶加入到海參總皂苷中，在45°C下恒溫水浴反應(yīng)36h。
[0030](4)用甲醇進行終止反應(yīng)后，加入乙醇進行萃取浸提24h，減壓濃縮后，用去離子水復(fù)溶，用水飽和正丁醇萃取三次，合并正丁醇層，減壓濃縮后進行冷凍干燥，即得到海參次生皂苷，并用薄層層析法對樣品進行檢測，是否海參總皂苷發(fā)生了酶解反應(yīng)。
[0031]圖1顯示的即為海參總皂苷過AB-8型大孔樹脂后得到的凍干樣品；而從圖2中可以看出，在物料比1:2、pH4.0、45°C下反應(yīng)36h，蝸牛酶將海參總皂苷成功轉(zhuǎn)化為次生皂苷，酶解組分的遷移率為0.44 ± 0.01。
[0032]實施例2
[0033](I)將上述所述的海參蒸煮液500ml，調(diào)pH值為10，8000r/min離心40min得到上清液。
[0034](2)將上清液上樣于預(yù)處理的AB-8型大孔樹脂柱，流速為2BV/h，吸附飽和后，再分別用300ml的去離子水和20%乙醇溶液沖洗，接著用600ml70%的乙醇溶液洗脫，洗脫組分經(jīng)薄層層析檢測，收集不同種類的海參皂苷。減壓濃縮至浸膏狀，用去離子水復(fù)溶后，8000r/min離心40min取上清，上清液經(jīng)石油醚萃取脫脂，取水層再用水飽和正丁醇萃取三次，合并正丁醇層，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥即得種類不同的海參皂苷。
[0035]從薄層層析圖譜中(圖3)可以看出，提取出的海參皂苷主要有兩種類型。
[0036](3)將收集得到主要的兩種類型的海參皂苷，分別對其進行酶解反應(yīng)。各配制250mLpH4.0,0.01 μ mol/L的磷酸檸檬酸鹽緩沖液，稱取40mg的蝸牛酶粗酶，加入少量緩沖液，在45°C活化lh。另外,分別取冷凍干燥的兩種海參皂苷各lOOmg，用剩余的緩沖液溶解。將活化的蝸牛酶粗酶加入到海參 總皂苷中，在45°C下恒溫水浴反應(yīng)36h。
[0037](4)用甲醇進行終止反應(yīng)后，加入乙醇進行萃取浸提24h，減壓濃縮后，用去離子水復(fù)溶，用水飽和正丁醇萃取三次，合并正丁醇層，減壓濃縮并用薄層層析法檢測兩種類型的海參皂苷是否都發(fā)生了酶解。[0038]在物料比1: 2、pH4.0、45°C下反應(yīng)36h進行酶解反應(yīng)，從圖4中可以看出，只有一種類型的海參皂苷發(fā)生了酶解，產(chǎn)生了 Rf值為0.44的海參皂苷，且從圖4中可以看出酶解反應(yīng)并未完全(圖4-B)。將酶解后的樣減壓濃縮后，用去離子水復(fù)溶，靜置一段時間，出現(xiàn)了絮狀物，而加入無水乙醇，絮狀物消失，表明溶液中有溶于醇而不溶于水的物質(zhì)。去除乙醇后，將酶解樣進行離心，沉淀用薄層層析(TLC)檢測，如圖4-B所示，說明白色的絮狀物中存在大量的皂苷，也表明原本水溶性的海參皂苷酶解后，產(chǎn)生了不溶于水而溶于醇的次生皂苷。
【權(quán)利要求】
1.一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，包括以下步驟: a)將鮮海參去除內(nèi)臟，放入沸水中煮20-30min，得到的即為海參蒸煮液； b)海參蒸煮液調(diào)節(jié)pH至9.5-10.5,6000-10000r/min離心20_60min得到上清液； c)上清液過AB-8型大孔樹脂柱，分別用3-4倍柱體積的去離子水和20%乙醇溶液沖洗樹脂，再用5-15倍柱體積的70%乙醇溶液進行洗脫，收集70%乙醇溶液洗脫組分； d)減壓濃縮所收集的洗脫組分，至浸膏狀，用去離子水復(fù)溶，6000-10000r/min離心20-60min取上清，上清液經(jīng)石油醚萃取脫脂，取水層再用水飽和正丁醇萃取2_4次，合并正丁醇層，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥即得海參總皂苷； e)采用蝸牛酶酶解海參總皂苷，緩沖液為PH3.5-4.50.005-0.02 μ mol/L的磷酸檸檬酸緩沖液，蝸牛酶粗酶與海參總皂苷的重量比例為1:1_3，在水浴鍋中反應(yīng)24-48h，用甲醇終止反應(yīng)，并用0.5-2倍體積的乙醇萃取浸提12-36h ； f)減壓濃縮后，用去離子水復(fù)溶，再用水飽和正丁醇萃取2-4次，合并正丁醇層，減壓濃縮后進行冷凍干燥，即得海參次生皂苷。
2.如權(quán)利要求1所述的一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，其特征在于:所述的海參為刺參。
3.如權(quán)利要求1所述的一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，其特征在于:步驟a)加入的沸水體積為:煮20-30min后，每kg海參產(chǎn)生400-600ml倍蒸煮液。
4.如權(quán)利要求1所述的一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，其特征在于:步驟d)去離子水復(fù)溶時，加入的體積為浸膏體積的1-5倍。
5.如權(quán)利要求1所述的一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，其特征在于:步驟e)蝸牛酶粗酶在45°C水浴鍋中活化lh。
6.如權(quán)利要求1所述的一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，其特征在于:步驟e)水浴鍋反應(yīng)溫度40-50°C。
【文檔編號】C12P33/20GK103898186SQ201410057554
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】林毅, 林淑芳 申請人:華僑大學(xué)