一種以中藥為基質(zhì)硬毛粗蓋孔菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶及發(fā)酵殘渣綜合利用的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以中藥為基質(zhì)硬毛粗蓋孔菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶及發(fā)酵殘渣綜合利用的方法，以中藥為固態(tài)基質(zhì)，加入適量液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)含水量后，接入產(chǎn)漆酶白腐真菌種子液，發(fā)酵后提取漆酶，發(fā)酵殘渣加入萃取劑提取中藥活性成分。該發(fā)明實現(xiàn)了漆酶無外源銅離子誘導(dǎo)產(chǎn)漆酶，發(fā)酵殘渣綜合利用。該發(fā)明具有如下優(yōu)點：以中藥作為固態(tài)基質(zhì)發(fā)酵具有成本低，漆酶產(chǎn)量高等優(yōu)勢；以中藥作為固態(tài)基質(zhì)，中藥中的活性成分能夠促進(jìn)白腐真菌產(chǎn)漆酶；固態(tài)發(fā)酵過程中微生物生長代謝產(chǎn)生的酶系能夠破壞中藥表面致密的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)，使得發(fā)酵殘渣易于提取活性成分。
【專利說明】一種以中藥為基質(zhì)硬毛粗蓋孔菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶及發(fā)酵殘渣綜合利用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于漆酶固態(tài)發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種以中藥為基質(zhì)硬毛粗蓋孔菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶及發(fā)酵殘渣綜合利用的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，漆酶能催化多酚、多氨基苯等物質(zhì)的氧化，使之生成相應(yīng)的苯醌和水，屬藍(lán)色多銅氧化酶(blue mult1- copper oxidase)家族(Leonowiczet al.，2001)。漆酶最早由 Yoshida(1983)在日本紫膠漆樹(Rhus verniciflua)上發(fā)現(xiàn)，是一種可催化漆固化過程的蛋白質(zhì)，1984年，Bertrand將這種蛋白質(zhì)命名為漆酶(Laccase)。隨著研究的深入，在真菌和其他植物中都有發(fā)現(xiàn)，同時在細(xì)菌和昆蟲中也有報道。但植物漆酶和真菌漆酶催化過程并不相同，植物漆酶參與木質(zhì)素合成，通過自由基聚合反應(yīng)，使香豆醇、松柏醇和芥子醇等聚合成木質(zhì)素；真菌漆酶參與木質(zhì)素降解，氧化酚羥基，同時生成水。真菌漆酶底物特異性較低，能夠催化降解多種芳香族化合物，應(yīng)用范圍廣泛。在食品工業(yè)方面，漆酶經(jīng)固定化，可用于除去啤酒、果汁中的酚類物質(zhì)，改變產(chǎn)品色澤和提高質(zhì)量，在油類和含油制品中，添加漆酶可以防止產(chǎn)品氧化；造紙方面，利用漆酶選擇性地降解木質(zhì)素生產(chǎn)紙漿，同時也可用于紙漿漂白，或?qū)υ旒垙U水進(jìn)行脫氯處理；染料脫色降解方面，包括氮類染料，蒽醌染料，金屬染料等；在農(nóng)藥降解方面，如五氯苯酚等?？梢哉f漆酶應(yīng)用范圍越來越廣，涉及漆酶生產(chǎn)菌株也越來越多。
[0003]目前漆酶的生產(chǎn)主要包含固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種方式。其中工業(yè)上應(yīng)用較多的仍是液態(tài)發(fā)酵，而液態(tài)發(fā)酵能耗高，操作復(fù)雜，產(chǎn)生大量發(fā)酵廢水。與液態(tài)發(fā)酵相比固體發(fā)酵由于其成本低、單位基質(zhì)產(chǎn)酶量高，發(fā)酵過程具有節(jié)能，節(jié)水等優(yōu)勢，而成為漆酶發(fā)酵的重要方向。目前漆酶固態(tài)發(fā)酵`的固態(tài)基質(zhì)主要為玉米秸桿，稻草秸桿，麩皮等。但漆酶固態(tài)發(fā)酵過程中往往需要添加銅離子作為誘導(dǎo)劑，這在一定程度上限制了漆酶的應(yīng)用，因此如何實現(xiàn)低銅離子濃度或者無銅離子條件下實現(xiàn)漆酶發(fā)酵是當(dāng)前研究的重要方向。硬毛粗蓋孔菌屬于非褶菌目多孔菌科粗毛蓋孔菌屬，主要生長于楊樹，柳樹腐木、倒木、貯木等上，在中國廣泛分布，是自然界常見白腐真菌。硬毛粗蓋孔菌生長速度快，生物量大，產(chǎn)酶活力高，能夠同時降解纖維素和木質(zhì)素，但對木質(zhì)素降解選擇性更強(qiáng)。但目前對于其漆酶生產(chǎn)方式，特別是規(guī)?；a(chǎn)還有待進(jìn)一步加強(qiáng)，本發(fā)明建立了一種新型的硬毛粗蓋孔菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高活性漆酶的方法。
[0004]中藥主要包含纖維素，木質(zhì)素半纖維素等成分，同時還含有淀粉、膠質(zhì)、還原糖和有機(jī)酸等。以甘草為例，甘草中發(fā)現(xiàn)和確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分主要有三萜皂甙(主要是甘草酸)、黃酮、香豆素、生物堿、揮發(fā)油、有機(jī)酸、糖類等，其中三萜皂甙和黃酮類是其主要活性成分。上述木質(zhì)纖維素可以作為白腐菌生長代謝時的碳源，而甘草中所含的酚類化合物也可以作為誘導(dǎo)物促進(jìn)真菌漆酶產(chǎn)量的提高。另一方面，甘草的致密結(jié)構(gòu)，木質(zhì)纖維素的包裹作用也限制了甘草活性成分(如黃酮)的提取。而產(chǎn)漆酶真菌生長過程中會分泌木質(zhì)素降解酶系，纖維素酶系等，上述酶系可以降解甘草木質(zhì)纖維素，破壞甘草致密結(jié)構(gòu)，利于黃酮提取。最終實現(xiàn)“1+1>2”的效果?！?br> [0005]本發(fā)明利用中藥做為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，節(jié)省了發(fā)酵成本，中藥中的微量元素可以促進(jìn)硬毛粗蓋孔菌在無外源銅離子誘導(dǎo)的情況下生產(chǎn)漆酶，而白腐真菌固態(tài)發(fā)酵過程中分泌酶系破壞中藥致密結(jié)構(gòu)，利于中藥有效成分的提取。本發(fā)明實現(xiàn)了中藥同時作為固態(tài)基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)漆酶，發(fā)酵殘渣提取有效成分，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是實現(xiàn)以中藥為基質(zhì)，在無外源銅離子誘導(dǎo)的前提下，固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶，及其發(fā)酵殘渣綜合利用的方法。
[0007]—種以中藥為基質(zhì)硬毛粗蓋孔菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶及發(fā)酵殘渣綜合利用的方法的技術(shù)方案如下:
[0008](1)將中藥粉碎后作為固態(tài)基質(zhì)，加入液體培養(yǎng)基攪拌均勻后滅菌；
[0009](2)接入硬毛粗蓋孔菌種子液固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶；
[0010](3)發(fā)酵結(jié)束后向發(fā)酵基質(zhì)加水提取漆酶，過濾后得到漆酶溶液和發(fā)酵殘渣；
[0011](4)發(fā)酵殘渣中加入萃取劑，提取活性成分。
[0012]步驟(1)的中藥為甘草，葛根，黃芪，山楂，決明子，麻黃中的一種。
[0013]步驟(1)的液體培養(yǎng)基包括氮源和硫酸銅，其中氮源為尿素，酵母粉，蛋白胨，硫酸銨，硝酸鈉之一或任意組合，其濃度為I~15g/L ;液體培養(yǎng)基含有硫酸銅濃度為0.5~10g/L ;液體培養(yǎng)基的pH值為4~7。
[0014]步驟(2)的種子液為硬毛粗蓋孔菌在馬鈴薯培養(yǎng)基中液態(tài)發(fā)酵4~5天所得的發(fā)酵液液；種子液接種量為固態(tài)基質(zhì)總質(zhì)量的5%~10%，固態(tài)發(fā)酵條件為25 V~35°C，好氧發(fā)酵7~21天；
[0015]步驟(3)加水提取漆酶為水與發(fā)酵基質(zhì)的質(zhì)量比為1:10~l:50，130rpm~200rpm震蕩提取2~4h。
[0016]步驟(4)的發(fā)酵殘渣中加入的萃取劑為甲醇，乙醇，丁醇，乙酸乙酯和5%Na0H溶液之一，發(fā)酵殘渣與萃取劑的質(zhì)量固液比為1:2~1:10，提取溫度50°C~80°C，提取時間2~4h0
[0017]一種以中藥為基質(zhì)硬毛粗蓋孔菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶及發(fā)酵殘渣綜合利用的方法具有如下有優(yōu)點:
[0018](1)以中藥作為硬毛粗蓋孔菌固態(tài)基質(zhì)發(fā)酵具有成本低，漆酶產(chǎn)量高等優(yōu)勢。
[0019](2)以中藥作為固態(tài)基質(zhì)，中藥中的活性成分能夠促進(jìn)白腐真菌產(chǎn)漆酶。
[0020](3)硬毛粗蓋孔菌破壞中藥表面致密結(jié)構(gòu)，有利于中藥提取活性成分。
【具體實施方式】
[0021]實施例1:取甘草100克，粉碎后過20目篩作為固態(tài)基質(zhì)，加入300ml，pH=4的Ig/L硫酸銨液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)固態(tài)基質(zhì)含水量為75% ;滅菌后接入5%產(chǎn)漆酶真菌硬毛粗蓋孔菌種子液；28°C好氧培養(yǎng)14天；以1:4的固液比加入蒸餾水，130rpm震蕩提取酶液2h，將酶提取液和發(fā)酵殘渣濾紙過濾，收集濾液和發(fā)酵殘渣；向發(fā)酵殘渣中加入以1:4的固液比加入80%(v/v)乙醇，80°C加熱提取2h，從萃取液中分離得到黃酮，漆酶產(chǎn)量為200U/g，甘草酸提取率為3.96mg/g。
[0022]實施例2:取葛根200克，粉碎后過20目篩作為固態(tài)基質(zhì)，加入400ml，pH=4的5g/L尿素液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)固態(tài)基質(zhì)含水量為66%;滅菌后接入8%產(chǎn)漆酶真菌硬毛粗蓋孔菌種子液；28°C好氧培養(yǎng)21天；以1:4的固液比加入蒸餾水，130rpm震蕩提取酶液2h，將酶提取液和發(fā)酵殘渣濾紙過濾，收集濾液和發(fā)酵殘渣；向發(fā)酵殘渣中加入以1:4的固液比加入80%(v/v)乙醇，70°C加熱提取2h，從萃取液中分離得到黃酮，漆酶產(chǎn)量為310U/g，黃酮提取率為 2.85mg/g。
[0023]實施例3:取黃芪200克，粉碎后過40目篩作為固態(tài)基質(zhì)，加入900ml，pH=4的Ig/L蛋白胨液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)固態(tài)基質(zhì)含水量為75% ;滅菌后接入8%產(chǎn)漆酶真菌硬毛粗蓋孔菌種子液；28°C好氧培養(yǎng)21天；以1:4的固液比加入蒸餾水，130rpm震蕩提取酶液2h，將酶提取液和發(fā)酵殘渣濾紙過濾，收集濾液和發(fā)酵殘渣；向發(fā)酵殘渣中加入以1:2的固液比加入80%(v/v)甲醇，80°C加熱提取2h，從萃取液中分離得到黃酮，漆酶產(chǎn)量為298U/g，黃酮提取率為 3.62mg/g。
[0024]實施例4:取山楂200克，粉碎后過40目篩作為固態(tài)基質(zhì)，加入200ml，pH=4的2g/L硝酸鈉液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)固態(tài)基質(zhì)含水量為75% ;滅菌后接入8%產(chǎn)漆酶真菌硬毛粗蓋孔菌種子液；28°C好氧培養(yǎng)21天；以1:4的固液比加入蒸餾水，130rpm震蕩提取酶液2h，將酶提取液和發(fā)酵殘渣濾紙過濾，收集濾液和發(fā)酵殘渣；向發(fā)酵殘渣中加入以1:3的固液比加入水，40°C加熱提取2h，從萃取液中分離得到山楂活性成分，漆酶產(chǎn)量為176U/g，山楂活性成分提取率為1.62mg/g 。
[0025]實施例5:取決明子200克，粉碎后過40目篩作為固態(tài)基質(zhì)，加入200ml, pH=4的2g/L硝酸鈉液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)固態(tài)基質(zhì)含水量為75% ;滅菌后接入8%產(chǎn)漆酶真菌硬毛粗蓋孔菌種子液；28°C好氧培養(yǎng)18天；以1:4的固液比加入蒸餾水，130rpm震蕩提取酶液3h，將酶提取液和發(fā)酵殘渣濾紙過濾，收集濾液和發(fā)酵殘渣；向發(fā)酵殘渣中加入以1:3的固液比加入水，60°C加熱提取2h，得到?jīng)Q明子活性成分，漆酶產(chǎn)量為216U/g，決明子活性成分提取率為 1.96mg/g。
[0026]實施例6:取麻黃300克，粉碎后過30目篩作為固態(tài)基質(zhì)，加入200ml，pH=4的2g/L硝酸鈉液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)固態(tài)基質(zhì)含水量為75% ;滅菌后接入5%產(chǎn)漆酶真菌硬毛粗蓋孔菌種子液；28°C好氧培養(yǎng)18天；以1:4的固液比加入蒸餾水，130rpm震蕩提取酶液3h，將酶提取液和發(fā)酵殘渣濾紙過濾，收集濾液和發(fā)酵殘渣；向發(fā)酵殘渣中加入以1:3的固液比加入甲醇，60°C加熱提取2h，得到?jīng)Q明子活性成分，漆酶產(chǎn)量為96U/g，麻黃堿提取率為1.34mg/g°
【權(quán)利要求】
1.一種以中藥為基質(zhì)硬毛粗蓋孔菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶及發(fā)酵殘渣綜合利用的方法，其特征在于以下步驟: (1)將中藥粉碎后作為固態(tài)基質(zhì)，加入液體培養(yǎng)基攪拌均勻后滅菌； (2)接入硬毛粗蓋孔菌種子液固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶； (3)發(fā)酵結(jié)束后向發(fā)酵基質(zhì)加水提取漆酶，過濾后得到漆酶溶液和發(fā)酵殘渣； (4)發(fā)酵殘渣中加入萃取劑，提取活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，特征在于所述步驟(1)的中藥為甘草，葛根，黃芪，山楂，決明子和麻黃中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，特征在于所述步驟(1)的液體培養(yǎng)基包括氮源和硫酸銅，其中氮源為尿素，酵母粉，蛋白胨，硫酸銨和硝酸鈉之一或任意組合，其濃度為I~15g/L ;液體培養(yǎng)基含有硫酸銅濃度為0.5~10g/L ;液體培養(yǎng)基的pH值為4~7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，特征在于所述步驟(2)的種子液為硬毛粗蓋孔菌在馬鈴薯培養(yǎng)基中液態(tài)發(fā)酵4~5天所得的發(fā)酵液液；種子液接種量為固態(tài)基質(zhì)總質(zhì)量的5%~10%,固態(tài)發(fā)酵條件為25°C~35°C，好氧發(fā)酵7~21天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，特征在于所述的步驟(3)加水提取漆酶為水與發(fā)酵基質(zhì)的質(zhì)量比為1:10~1:50,130rpm~200rpm震蕩提取2~4h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，特征在于所述步驟(4)的發(fā)酵殘渣中加入的萃取劑為甲醇，乙醇，丁醇，水和5%NaOH溶液之一，發(fā)酵殘渣與萃取劑的質(zhì)量固液比為1:2~1:10，提取溫度50°C~80°C，提取時間2~4h`。
【文檔編號】C12R1/645GK103820406SQ201410058416
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】陳洪章, 李冠華 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所