一種用于發(fā)酵高產(chǎn)核糖核酸的產(chǎn)朊假絲酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于發(fā)酵高產(chǎn)核糖核酸的產(chǎn)朊假絲酵母菌，其分類命名為產(chǎn)朊假絲酵母（Candida?utilis），菌株號(hào)為TKZY-05，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.7521，保藏日期為2013年04月26日。本發(fā)明還公開了上述產(chǎn)朊假絲酵母菌的應(yīng)用。本發(fā)明的產(chǎn)朊假絲酵母菌TKZY-05菌體RNA含量可達(dá)到菌體干重的17%，比出發(fā)菌株的RNA產(chǎn)量提高了10%。該菌株經(jīng)過10代以上傳代，生產(chǎn)核糖核酸的性能保持穩(wěn)定。
【專利說明】—種用于發(fā)酵高產(chǎn)核糖核酸的產(chǎn)朊假絲酵母菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種高產(chǎn)核糖核酸的產(chǎn)朊假絲酵母菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]核糖核酸(Ribonucleic acid,簡(jiǎn)稱RNA)是一類極為重要的生物大分子物質(zhì),屬于兩大類核酸之一。RNA及其降解物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、飼料工業(yè)等行業(yè)都有著重要的作用。近些年研究表明，RNA的降解產(chǎn)物核苷酸能提高植物根系吸收能力、促進(jìn)代謝、加強(qiáng)CO2的固定能力、促進(jìn)光合作用，其可提高種子內(nèi)含物的轉(zhuǎn)化效率、出苗率以及促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)。適期施用核苷酸，能使農(nóng)作物早熟、優(yōu)質(zhì)、增產(chǎn)，因此核苷酸可作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑用于農(nóng)作物的生產(chǎn)。由于核苷酸可提高動(dòng)物對(duì)細(xì)菌、真菌感染的抵抗力、增加免疫力等作用，在水產(chǎn)和畜牧生產(chǎn)中核苷酸可明顯提高飼料利用率，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和改善肉質(zhì)的明顯作用。核苷酸在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和飼料添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用將是一個(gè)嶄新的巨大的市場(chǎng)，具有廣闊的應(yīng)用。
[0003]目前，工業(yè)上都是通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)RNA。20世紀(jì)60年代，日本開始研究通過培養(yǎng)富含RNA的酵母來生產(chǎn)RNA，經(jīng)過不斷改進(jìn)培養(yǎng)方法，目前酵母發(fā)酵生產(chǎn)RNA的工藝已相當(dāng)成熟。盛建國(guó)等(食品工業(yè)科技，2007，28 (I) =140-142)分別以原糖液、糖化液和廢糖蜜作為碳源培養(yǎng)熱帶假絲酵母K-79株，發(fā)現(xiàn)以原糖液為碳源時(shí)RNA含量最高為8.6%。在一些發(fā)酵液和其他生產(chǎn)廢液、廢渣中通常有一些富含RNA的菌體，如從啤酒酵母和味精生產(chǎn)廢液中的菌體中可提取RNA產(chǎn)品。
[0004]離子注入技術(shù)作為一種生物品種改良的新技術(shù)已在誘變育種、植物轉(zhuǎn)基因、生命起源和進(jìn)化以及環(huán)境輻射與人類健康等方面取得了一些重要研究成果。其中，在微生物誘變育種的研究中，離子注入已廣泛用于對(duì)微生物菌種的誘變育種，并取得了良好效果。
[0005]本發(fā)明擬通過離子束誘變技術(shù)對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母菌株進(jìn)行篩選，以得到傳代穩(wěn)定，高含核糖核酸的菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株高產(chǎn)核糖核酸的產(chǎn)朊假絲酵母菌。
[0007]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述產(chǎn)朊假絲酵母菌的應(yīng)用。
[0008]為解決上述 技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0009]一種用于發(fā)酵高產(chǎn)核糖核酸的產(chǎn)朊假絲酵母菌，其分類命名為產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis),菌株號(hào)為TKZY-05,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7521，保藏日期為2013年04月26日。該菌株是通過對(duì)土壤篩選到的產(chǎn)朊假絲酵母菌進(jìn)行低能離子束注入，然后將誘變后的菌株轉(zhuǎn)接于平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選單菌落轉(zhuǎn)接于麥芽汁斜面培養(yǎng)，后經(jīng)含碳源、氮源、無機(jī)鹽和水的液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)從而篩選出的核糖核酸高產(chǎn)菌。
[0010]CGMCC N0.7521菌株具有下述性質(zhì):
[0011]1、菌落形態(tài)學(xué)特征:
[0012]細(xì)胞呈圓形、橢圓形或臘腸形，大小為(3.5~4.5) μπιΧ (7~13)μπι。液體培養(yǎng)不產(chǎn)醭，管底有菌體沉淀。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，菌落乳白色，平滑，有或無光澤，邊緣整齊或菌絲狀。在加蓋片的玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上，形成原始假菌絲或不發(fā)達(dá)的假菌絲，或無假菌絲。
[0013]2、生理與生化特性:
[0014]菌株典型的兼性厭氧型單細(xì)胞真菌。在有氧的情況下，它進(jìn)行有氧呼吸，排出二氧化碳；而在缺氧的條件下，其進(jìn)行無氧呼吸，分解有機(jī)物(主要是葡萄糖)，產(chǎn)生酒精和水；該菌的最佳生長(zhǎng)溫度為32°C，最適pH值為4.0。
[0015]3、營(yíng)養(yǎng)特征:
[0016]該菌能利用葡萄糖、蔗糖、棉子糖，不發(fā)酵麥芽糖、半乳糖、乳糖和蜜二糖。不分解脂肪，能同化硝酸鹽。
[0017]上述產(chǎn)朊假絲酵母菌在發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸中的應(yīng)用。
[0018]具體應(yīng)用方法為，將產(chǎn)朊假絲酵母菌CGMCC N0.7521先經(jīng)種子培養(yǎng)，再經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，制備核糖核酸。
[0019]其中，所述的種子培養(yǎng)，液體種子培養(yǎng)基配方如下:溶劑水，碳源I~300g/L，氮源I~100g/L,無機(jī)鹽0.01~100g`/L。優(yōu)選的配方是,溶劑水,碳源10~60g/L,氮源10~30g/L,無機(jī)鹽0.1~10g/L。更優(yōu)選的配方是,溶劑水,碳源10~60g/L,氮源10~30g/L,無機(jī)鹽0.6~1.6g/L。
[0020]其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:溶劑水，碳源I~500g/L，氮源I~10g/L,磷酸0.1~5ml/L,無機(jī)鹽0.01~10g/L。優(yōu)選的配方是，溶劑水，碳源10~60g/L,氮源2~5g/L,磷酸0.66~2ml/L,無機(jī)鹽0.55~2.4g/L。更優(yōu)選的配方是,溶劑水，碳源30~47g/L,氮源3~4g/L,磷酸1.3~2ml/L,無機(jī)鹽I~1.5g/L。
[0021]其中，所述的碳源選自糖蜜、葡萄糖、甘油、麥芽糖和蔗糖中的任意一種或多種。
[0022]其中，所述的氮源選自蛋白胨、酵母膏、玉米漿、尿素和硫酸銨中的任意一種或多種。
[0023]其中，所述無機(jī)鹽選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、鹽酸鹽和硫酸鹽中的任意一種或多種。
[0024]其中，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為2.5~9.5。優(yōu)選的pH為4~6 ;進(jìn)一步優(yōu)選的pH為4~5。該pH調(diào)節(jié)可采用氨水進(jìn)行。
[0025]其中，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為29~40°C，優(yōu)選為30~33°C ;發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為12~20小時(shí)，優(yōu)選為16~18小時(shí)。
[0026]發(fā)酵培養(yǎng)前按照體積比為I~30:100，優(yōu)選為8~12:100的接種量接種。
[0027]本發(fā)明的有益效果包括:
[0028]1.與傳統(tǒng)的輻射法及化學(xué)誘變劑相比，離子束誘變具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定、易于獲得理想新品種等特點(diǎn)。
[0029]2.本發(fā)明的核糖核酸高產(chǎn)菌產(chǎn)朊假絲酵母菌TKZY-05 (CGMCC N0.7521)能夠利用多種碳源和氮源發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸，操作方便簡(jiǎn)單。具有高產(chǎn)性狀穩(wěn)定的特點(diǎn)，該菌株經(jīng)過10代以上傳代，生產(chǎn)核糖核酸的性能保持穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0030]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0031]實(shí)施例1:
[0032]以從實(shí)驗(yàn)室分離得到的產(chǎn)核糖核酸的菌株為出發(fā)菌株，將經(jīng)N+離子束誘變(低能離子注入機(jī)靶室內(nèi)真空度為2X10 —4，注入能量為50kev，劑量為5 X 1013ions.cm—2.s-1)后的孢子懸浮液經(jīng)無菌水稀釋100倍后，取0.1ml涂布于麥芽汁平板培養(yǎng)基上30°C下培養(yǎng)3天，從中挑選單菌落在麥芽汁斜面培養(yǎng)3天。轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(糖蜜 30g/L，硫酸銨 10g/L，酵母膏 20g/L，氯化鉀 1.5g/L，NaCl0.lg/L，ρΗ4.0)的 500mL 搖瓶中，于32°C下IlOrpm搖床培養(yǎng)24小時(shí)。再轉(zhuǎn)接IOmL于裝有IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(糖蜜45g/L，(NH4) 2S043g/L, H3PO40.7ml/L, MgSO40.5g/L，F(xiàn)eSO40.05g/L，用氨水將培養(yǎng)基 pH 調(diào)節(jié)為4.0)的500mL搖瓶中，于32°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)16小時(shí)。經(jīng)過初篩，得到100株比出發(fā)菌株產(chǎn)量高的突變株。用同樣的條件下進(jìn)行復(fù)篩，最終得到產(chǎn)量最高的菌株TKZY-05，菌體RNA含量可達(dá)到菌體干重的13.5%，比原始菌株的7%提高了 6.5%。 [0033]實(shí)施例2:
[0034]將菌株TKZY-05從麥芽汁斜面轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(糖蜜IOg/L，硫酸銨 5g/L，酵母膏 10g/L，氯化鉀 0.lg/L, NaCl0.5g/L，ρΗ4.0)的 500mL 搖瓶中，于33°C下IlOrpm搖床培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)接8mL于裝有IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(糖蜜50g/L，(NH4)2SO4L 5g/L, H3PO40.8ml/L,MgSO40.2g/L，F(xiàn)eS042.0g/L，用氨水將培養(yǎng)基 pH 調(diào)節(jié)為 5.0)的500mL搖瓶中，于30°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)16小時(shí)。菌體RNA含量可達(dá)到菌體干重的 17%。
[0035]實(shí)施例3:
[0036]將菌株TKZY-05從麥芽汁斜面轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖15g/L，硫酸銨 15g/L，玉米漿 30g/L，氯化鉀 6g/L，NaC18g/L, ρΗ6.0)的 500mL 搖瓶中，于 31°C下IlOrpm搖床培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)接IOmL于裝有IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(麥芽糖40g/L，(NH4) 2S043g/L, H3PO4ImVL, MgSO40.8g/L，F(xiàn)eSO4L 6g/L，用氨水將培養(yǎng)基 pH 調(diào)節(jié)為 5.0)的500mL搖瓶中，于32°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)17小時(shí)。菌體RNA含量可達(dá)到菌體干重的15%。
[0037]實(shí)施例4:
[0038]將菌株TKZY-05從麥芽汁斜面轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(甘油40g/L，硫酸銨 30g/L，尿素 20g/L，氯化鉀 10g/L, NaC15g/L, ρΗ4.0)的 500mL 搖瓶中，于 30°C下IlOrpm搖床培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)接12mL于裝有IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(蔗糖30g/L，(NH4) 2S044g/L，H3PO4L 5ml/L，MgSO4L 5g/L，F(xiàn)eSO40.8g/L，用氨水將培養(yǎng)基 pH 調(diào)節(jié)為 4.0)的500mL搖瓶中，于32°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)18小時(shí)。菌體RNA含量可達(dá)到菌體干重的 17.5%ο[0039]實(shí)施例5:
[0040]將菌株TKZY-05從麥芽汁斜面轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(麥芽糖40g/L，硫酸銨 30g/L，蛋白胨 30g/L,氯化鉀 10g/L, NaC15g/L, ρΗ6.0)的 500mL 搖瓶中，于33°C下IIOrpm搖床培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)接12mL于裝有IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖IOg/L，(NH4) 2S045g/L, H3P042ml/L, MgS042g/L, FeSO40.2g/L，用氨水將培養(yǎng)基 pH 調(diào)節(jié)為 5.0)的500mL搖瓶中，于33°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)18小時(shí)。菌體RNA含量可達(dá)到菌體干重的15%。
[0041]實(shí)施例6:
[0042]將菌株TKZY-05連續(xù)傳10代以上，在實(shí)施例2的培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)核糖核酸。結(jié)果表明(見表1，2和3)，連續(xù)10代以上遺傳培養(yǎng)，菌株TKZY-05生產(chǎn)核糖核酸的性能穩(wěn)定。
[0043]表1連續(xù)傳I~5代的菌株TKZY-05的生產(chǎn)核糖核酸性能
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種用于發(fā)酵高產(chǎn)核糖核酸的產(chǎn)朊假絲酵母菌，其分類命名為產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis),菌株號(hào)為TKZY-05,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7521，保藏日期為2013年04月26日。
2.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)朊假絲酵母菌在發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將產(chǎn)朊假絲酵母菌CGMCCN0.7521先經(jīng)種子培養(yǎng)，再經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，制備核糖核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)，其中，液體種子培養(yǎng)基配方如下:溶劑水，碳源I~300g/L,氮源I~100g/L,無機(jī)鹽0.01~100g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)，其中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:溶劑水，碳源I~500g/L,氮源I~10g/L,磷酸0.1~5ml/L,無機(jī)鹽0.01~10g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的碳源選自糖蜜、葡萄糖、甘油、麥芽糖和蔗糖中的任意一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的氮源選自蛋白胨、酵母膏、玉米漿、尿素和硫酸銨中的任意一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述無機(jī)鹽選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、鹽酸鹽和硫酸鹽中的任意一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為2.5~9.5。`
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為29~40°C，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為12~20小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N1/16GK103820338SQ201410058491
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】陳曉春, 黃小權(quán), 蔡家棟, 張磊, 盛兵, 湯亦文, 陳勇 申請(qǐng)人:南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責(zé)任公司