優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒orf2截短基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒ORF2截短基因，所述基因的核苷酸序列為SEQIDNO．1。所述基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。所述枯草芽孢桿菌為BS168或WB800。本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，通過將去除NLS片段并根據(jù)密碼子偏好性優(yōu)化后的截短基因，能夠成功的在枯草芽孢桿菌中得到表達(dá)。
【專利說明】優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒(PCV)是一種小的、二十面體對稱、無囊膜、共價(jià)閉合、單股環(huán)狀DNA病毒，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原。根據(jù)PCV的致病性及全基因組序列，可分為兩個(gè)血清型:PCV1與PCV2。PCV2含有兩個(gè)主要開放閱讀框ORFl和0RF2。其中0RF2為702bp，編碼233個(gè)氨基酸，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，是構(gòu)建重組疫苗的首選基因。
[0003]PVC2的0RF2基因編碼Cap蛋白，為病毒的外殼蛋白。Cap蛋白是病毒的主要抗原。市場上已經(jīng)有以Cap蛋白為主要成份的疫苗產(chǎn)品。目前用做疫苗的Cap蛋白主要由昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。還未見微生物發(fā)酵生產(chǎn)的疫苗產(chǎn)品。[0004]大腸桿菌是得到廣泛應(yīng)用的蛋白生產(chǎn)菌種。0RF2外殼蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)已經(jīng)有不少研究報(bào)道。比如，孫繼國2009，查振林2005，周倫江2008，陳德坤2010，zhangGaiping2012。但所有上述報(bào)道均未能表達(dá)0RF2的全長基因序列，而是去除信號(hào)肽NLS的截短序列。目前認(rèn)為，其原因是0RF2外殼蛋白在N端的一段NLS序列，含有大腸的稀有密碼子。
[0005]在研究人員的努力下，已有少數(shù)研究組成功的在大腸桿菌中成功的表達(dá)了 0RF2基因。Celer2007報(bào)道，成功的在大腸桿菌的特殊菌種BL21-C0D0N-PLUS中表達(dá)了 0RF2全長基因序列。其成功在于運(yùn)用了特殊的菌種，這種菌種被插入了多個(gè)野生型大腸桿菌不具備的稀有密碼子基因。另一個(gè)技術(shù)路徑是通過改變原0RF2基因的密碼子使用方法，得到優(yōu)化的適于在大腸桿菌中表達(dá)的基因。Bumba2009首先報(bào)道了一個(gè)優(yōu)化的序列(GenbankEU376523)，使得0RF2蛋白在大腸桿菌BL21中獲得了 10mg/L的表達(dá)量。Huang2012等人又報(bào)道了一個(gè)優(yōu)化的序列(Genbank AY885225)，同樣獲得了全長蛋白的成功表達(dá)。這兩個(gè)序列是目前已知的兩個(gè)優(yōu)化的0RF2-NLS序列。
[0006]枯草芽孢桿菌作為很有吸引力的外源基因表達(dá)的宿主，是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和分泌外源蛋白較理想的宿主。國內(nèi)外在開發(fā)和使用枯草芽孢桿菌作為克隆和表達(dá)系統(tǒng)方面做了許多研究，但是到目前為止尚未有枯草芽孢桿菌表達(dá)PCV2-0RF2基因序列的的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的為提供能夠在枯草芽孢桿菌中成功得到表達(dá)的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
[0010]所述基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。[0011]所述枯草芽孢桿菌為BS168或WB800。
[0012]本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，通過將去除NLS片段并根據(jù)密碼子偏好性優(yōu)化后的截短基因，能夠成功的在枯草芽孢桿菌中得到表達(dá)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]下面將結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0014]圖1為本發(fā)明優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因的表達(dá)載體質(zhì)粒PHT43-0RF2雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的圖譜(1.PHT43-0RF2經(jīng)雙酶切的電泳條帶；2.PHT43-0RF2未酶切的電泳條帶；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0015]圖2為本發(fā)明優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因的表達(dá)質(zhì)粒PHT43-0RF2成功轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168后，提取表達(dá)菌株中質(zhì)粒經(jīng)BamHl和Smal雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的圖譜(1.BS168/PHT43-0RF2經(jīng)雙酶切的電泳條帶；2.BS168/PHT43-0RF2未酶切的電泳條帶；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0016]圖3為本發(fā)明優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因的表達(dá)質(zhì)粒PHT43-0RF2成功轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800后，提取表達(dá)菌株中質(zhì)粒經(jīng)BamHl和Smal雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的圖譜(1.WB800/PHT43-0RF2經(jīng)雙酶切的電泳條帶；2.WB800/PHT43-0RF2未酶切的電泳條帶；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0017]圖4為本發(fā)明優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因的表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白的ffestern-blot 分析結(jié)果(1.BS168/PHT43-0RF2 誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白；2.WB800/PHT43-0RF2誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白；3.B S168/PHT43-0RF2未誘導(dǎo)；4.WB800/PHT43-0RF2未誘導(dǎo))。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ IDN0.1。
[0019]為便于后續(xù)純化，在本發(fā)明的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因的3’末端引入6XHis標(biāo)簽后，再在其兩端分別引入BamHl和Smal的酶切位點(diǎn)送生物公司合成此序列。
[0020]所述基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。
[0021]所述枯草芽孢桿菌為BS168或WB800。
[0022]為了驗(yàn)證本發(fā)明的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因能夠在枯草芽孢桿菌中得到表達(dá)，本發(fā)明采用以下試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0023]膠回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖芯徸陨ど锕こ?上海)有限公司；BamHl、Smal、T4DNA Ligase、DL2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物、低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物均購自TaKaRa公司。
[0024]主要溶液和試劑的配制:
[0025]I)堿裂解法制備質(zhì)粒DNA所用溶液:
[0026]溶液1:50mM glucose, 25mM Tris-HCl (pH8.0)，IOmM EDTA (pH8.0)。
[0027]溶液II:0.2M NaOH, 1%SDS (m/v)(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
[0028]溶液III:3M KAC60.0mL，冰醋酸 11.5mL, H2O 定容至 100mL。
[0029]2)0.1M CaCl2:1.47g CaCl2 溶于 100ml 純水中，滅菌，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0030]3)枯草芽胞桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備用培養(yǎng)基[0031]IOX 最低鹽溶液=K2HPO4.3Η2091.7g, KH2P0430g, (NH4)2SO4IOg,檸檬酸鈉 5g，MgSO4.7H201g，在蒸餾水中依次溶解，定容至500mL。
[0032]GM I 溶液:1X 最低鹽溶液 95mL, 50%glucoselmL, 5%Casamino Acid0.4mL,10%Yeast extract ImL, 2mg/mL L_trp 溶液 2.5mL。
[0033]GM II 溶液:I X 最低鹽溶液 195mL, 50%glucose2mL, 5%Casamino Acid0.16mL,10%Yeast extract0.08mL,0.5M MgCl2ImL, 0.1M CaCl2ImL, 2mg/mL L_trp 溶液 lmL。
[0034]1.質(zhì)粒PHT43-0RF2的小量提取
[0035]I)取1.5mL菌液于離心管中，12000rpm離心2min,棄上清。
[0036]2)菌體沉淀重懸于100 μ L溶液I中，室溫下放置5-10min。
[0037]3)加入新配制的溶液II 200 μ L，蓋緊管口，快速溫和顛倒離心管數(shù)次，混勻，冰浴5min，使細(xì)胞膜裂解。
[0038]4)加入150 μ L預(yù)冷的溶液III,見白色絮狀沉淀,于冰上放置5min。
[0039]5) 12000rpm離心lOmin，上清液移入干凈離心管中，加入等體積(450 μ L)的酚/氯仿，振蕩混勻，12000rpm離心5min。
[0040]6)小心移出上清(約400 μ L)于一新微量離心管中，加入2倍體積(800 μ L)預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2_5min, 12000rpm離心lOmin。
[0041]7)棄上清,加入1ιΛ70%乙醇洗沉淀一次，12000rpm離心5min。
[0042]8)吸除上清液，室溫干燥，將沉淀質(zhì)粒PHT43-0RF2溶于20 μ LTE緩沖液中進(jìn)行保`存。
[0043]2.大腸桿菌感受態(tài)TOPlO細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
[0044]I)挑取TOPlO單菌落于LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。
[0045]2)第二天，按1:100轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD6tltl為0.3-0.5。
[0046]3)取 ImL 菌液，冰浴 lOmin, 12000rpm 離心 lmin。
[0047]4)棄上清，加入ImL0.1M的CaCl2,混勻，冰浴30min。
[0048]5) 12000rpm離心lmin,棄上清,加入100 μ L0.1M的CaCl2,混勻，即為大腸桿菌感受態(tài)TOPlO細(xì)胞。
[0049]6)適量DNA立即加入100 μ L制備好的大腸桿菌感受態(tài)TOPlO細(xì)胞中，冰浴30min。
[0050]7) 42°C熱擊45s，冰浴2min，再加入500 μ L不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Ih。
[0051]8)菌液涂布在含氨芐抗性的平板上，37°C培養(yǎng)過夜，次日檢查和驗(yàn)證大腸桿菌感受態(tài)TOP10細(xì)胞轉(zhuǎn)化子。
[0052]3.枯草芽孢桿菌spizizen法感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
[0053]I)芽孢桿菌劃線在LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜。
[0054]2)用接種針接一單菌落于5mL GM I溶液中，30°C，IOOrpm振蕩培養(yǎng)過夜。
[0055]3)次日取0.5mL菌液轉(zhuǎn)接到4.5mL GM I溶液中，37°C，200rpm培養(yǎng)3.5h。
[0056]4)取3mL上一步驟的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到27mL GM II溶液中，37°C IOOrpm繼續(xù)培養(yǎng)
1.5h, 5000g離心IOmin收集菌體。
[0057]5)用3mL原培養(yǎng)液上清輕輕懸浮菌體，懸浮后的菌體即為感受態(tài)細(xì)胞。
[0058]6)將感受態(tài)細(xì)胞分裝成每管0.5mL，每管菌液中加入適量DNA。于37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)60min后涂布到氯霉素抗性平板上。[0059]7)待菌液被吸收后，倒置平板，37°C過夜培養(yǎng)過夜，次日檢查和驗(yàn)證枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化子。
[0060]4.表達(dá)載體的構(gòu)建
[0061]優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因經(jīng)BamHl和Smal雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(條件為:1%瓊脂糖凝膠，電壓電泳90v，電泳時(shí)間為25min)，然后進(jìn)行切膠，并用膠回收試劑盒回收目的基因0RF2。
[0062]大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體PHT43經(jīng)BamHl和Smal雙酶切，切膠回收約8000bp左右的質(zhì)粒骨架。[0063]用T4DNA連接酶將0RF2與質(zhì)粒骨架連接起來，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，得到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒PHT43-0RF2。質(zhì)粒PHT43-0RF2經(jīng)BamHl和Smal雙酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳(條件為:1%瓊脂糖凝膠，電壓電泳90v，電泳時(shí)間為25min)進(jìn)行驗(yàn)證，由圖1中可以看出質(zhì)粒PHT43-0RF2質(zhì)粒雙酶切后在大約600bp位置有目標(biāo)條帶,說明大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體PHT43已經(jīng)成功連接上0RF2，送去invitrogen公司測序后,測序結(jié)果正確。
[0064]5.表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽抱桿菌BS168或WB800
[0065]驗(yàn)證正確的質(zhì)粒PHT43-0RF2，通過Sp i z i zen化學(xué)轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌BS168或WB800，構(gòu)建枯草芽孢桿菌工程菌BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2。分別提取質(zhì)粒BS168/PHT43-0RF2或質(zhì)粒WB800/PHT43-0RF2經(jīng)BamHl和Smal雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳(條件為:1%瓊脂糖凝膠，電壓電泳90v，電泳時(shí)間為25min)進(jìn)行驗(yàn)證，由圖2和圖3中可以看出雙酶切后在大約600bp位置有目標(biāo)條帶，說明質(zhì)粒BS168/PHT43-0RF2或質(zhì)粒WB800/PHT43-0RF2已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌BS168或WB800，送去invitrogen公司測序后，測序結(jié)果正確。
[0066]6.重組蛋白的表達(dá)
[0067]將枯草芽孢桿菌工程菌BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2以1%的接種量轉(zhuǎn)接表達(dá)菌株得重組蛋白BS168/PHT43-0RF2或重組蛋白WB800/PHT43-0RF2，當(dāng)培養(yǎng)OD6tltl至0.6時(shí)，進(jìn)行Western-blot分析，具體步驟如下，分別在重組蛋白BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2中加ImM ITPG誘導(dǎo)6h，將誘導(dǎo)后和作為對照未進(jìn)行誘導(dǎo)的陽性菌分別離心重懸于ddH20，以2:1加上樣處理緩沖液(2%SDS，0.1%溴酚藍(lán)10%甘油)混勻后，沸水煮沸l(wèi)Omin，離心去菌體，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，采用120v電壓，電泳時(shí)間為2h，割膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜后，加入5%脫脂牛奶10mL，于37°C封閉Ih ;加組氨酸標(biāo)簽一抗IOmL (1:2500稀釋)，于4°C孵育過夜(12h以上)；加山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶(HRP)抗體IOmL (1:2500稀釋)37°C作用lh，在ImL 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)緩沖液中顯色。從圖4可以看出陽性菌均沒有條帶，而BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2分別在在23.2kD左右有明顯蛋白條帶，與預(yù)期重組蛋白大小一致，從而說明本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒0RF2截?cái)嗷蚰軌虺晒Ρ磉_(dá)Cap蛋白。
【權(quán)利要求】
1.優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列為SEQIDN0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因，其特征在于:所述基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2截短基因，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌為BS168或WB800。
【文檔編號(hào)】C12N15/75GK103834670SQ201410061725
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】呂暾, 陳靈艷, 陳晟生, 林拱陽, 喬春曉, 俞建萍, 包松英 申請人:福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司, 福州大學(xué)