一種特異性識(shí)別并結(jié)合Aβ42寡聚體的單鏈抗體及單鏈抗體基因的制作方法
【專利摘要】一種特異性識(shí)別并結(jié)合Aβ42寡聚體的單鏈抗體及單鏈抗體基因，屬于基因工程抗體【技術(shù)領(lǐng)域】。具體是提供了一種包括重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)的人源性抗Aβ42寡聚體的單鏈抗體AS，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。同時(shí)提供了一種核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的編碼單鏈抗體AS的基因，以及該基因與pET-28a、pET-41b、pMA5、pPZW103等載體構(gòu)建的基因工程表達(dá)載體。該單鏈抗體能特異性識(shí)別并結(jié)合Aβ42寡聚體，降低Aβ42寡聚體的水平，有效抑制Aβ42寡聚體的細(xì)胞毒性，可在制備抗阿爾茨海默氏病的藥物中具有廣泛應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種特異性識(shí)別并結(jié)合A β 42寡聚體的單鏈抗體及單鏈抗體基因
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程抗體【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種特異性識(shí)別并結(jié)合β -淀粉樣蛋白(Αβ 42)寡聚體的單鏈抗體及編碼這種單鏈抗體的基因。
【背景技術(shù)】
[0002]阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,其病理特征是漸進(jìn)性的Aβ 42的聚集與沉積、神經(jīng)突觸丟失和神經(jīng)纖維纏結(jié)，臨床表現(xiàn)為記憶功能衰減及識(shí)別能力障礙，同時(shí)伴有各種神經(jīng)癥狀和行為障礙。對(duì)于AD的發(fā)病機(jī)理有多種觀點(diǎn)，其中普遍認(rèn)同的是A β 42毒性學(xué)說(shuō)。
[0003]現(xiàn)已證明，由Αβ 42單體聚集形成的Αβ 42寡聚體是引起AD的主要致病因子。然而，目前國(guó)際上試驗(yàn)的診斷或治療AD用抗體，大多是針對(duì)Αβ 42—級(jí)序列的，這些抗體與A β 42單體、寡聚體或纖維均能結(jié)合，而非特異地識(shí)別并結(jié)合A β 42寡聚體，在病理檢測(cè)及臨床診斷中無(wú)法特異地檢測(cè)出Αβ 42聚集體的水平，同時(shí)，這類抗體在對(duì)AD的治療中也易引起副作用。
[0004]有關(guān)AD的被動(dòng)免疫治療報(bào)道中，多數(shù)采用的是人源化的多克隆抗體或單克隆抗體，但這些抗體因分子大不易穿過(guò)血腦屏障或特異性差易引起副作用而限制了在臨床上的應(yīng)用。為克服這些限制，從構(gòu)建小分子人源性抗體或抗體片段出發(fā)，篩選特異性識(shí)別和結(jié)合A β 42寡聚體的單鏈抗體成為目前診斷或治療AD的熱點(diǎn)。
[0005]單鏈抗體(single chain Fv, scFv)是一種小分子的基因工程抗體,它是在DNA水平上利用基因工程方法將天然抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過(guò)一段人工合成的鏈接肽(Linker)連接而成的小分子重組抗體。與完整抗體分子相比，它具有以下特點(diǎn):含有完整的抗體可變區(qū)，具有較完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)；不含有抗體分子的Fe段，因而免疫原性弱，用于人體不易產(chǎn)生免疫反應(yīng)；分子量小，穿透力強(qiáng)，易穿過(guò)血腦屏障，適用于AD的診斷或治療；體內(nèi)循環(huán)半衰期短，易從血循環(huán)中排除；不需要進(jìn)行糖基化修飾即可形成有功能的抗體分子，所以利于進(jìn)行基因工程操作和可以利于原核表達(dá)系統(tǒng)大量生產(chǎn)。因此，單鏈抗體是目前報(bào)道最多、也最有發(fā)展前景的抗AD的基因工程抗體。
[0006]雖然目前國(guó)際上已有抗Αβ42寡聚體的單鏈抗體的報(bào)道(Fukuchi K, 2006,Biochem Bioph Res Co, 344，79-86 ;Yoshihara T 等，2008，J Biochem, 143，475-486 ;Zameer A 等，J Mol Biol,384,917-928 ;Robert R 等，2009，Protein Eng Des Sel.22，199-208)，但這些單鏈抗體對(duì)A β 42寡聚體的特異性不高，親和性也有限，而且未顯示出明顯的可誘導(dǎo)A β 42寡聚體解聚的功效。迄今為止，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有特異性結(jié)合A β 42寡聚體、并可有效誘導(dǎo)其解聚的單鏈抗體的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種特 異性識(shí)別并結(jié)合Αβ 42寡聚體的單鏈抗體以及編碼這種單鏈抗體的基因。
[0008]本發(fā)明解決了現(xiàn)有抗體無(wú)特異性地與包括Αβ 42單體在內(nèi)的所有Αβ 42形式均可結(jié)合的技術(shù)問(wèn)題，利用基因工程抗體技術(shù)成功篩選出特異性與Αβ 42寡聚體結(jié)合，而不與Αβ 42單體及纖維結(jié)合的單鏈抗體。本發(fā)明所述的單鏈抗體與A β 42寡聚體特異性結(jié)合的特性與A β 42的一級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)，而是基于A β 42寡聚體所特有的空間立體構(gòu)象，是構(gòu)象依賴型的單鏈抗體。
[0009]本發(fā)明所述的A β 42寡聚體是由2個(gè)到幾十個(gè)不等的A β 42單體聚集形成的聚集體，分子間主要以氫鍵和疏水鍵相結(jié)合，分子量從9kDa至IOOkDa不等。
[0010]本發(fā)明提供了一種包括重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)的人源性抗A β 42寡聚體的單鏈抗體AS，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其中VH具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，VL具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，AS的分子量約為31kDa。
[0011]本發(fā)明還提供了一種編碼前面所述的人源性抗Αβ 42寡聚體的單鏈抗體AS的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0012]進(jìn)一步,本發(fā)明所述的單鏈抗體AS能夠有效抑制Αβ 42單體的聚集,還能夠使Αβ 42寡聚體解聚，并能明顯降低A β 42寡聚體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性，在制備抗阿爾茨海默氏病的藥物中具有廣泛應(yīng)用。
[0013]再進(jìn)一步，本發(fā)明所述的編碼一種人源性抗Αβ 42寡聚體的單鏈抗體AS的基因可與pET-28a、pET-41b、pMA5或pPZW103構(gòu)建基因工程表達(dá)載體，該基因及該基因工程表達(dá)載體在制備抗阿爾茨海默氏病的藥物中具有廣泛應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明所述的單鏈抗體AS能夠特異性識(shí)別并結(jié)合A β 42寡聚體，作為檢測(cè)A β 42寡聚體的臨床診斷制劑和AD治療的免疫制劑具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1:pET41b_AS重組表達(dá)載體的測(cè)序譜圖；
[0016]圖2:純化的單鏈抗體AS的SDS-PAGE譜圖，其中M:蛋白質(zhì)Marker ；A:陰性對(duì)照；B:表達(dá)的AS ；C:純化的AS ；
[0017]圖3:單鏈抗體AS與不同形態(tài)A β 42識(shí)別的Dot-Blot分析譜圖；
[0018]圖4 =ELISA法測(cè)定AS與Αβ 42寡聚體親和性的曲線圖；
[0019]圖5:單鏈抗體AS與不同分子量Αβ 42識(shí)別的Western blot分析譜圖；
[0020]圖6 =ThT-F法分析單鏈抗體AS抑制A β 42聚集的譜圖，其中A圖為A β 42單體分析譜圖，B圖為A β 42寡聚體分析譜圖；
[0021]圖7 =MTT法測(cè)定單鏈抗體AS抑制A β 42細(xì)胞毒性的柱形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1A β 42寡 聚體和A β 42纖維的制備
[0023]Αβ 42單體(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)用冰預(yù)冷的六氟異丙醇(HFIP)溶解至濃度為lmg/mL,冰水浴超聲lOmin，真空干燥，_20°C凍存。使用時(shí)，先將A β 42用二甲基亞砜(DMSO)溶解至濃度為lmg/mL，再將Αβ42稀釋到濃度為10 μ M的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.4，50mM)中，終濃度為10 μ Μ，在37°C分別孵育12h形成A β 42寡聚體的聚集狀態(tài)以及孵育3d形成成熟纖維的聚集狀態(tài)。所有Αβ42聚集狀態(tài)均通過(guò)電鏡確認(rèn)。由于A β 42形成聚集體的不可逆性，Aβ 42的寡聚體及纖維的使用均為現(xiàn)用現(xiàn)制備，若短期使用則于_80°C儲(chǔ)存。
[0024]實(shí)施例2陽(yáng)性克隆的篩選
[0025](I)外周血淋巴細(xì)胞RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0026]外周血淋巴細(xì)胞分離提取:用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)抗凝管采集阿爾茨海默病人外周血血樣10mL，用無(wú)鈣、鎂離子的平衡鹽緩沖液(D’ Hanks)(購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)以1:1體積稀釋，以稀釋血樣與淋巴細(xì)胞分離液=2:1 (體積比)的比例加入聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自美國(guó)sigma公司)。室溫下，以2000rpm/min離心20min。離心后，吸取單個(gè)核細(xì)胞層。用D’Hanks洗漆細(xì)胞，1000rpm/min離心IOmin,獲得外周血淋巴細(xì)胞。
[0027]外周血淋巴細(xì)胞RNA提取:在IX IO7個(gè)外周血淋巴細(xì)胞中加入ImL苯酚-異硫氰酸胍總RNA抽提試劑(TriZoIl1-Reagent)(購(gòu)自Invitrogen公司),4°C靜置5min。加入200 μ I氯仿,上下顛倒至溶液出現(xiàn)衆(zhòng)白色。置于冰上5min。在4°C條件下，12000rpm/min離心15min。將上層水相移入另一離心管，加等體積異丙醇，冰上孵育lOmin。以4°C條件下，12000rpm/min,離心lOmin。棄上清,在沉淀(含RNA)中加lmL75% (體積分?jǐn)?shù))乙醇洗漆。在4°C條件下，12000rpm/min離心5min,得到RNA沉淀?？諝飧稍锖?用適量三輕甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液(TE)或無(wú)RNA酶的去離子水溶解備用。
[0028]反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下用上述提取的RNA合成cDNA的方法如下，取4μ1 RNA加入到0.1mL離心管中，加入寡聚胸腺嘧啶脫氧核苷酸引物(Oligo dTPrimer) I μ I和脫氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP) I μ I,最后以無(wú)RNA酶去離子水補(bǔ)充至10μ 1，65°C保溫5min后，于冰浴中迅速冷卻。在上述離心管中加入反轉(zhuǎn)錄緩沖液(PrimerScript II Buffer) 4 μ 1、RNA 酶抑制劑(RNase Inhibitor) 0.5 μ 1、反轉(zhuǎn)錄酶(PrimerScript II RTase) I μ I,最后以無(wú)RNA酶的去離子水補(bǔ)充到20 μ I,緩慢混勻。以420C 30-60min,95°C 5min的條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，冰上冷卻。
[0029](2 )編碼VH與VL的DNA片段擴(kuò)增
[0030]依據(jù)VH和VL的保守序列，設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增編碼VH和VL的DNA片段的引物，其
序列如下:
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種單鏈抗體AS，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.權(quán)利要求1所述的單鏈抗體AS在抑制Aβ 42單體聚集方面的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的單鏈抗體AS在使Aβ 42寡聚體解聚方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的單鏈抗體AS在降低Aβ 42寡聚體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性方面的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的單鏈抗體AS在制備抗阿爾茨海默氏病藥物中的應(yīng)用。
6.一種編碼權(quán)利要求1所述單鏈抗體AS的基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ IDN0.4所示。
7.一種基因工程表達(dá)載體，其特征在于:是由權(quán)利要求6所述的編碼單鏈抗體AS的基因與pET-28a、pET-41b、pMA5或pPZW103載體構(gòu)建的重組表達(dá)載體。
8.權(quán)利要求6所述的編碼單鏈抗體AS的基因在制備抗阿爾茨海默氏病藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述的基因工程表達(dá)載體在制備抗阿爾茨海默氏病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103804496SQ201410064049
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月22日
【發(fā)明者】張應(yīng)玖, 張媛, 懷陽(yáng)陽(yáng) 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)