一種快速提取干燥煙草葉片dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，包括取材、前處理、提取步驟，具體包括：將透氣自封袋編號，從煙草植株底部摘取幼嫩葉片，放入自封袋中；置入真空抽氣袋中，并加入硅膠放置陰涼處和/或放置干燥機/柜至含水率1~3%，封口，抽氣得到干燥煙草葉片；將得到的干燥煙草葉片研磨，加入DNA提取緩沖液和DDT，混勻，恒溫水浴，加入醋酸鈉溶液，震蕩混勻，離心后取上清液a，再次離心后取上清液b，加入等體積異丙醇，離心棄上清液c，沉淀中加入70%乙醇溶解并洗滌，離心棄上清液d，沉淀中加入無水乙醇洗滌，吹干，加重蒸水溶解，電泳檢測。本發(fā)明方法簡單、操作簡便快速且提高了樣本DNA提取效率。
【專利說明】—種快速提取干燥煙草葉片DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速提取干燥煙草葉片DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]分子生物學技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學、醫(yī)學、植物學、遺傳學和動物學等各個方面。DNA提取的質(zhì)量和產(chǎn)量是直接影響PCR擴增的關(guān)鍵步驟，自1985年P(guān)CR技術(shù)問世以來，這一技術(shù)已被應用到生命科學的各信息領(lǐng)域，因其敏感性高、特異性強、操作簡便、所需時間短等優(yōu)點已被廣泛用于多種檢測領(lǐng)域。
[0003]在DNA提取的過程中，提取樣本對最終結(jié)果起著非常重要的影響，并且樣本都存在無法長期保存，無法實現(xiàn)追溯。目前，對樣本的保存還沒有一種比較簡單快速且保存期長的取材方法，不能從根本上解決提取樣本的取材保存與追溯。因此，開發(fā)一種操作簡單快速并且能保存期長的取材方法以及以此對應的DNA提取方法是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種快速提取干燥煙草葉片DNA的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，包括取材、前處理、提取步驟，具體包括:
A、取材:將透氣自封袋編號，從煙草植株底部摘取2~3片幼嫩葉片，除去含葉脈3mm以上的部分，剩余3~7cm的葉子，放入已`編號的透氣自封袋中；
B、取材后處理:將裝有煙草葉片的透氣自封袋置入真空抽氣袋中，并加入硅膠放置陰涼處和/或放置干燥機/柜至含水率f 3%，封口，抽氣得到干燥煙草葉片；
C、提取前處理:將得到的干燥煙草葉片IOOmg于研缽中加入液氮研磨至粉末，放入滅菌小管中；
D、提取:在滅菌小管中加入DNA提取緩沖液600μ I和40 μ I的IM的DDT，混勻，置于6(T70°C水浴鍋中恒溫水浴l(T20min，加入5M/3M醋酸鈉溶液170 μ 1，震蕩混勻，離心后取上清液a，將上清液a再次離心后取上清液b，在上清液b中加入等體積異丙醇，離心棄上清液C，沉淀中加入150~250 μ I的70%乙醇充分溶解并洗滌I~3次，12000rpm離心5min棄上清液山沉淀中加入150-250 μ I無水乙醇洗滌，吹干，加重蒸水150-200 μ I溶解，取f 3 μ I進行電泳檢測。
[0006]本發(fā)明采用硅膠法取材，保證了樣品保存時間以便追溯，而且提供了對應的干燥煙草葉片DNA的快速提取方法，為深入研究奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明方法簡單、操作簡便快速且提高了樣本DNA提取效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1為本發(fā)明工作流程示意圖；
圖2為本發(fā)明自封袋結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本發(fā)明自封袋另一實施方式結(jié)構(gòu)示意圖；
圖中:1_自封袋，11-通氣孔，12-標簽槽；
圖4為本發(fā)明實施例1中DNA提取質(zhì)量檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0008]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0009]本發(fā)明所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，包括取材、前處理、提取步驟，具體包括:
A、取材:將透氣自封袋編號，從煙草植株底部摘取2~3片幼嫩葉片，除去含葉脈3mm以上的部分，剩余3~7cm的葉子，將2~3片葉子折成2~3截至長1.5^2.0cm,放入已編號的透氣自封袋中；
B、取材后處理:將裝有煙草葉片的透氣自封袋置入真空抽氣袋中，并加入硅膠放置陰涼處和/或放置干燥機/柜至含水率f 3%，封口，抽氣得到干燥煙草葉片；
C、提取前處理:將得到的干燥煙草葉片IOOmg于研缽中加入液氮研磨至粉末，放入滅菌小管中；
D、提取:在滅菌小管 中加入DNA提取緩沖液600μ I和40 μ I的IM的DDT，混勻，置于6(T70°C水浴鍋中恒溫水浴l(T20min，加入5M/3M醋酸鈉溶液170 μ 1，震蕩混勻，12000rpm離心IOmin后取上清液a，將上清液a再次12000rpm離心IOmin后取上清液b，在上清液b中加入等體積異丙醇，12000rpm離心20min后棄上清液c,沉淀中加入150~250μ I的70%乙醇充分溶解并洗滌廣3次，12000rpm離心5min棄上清液d，沉淀中加入150-250 μ I無水乙醇洗滌，吹干，加重蒸水150-200μ I溶解，取1~3μ I進行電泳檢測。
[0010]所述的透氣自封袋為透氣性材料制成。
[0011]所述的透氣性材料為合成纖維(尼龍等)、有空塑料、棉布、打孔牛皮紙或—木質(zhì)纖維中的一種。
[0012]所述的透氣性自封袋為塑料袋。
[0013]所述的自封袋兩面均設(shè)置有通氣孔11且交錯排列。
[0014]所述的通氣孔11的孔徑為0.5~1.5mm,孔間距為l~3mm。
[0015]所述的自封袋I 一面設(shè)置標簽槽12。
[0016]所述的自封袋I壁厚8(Tl20pcs。
[0017]所述的自封袋分格設(shè)置。
[0018]B步驟所述的陰涼處、干燥機/柜的濕度控制在f 5%。
[0019]C步驟所述的小管為2ml的Eppendorf管。
[0020]D步驟所述的DNA提取緩沖液由15~25 μ I的1Μ、ρΗ8.0的Tris_HCl、6~10 μ I的
0.5Μ、ρΗ8.0 的 EDTA、6~10y I 的 5Μ 的 NaCl、35~45y I 的 10%SDS (十二烷基苯磺酸鈉)、320^328 μ I蒸餾水組成；所述的5Μ/3Μ醋酸鈉溶液是由5Μ醋酸鉀溶液5(T70ml、冰乙酸10.5~12.5ml、蒸餾水 27.5~29.5ml 組成。
[0021]本發(fā)明所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，具體包括:
一、材料準備變色硅膠(1.5mm直徑顆粒)；
煙草樣品專用自封袋(150mmX 100mm, IOOpcs厚,分2面錯位打孔,孔直徑為1mm); 剪刀I把；
尼龍線(0.5mm粗)；
真空抽氣袋(22 X 18mm)；
電動抽氣泵I個。
[0022]二、取煙草葉片步驟
1、將50個煙草樣品專用自封袋疊成一堆并編號；
2、將50個I組的自封袋用尼龍線穿成環(huán)，掛在頸部，方便摘取葉片。
[0023]3、從煙草(開花前長勢良好)植株底部摘取2-3片幼嫩葉片，除去含葉脈較粗的部分，剩余長約5cm左右，將三片葉子折成三截，長約1.5-2.0cm，放入自封袋中。
[0024]4、當50個袋子裝完后，放入真空抽氣袋中，并加入50克硅膠，將口封好，當完成3組150個樣品時，用電動抽氣泵將真空袋里的氣體抽干，并防置陰涼處；
5、大規(guī)模取樣完畢后，可將抽氣袋口打開，放入真空干燥機或防置在干燥柜(HZDs-1OO，濕度控制范圍:1%~5%，北京明日百傲公司)待葉片完全干燥后，再封口抽氣，可保存I年備用。
[0025]三、干燥煙草葉片DNA快速提取方法:
Α、取植物葉片,放入2ml Eppendorf小管中加液氮速凍,研磨搗碎。
[0026]B、加入DNA提取液600 μ I和40ul IM DDT,放于冰上。
[0027]C、65°C 水浴 15min。
[0028]D、加入5m/3m醋酸鈉溶液170 μ I,震蕩混勻，12000rpm離心IOmin取上清。
[0029]E、上清12000rpm離心IOmin,再次取上清。
[0030]F、加入等體積異丙醇，12000rpm離心20min,棄上清。
[0031]6、75%乙醇20(^ 1，洗滌 2 次，12000rpm 離心 5min。
[0032]H、無水乙醇洗滌一遍，200 μ I。
[0033]超凈臺吹干，加ddH20共200 μ I溶解DNA，取2 μ I電泳檢測。
[0034]DNA 提取緩沖液(Extraction Buffer):
20 μ I IM Tris-HCI(ρΗ8.0)
8 μ I 0.5MEDTA (ρΗ8.0)
8 μ I 5Μ NaCI 40 μ I 10% SDS 324 μ I蒸餾水
5Μ / 3Μ醋酸鉀:5Μ醋酸鉀溶液60ml，冰乙酸11.5ml，蒸餾水28.5ml本發(fā)明采用硅膠法取材，保證了保存時間以便追溯，而且提供了對應的干燥煙草葉片DNA的快速提取方法，為深入研究奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明方法簡單、操作`簡便快速且提高了樣本DNA提取效率。
[0035]實施例1
A、取材:將透氣自封袋編號，從煙草植株底部摘取3片幼嫩葉片，除去含葉脈3mm以上的部分，剩余5cm的葉子,將3片葉子折成3截至長1.5cm,放入已編號的透氣自封袋中；B、取材后處理:將裝有煙草葉片的透氣自封袋置入真空抽氣袋中，并加入硅膠放置干燥機/柜(HZDs-100，濕度控制范圍:1%~5%，北京明日百傲公司)干燥至含水率f 3%，封口，抽氣得到干燥煙草葉片；
C、提取前處理:將得到的干燥煙草葉片IOOmg于研缽中加入液氮速凍，研磨至粉末，放入滅菌的2ml Eppendorf管中；
D、提取:在Eppendorf管中加入DNA提取緩沖液(20 μ I IM Tris-HCI (ρΗ8.0)、8 μ I
0.5MEDTA(pH8.0)、8 μ I 5Μ NaC1、40 μ I 10% SDS.324 μ I 蒸餾水)600 μ I 和 40 μ I的IM的DDT，混勻，置于6(T70°C水浴鍋中恒溫水浴15min，加入5M/3M醋酸鈉溶液170 μ 1，震蕩混勻，離心后取上清液a，將上清液a再次離心后取上清液b，在上清液b中加入等體積異丙醇，離心棄上清液C，沉淀中加入200 μ I的70%乙醇充分溶解并洗滌2次，12000rpm離心5min棄上清液d，沉淀中加入200 μ I無水乙醇洗漆，吹干，加重蒸水200 μ I溶解，取2 μ I進行電泳檢測，D NA提取質(zhì)量見附圖4。
【權(quán)利要求】
1.一種快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于包括取材、前處理、提取步驟，具體包括: A、取材:將透氣自封袋編號，從煙草植株底部摘取2~3片幼嫩葉片，除去含葉脈3mm以上的部分，剩余3~7cm的葉子，將2~3片葉子折成2~3截至長1.5^2.0cm,放入已編號的透氣自封袋中； B、取材后處理:將裝有煙草葉片的透氣自封袋置入真空抽氣袋中，并加入硅膠放置陰涼處和/或放置干燥機/柜至含水率f 3%，封口，抽氣得到干燥煙草葉片； C、提取前處理:將得到的干燥煙草葉片IOOmg于研缽中加入液氮研磨至粉末，放入滅菌小管中； D、提取:在滅菌小管中加入DNA提取緩沖液600μ I和40 μ I的IM的DDT，混勻，置于6(T70°C水浴鍋中恒溫水浴l(T20min，加入5M/3M醋酸鈉溶液170 μ 1，震蕩混勻，離心后取上清液a，將上清液a再次離心后取上清液b，在上清液b中加入等體積異丙醇，離心棄上清液C，沉淀中加入150~250 μ I的70%乙醇充分溶解并洗滌I~3次，12000rpm離心5min棄上清液山沉淀中加入150-250 μ I無水乙醇洗滌，吹干，加重蒸水150-200 μ I溶解，取f 3 μ I進行電泳檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于所述的透氣自封袋為透氣性材料制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于所述的透氣性材料為合成纖維、有空 塑料、棉布、打孔牛皮紙或木質(zhì)纖維中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于所述的透氣性自封袋為塑料袋。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于所述的自封袋兩面均設(shè)置有通氣孔(11)且交錯排列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于所述的通氣孔(11)的孔徑為0.5~1.5mm，孔間距為廣3mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于所述的自封袋分格設(shè)置。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于B步驟所述的陰涼處、干燥機/柜的濕度控制在f 5%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于C步驟所述的小管為2ml的Eppendorf管。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速提取干燥煙草葉片DNA的方法，其特征在于D步驟所述的 DNA 提取緩沖液由 15~25 μ I 的 1Μ、ρΗ8.0 的 Tris_HCl、6~10 μ I 的 0.5Μ、ρΗ8.0 的 EDTA,6~10 μ I的5Μ的NaCl、35~45 μ I的10%SDS、320~328 μ I蒸餾水組成；所述的5Μ/3Μ醋酸鈉溶液是由5Μ醋酸鉀溶液5(T70ml、冰乙酸10.5~12.5ml、蒸餾水27.5~29.5ml組成。
【文檔編號】C12N15/10GK103820432SQ201410064183
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】李文正, 王丙武, 高玉龍, 宋中邦, 張家瑞, 李永平 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院