結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥相關(guān)的新突變位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥相關(guān)的新突變位點(diǎn)及其應(yīng)用，該新突變位點(diǎn)位于標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組第1338631位，即基因間區(qū)Rv1194c-Rv1195的第47位堿基，發(fā)生的點(diǎn)突變?yōu)閴A基C突變?yōu)锳。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的新突變位點(diǎn)可作為檢測靶點(diǎn)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的檢測中，提高結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素的分子檢測水平，縮短患者的診斷時(shí)間，節(jié)約患者治療時(shí)間和費(fèi)用。本發(fā)明說明結(jié)核菌耐藥突變位點(diǎn)也可能發(fā)生在非編碼區(qū)，提示基因間區(qū)的堿基突變可能也與耐藥相關(guān)，也存在耐藥生物標(biāo)志物。本發(fā)明為找到新的、更有效的結(jié)核病耐藥分子標(biāo)識物提供了一種新思路。
【專利說明】結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥相關(guān)的新突變位點(diǎn)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌耐藥堿基突變位點(diǎn)的高通量篩選和驗(yàn)證，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變位點(diǎn)的篩查和驗(yàn)證。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結(jié)核病。到20世紀(jì)80年代后期，由于貧困、艾滋病、人口流動(dòng)和耐藥等因素，結(jié)核病發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)快速回升，成為與艾滋病并列的全球性危害最嚴(yán)重的傳染病。結(jié)核分枝桿菌耐藥情況嚴(yán)重，耐藥率高達(dá)46%，給結(jié)核病的預(yù)防和治療構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
[0003]抗結(jié)核藥物是結(jié)核病化學(xué)治療的基礎(chǔ)，而結(jié)核病的化學(xué)治療是人類控制結(jié)核病的主要手段。鏈霉素發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)40年代，是最早出現(xiàn)的有效抗結(jié)核的氨基苷類抗生素藥物，也是治療結(jié)核病的一線藥物之一。鏈霉素是一種氨基環(huán)醇糖苷類抗生素，主要作用于結(jié)核分枝桿菌的核糖體，與結(jié)核分枝桿菌的核糖體30S亞單位結(jié)合,誘導(dǎo)遺傳密碼的錯(cuò)配，破壞翻譯過程的正常進(jìn)行，合成結(jié)構(gòu)功能異常的蛋白從而發(fā)揮其殺菌作用。鏈霉素經(jīng)常單獨(dú)給藥，因此其耐藥性發(fā)展較快。結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素的主要分子機(jī)制是編碼小亞基的S12蛋白的r/zsZ基因和編碼16S核糖體RNA的rrs基因突變，從而抑制藥物結(jié)合核糖體的能力，造 成對鏈霉素耐藥。目前所知的結(jié)核分枝桿菌的耐鏈霉素藥的原因，主要是由基因rpsL第43位堿基發(fā)生A — G的突變。結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的檢測對于正確選擇有效的抗結(jié)核化療方案，有效控制耐藥性結(jié)核分枝桿菌的傳播以及控制結(jié)核病有極其重要的意義。
[0004]目前臨床上采用的耐藥檢測方法可分為表型檢測和基因型檢測兩類，并以前者為主。然而表型檢測因?yàn)楦鞣N原因，如耗時(shí)、設(shè)備昂貴、有放射性危害或干擾因素多等，難以形成快速高效的篩查手段。相對而言，基因檢測更為直接，目前已經(jīng)使用的基因分析方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(SSCP)，限制性片段長度多態(tài)性分析法(RFLP)，DNA測序法，線性探針雜交法，RNA/RNA錯(cuò)配分析法，以及DNA陣列(芯片)檢測等。這些方法主要利用基因rpsL第43位堿基的A — G突變的標(biāo)準(zhǔn)，檢測樣品結(jié)核分枝桿菌是否發(fā)生同樣的突變，從而快速判斷結(jié)核分枝桿菌是否具有鏈霉素耐藥性，但仍有許多耐鏈霉素的結(jié)核分枝桿菌不能被檢測出來，呈假陰性。
[0005]結(jié)核病耐藥率高是造成結(jié)核病疫情難以控制的重要原因，而傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)費(fèi)時(shí)長，影響患者診治，增加耐藥株擴(kuò)散機(jī)會，那么有效提高分子生物學(xué)方法快速鑒定結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢出率和準(zhǔn)確率具有重要意義。較高的結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的檢出率，對臨床耐藥性檢測和用藥具有指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥新突變位點(diǎn)。[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的再一目的在于提供一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測膜。
[0009]本發(fā)明的再一目的在于提供一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的快速篩查法。
[0010]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變位點(diǎn)，該突變位點(diǎn)位于標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組的第1338631位，即基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95的第47位，發(fā)生的點(diǎn)突變?yōu)閴A基C替換為A。
[0011]一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測試劑盒，該試劑盒含有用于檢測鏈霉素耐藥突變基因間區(qū)Rvl 194c-Rvl 195的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO:1或其堿基互補(bǔ)序列。
[0012]一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測膜，該膜含有用于檢測鏈霉素耐藥突變基因間區(qū)Rvl 194c-Rvl 195的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO:1或其堿基互補(bǔ)序列。
[0013]一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的快速篩查法，該方法利用PCR擴(kuò)增法檢測基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95第多少位的堿基。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的鏈霉素耐藥突變位點(diǎn)提高了結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素的分子檢測水平，陽性檢出率在原有的基礎(chǔ)上增加了 22.22%，能夠有效縮短患者的診斷時(shí)間，節(jié)約患者治療時(shí)間和費(fèi)用。
[0015]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌`耐藥突變位點(diǎn)不僅發(fā)生在編碼區(qū)，同時(shí)也可能發(fā)生在非編碼區(qū)，提示基因間區(qū)(IGR)的堿基突變可能也與耐藥相關(guān)，即IGR區(qū)也存在耐藥生物標(biāo)志物。該發(fā)明為找到新的、更有效的結(jié)核病耐藥分子標(biāo)識物提供了一種新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為45株STR耐藥的結(jié)核分枝桿菌的基因測序結(jié)果，A為基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95 (即圖中所示的PE13)第47位堿基的測序結(jié)果，圓圈中的堿基為發(fā)生了突變的堿基，即堿基C突變?yōu)锳，B、C分鎖為rpsL基因第43和88位堿基的測序結(jié)果，圓圈中的堿基為發(fā)生了突變的堿基，即堿基A突變?yōu)镚。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0018]一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變位點(diǎn)的篩選:
O預(yù)測與STR耐藥相關(guān)的堿基突變位點(diǎn):收集全國的結(jié)核分枝桿菌臨床菌株161例，進(jìn)行全基因組測序，通過生物信息學(xué)方法，預(yù)測與鏈霉素(STR)耐藥相關(guān)的堿基突變位點(diǎn)；
2)驗(yàn)證預(yù)測的與STR耐藥相關(guān)的堿基突變位點(diǎn):收集鏈霉素單耐藥臨床菌株45例，設(shè)計(jì)特異引物，對基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，對測序序列進(jìn)行比對分析，找到突變率最高的堿基突變位點(diǎn)為基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95第47位，突變率為
11.11% (5 株突變)；
3)對比分析基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95和基因r/zsZ中與STR耐藥相關(guān)的堿基突變率:對2)中45株鏈霉素單耐藥菌中的基因r/zsZ第43和88位(該兩個(gè)位點(diǎn)已被報(bào)道與與結(jié)核分枝桿菌的STR耐藥性相關(guān))也進(jìn)行測序，分析發(fā)現(xiàn)基因r/zsZ第43和88位的突變率分別為
11.11% (5株突變)和8.89% (4株突變);有2株STR耐藥菌株在基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95第47 l、rpsL第43位中均發(fā)生了堿基突變，有I株在基因間區(qū)Rvll94c_Rvll95第47位、rpsL第88位中均發(fā)生了堿基突變；結(jié)果說明基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95第47位的堿基突變(C突變?yōu)锳)可以作為結(jié)核分枝桿菌STR耐藥性檢測的靶點(diǎn)。
[0019]實(shí)施例1:
一、預(yù)測與STR耐藥相關(guān)的堿基突變位點(diǎn)
首先采用deep-sequencing技術(shù),對來自中國的161株結(jié)核桿菌進(jìn)行了全基因組測序，其中有44株敏感菌、94株多重耐藥菌(MDR)、23株廣泛耐藥菌(XDR)，并以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核桿菌株基因組序列為對照進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一批與耐藥性密切相關(guān)的新基因、基因間區(qū)(IGR)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，其中基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95的單堿基突變位點(diǎn)與鏈霉素(STR)耐藥性具有很高的相關(guān)性，其P值為0.002，如表1所示。
[0020]表1基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95的單堿基突變位點(diǎn)與不同耐藥性的相關(guān)性
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥堿基突變位點(diǎn)，其特征在于:該堿基突變位點(diǎn)位于標(biāo)準(zhǔn)株H37RV基因組的第1338631位，即基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95的第47位，發(fā)生的點(diǎn)突變?yōu)閴A基C突變?yōu)锳。
2.一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒含有用于檢測鏈霉素耐藥突變基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO:1或其堿基互補(bǔ)序列。
3.—種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測膜，其特征在于:該膜含有用于檢測鏈霉素耐藥突變基因間區(qū)Rvl 194c-Rvl 195的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO:I或其堿基互補(bǔ)序列。
4.一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的快速篩查法，其特征在于:擴(kuò)增基因間區(qū)Rvll94c-Rvll95 中的堿基序列，并檢測該基因間區(qū)第47位的是否發(fā)生堿基突變。
【文檔編號】C12N15/11GK103820439SQ201410064833
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】周琳, 鐘球, 畢利軍, 郭卉欣, 陳濤, 李海成, 陳亮, 陳瑜暉, 蔣莉, 舒楊, 王威 申請人:廣東省結(jié)核病控制中心