一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，該方法包括提取待鑒定藥材的葉綠體基因組DNA并純化，進(jìn)行測(cè)序與序列拼接，得到完整的葉綠體基因組序列，將該序列與太白貝母的葉綠體基因組序列進(jìn)行比對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)太白貝母進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的鑒定。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]太白貝母,又稱太貝、尖貝、秦貝，為百合科Liliaceae貝母屬Fritillaria L.植物太白貝母F.taipaiensis P.Y.Li的干燥鱗莖，主治肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、咯痰帶血，為2010版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄品種。太白貝母和瓦布貝母在藥典中均作為川貝母入藥，加之川貝母、梭砂貝母、甘肅貝母和暗紫貝母，川貝母基源植物達(dá)到6個(gè)，但其外形極為相似，僅有微小變異，傳統(tǒng)經(jīng)典分類(lèi)學(xué)主要依據(jù)花特征進(jìn)行鑒定，但由于花器官特征性差別小及過(guò)渡類(lèi)型較多，定性非定量的方法難以客觀的進(jìn)行區(qū)分。以川貝母入藥的源植物與貝母屬其它常見(jiàn)藥典載品種同樣難以區(qū)分，如平貝母、浙貝母和伊犁貝母等。生物條形碼對(duì)物種的鑒定科學(xué)、快速、有效，易于形成標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)貝母屬藥用植物的鑒別具有重要意義。
[0003]葉綠體基因作為DNA Barcoding標(biāo)準(zhǔn)序列的地位已經(jīng)得到公認(rèn)，但是在DNA條形碼鑒定研究工作中發(fā)現(xiàn)，盡管該方法具有操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)、適用于多個(gè)分類(lèi)階元等諸多優(yōu)點(diǎn)，但DNA條形碼長(zhǎng)度多介于300-700bp之間，有時(shí)包含序列的變異信息不充足，在區(qū)分和鑒定部分藥用植物(如貝母屬)種內(nèi)和種間樣品時(shí)存在困難；同時(shí)植物基因組的高變異性導(dǎo)致在植物中至今還未找到公認(rèn)的通用DNA條形碼序列，以上從理論上證明一些常用的DNA條形碼在通用性上存在局限性。葉綠體基因組在植物中廣泛存在，長(zhǎng)度達(dá)到120-160kb，與DNA條形碼相比，具有更好的通用性和更強(qiáng)的分辨力。但是由于測(cè)序模板提取還存在一定的困難，在沒(méi)有近緣物種的序列時(shí)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝仍然是復(fù)雜的。因此，現(xiàn)有技術(shù)中認(rèn)為采用葉綠體基因組進(jìn)行物種的鑒定目前還不是一個(gè)好的選擇。本發(fā)明通過(guò)對(duì)太白貝母葉綠體基因組的獲得及同屬近緣物種的分析，首次提出可以利用葉綠體全基因組對(duì)太白貝母進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是以葉綠體基因組全序列作為太白貝母的分子鑒定標(biāo)記，對(duì)太白貝母進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的鑒定。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0006]一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，該方法包括提取待鑒定藥材的葉綠體基因組DNA并純化，進(jìn)行測(cè)序與序列拼接，得到完整的葉綠體基因組序列，將該序列與太白貝母的葉綠體基因組序 列進(jìn)行比對(duì)，得到分析鑒定結(jié)果，其中，太白貝母葉綠體基因組序列的NCBI 序列號(hào)為 KC543997。
[0007]上述方法中，所述提取待鑒定藥材的葉綠體基因組DNA并純化的具體方法為:
[0008](I)取新鮮幼嫩葉片，4°C暗處理24h，洗凈，去葉脈，撕成碎片，加4°C預(yù)冷的緩沖液A置于勻漿器中，充分勻漿，然后過(guò)濾，收集濾液，棄渣；[0009](2)將濾液，于4°C，1500g，離心15min，棄上清；
[0010](3)用緩沖液I清洗沉淀；
[0011](4)用洗滌緩沖液懸浮沉淀，在一個(gè)新的離心管中加入30%的蔗糖溶液，將沉淀懸浮液覆蓋在30%的蔗糖溶液的表面，于4°C，2500g，離心15min，沉淀葉綠體；
[0012](5)沉淀重懸于洗滌緩沖液中，于4°C，100g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到新管并在380g離心10min ；
[0013](6)沉淀重懸于洗滌緩沖液中，將該溶液覆蓋于蔗糖梯度的頂部，于4°C，20000g離心70min ;其中，鹿糖梯度由7mL30%和16.5~18mL52%的鹿糖溶液組成；
[0014](7 )去掉上層，從52%和30%的蔗糖溶液的中間相，將葉綠體DNA收集到離心管中，然后加入洗滌緩沖液，于4°C，1500g離心15min沉淀葉綠體DNA ；
[0015](8)用緩沖液2清洗沉淀，于4°C，1500g，離心15min，取沉淀，加入緩沖液2和濃度為10mg/mL的蛋白酶K，室溫靜置2min，加入1/5體積的裂解液，顛倒混勻，然后在50°C保溫至少I(mǎi)h，冰上冷卻；
[0016](9)轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min ;其中，酚:氯仿:異戊醇的體積比為25:24:1 ；
[0017](10)上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入2/5體積的5mol ^r1NaCl, 2/5體積的預(yù)熱至650C的CTAB/NaCl，并68°C加熱15分鐘，加入等體積的氯仿:異戊醇，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min,取上清；其中，氯仿:異戍醇的體積比為24:1 ;
[0018](11)重復(fù)(10)`
[0019](12)加等體積的氯仿:異戍醇，顛倒混勻，靜置5min, 2600g室溫離心20min ;其中，氯仿:異戊醇的體積比為24:1 ;
[0020](13)取上清，加入0.1倍體積的3mol.L4NaAc和0.8倍體積的預(yù)冷異丙醇或是加入0.1倍體積的3mol.T1NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇，_20°C放置至少20min沉淀葉綠體 DNA ；
[0021](14)4°C,13500g離心20min，將沉淀用70%的乙醇室溫清洗兩次，13500g離心IOmin,風(fēng)干，用含有RNA酶的TE重懸，37°C保溫lh，得到葉綠體DNA ；
[0022]其中，所述緩沖液A 含有 50mM Tris,25mM EDTA, 1.25M NaCl，0.25M 抗壞血酸，1%PVP40,0.1%BSA,ImM DTT，ρΗ3.6 ；
[0023]所述緩沖液I 含有 1.25Μ NaCl，ρΗ8.0 的 50mM Tris-HCl, ρΗ8.0 的 7mMEDTA,5%PVP40,0.1%BSA,ImM DTT ；
[0024]所述洗滌緩沖液含有0.35M山梨醇，pH8.0的50mM Tris-HCl, pH8.0的25mMEDTA ；
[0025]所述緩沖液2 含有 ρΗ8.0 的 IOmM Tris-HCl, ρΗ8.0 的 5mM EDTA ；
[0026]所述裂解液含有20%十二烷基肌氨酸鈉，pH8.0的50mM Tris-HCl, pH8.0的25mMEDTA0
[0027]進(jìn)一步地，葉綠體基因組DNA測(cè)序與序列拼接的具體方法為:采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)Roche454GS FLX高通量測(cè)序儀完成葉綠體基因組的測(cè)序和序列拼接，獲得葉綠體全基因組序列。有時(shí)，拼接后的葉綠體全基因組序列上可能留有少量的空隙，根據(jù)空隙兩邊的序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用Sanger法測(cè)序，填充空隙后得到完整的葉綠體基因組序列。
[0028]本申請(qǐng)通過(guò)將待鑒定藥材的葉綠體基因組全序列與GenBank中的太白貝母中葉綠體全基因的序列進(jìn)行比對(duì)，更加準(zhǔn)確的鑒定藥材，若其基因序列與之相一致，即同源性達(dá)到98%以上，該樣品就是太白貝母，否則就不是該植物。
[0029]本申請(qǐng)還對(duì)太白貝母葉綠體全序列進(jìn)行基因組注釋(采用在線注釋軟件DOGMA (http: //dogma, ccbb.utexas.edu/)),并繪制了葉綠體全基因組物理圖譜(采用在線繪圖工具(http://wolfe.gen.tcd.1e/GenomeVx/))。
[0030]本發(fā)明的有益效果如下:
[0031 ] (I)與總DNA提取方法相比較而言，葉綠體DNA提取方法研究較少，且目前沒(méi)有廉價(jià)、高效的商品試劑盒。針對(duì)一個(gè)物種進(jìn)行優(yōu)化提取流程往往需要數(shù)天或數(shù)十天，阻礙了科研項(xiàng)目的推進(jìn)。應(yīng)用文獻(xiàn)資料的方法進(jìn)行提取葉綠體DNA往往需要30-50個(gè)小時(shí)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)常規(guī)DNA1-2個(gè)小時(shí)的提取時(shí)間，且產(chǎn)量不穩(wěn)定。本發(fā)明提供的葉綠體基因組的提取方法改良了 cpDNA提取流程，太白貝母cpDNA提取效率為206.0 μ g/100g，0D260/0D280為1.94。
[0032](2)本發(fā)明首次提出了葉綠體基因組更適合作為太白貝母和其它貝母屬植物物種的分子鑒定標(biāo)記。通過(guò)對(duì)待測(cè)樣品葉綠體全基因組全序列進(jìn)行測(cè)定，可以在分子水平對(duì)太白貝母進(jìn)行鑒別，還可以有效地區(qū)分太白貝母及同屬近緣植物。對(duì)于傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)中難以區(qū)分的類(lèi)群，采用葉綠體基因組序列分析的方法可以拋開(kāi)形態(tài)相似的假象，從基因水平上提供新的分類(lèi)依據(jù)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0034]圖1為太白貝母葉綠體全基因組物理圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0035]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0036]實(shí)驗(yàn)試劑與實(shí)驗(yàn)儀器
[0037](1)緩沖液 A (pH=3.6):50mM Tris,25mM EDTA, 1.25M NaCl，0.25M 抗壞血酸(VC)，1%PVP40 (聚乙稀吡咯烷酮)，0.1%BSA, ImM DTT ；
[0038](2)緩沖液 I:1.25M NaCl,50mM Tris-HCl (ρΗ8.0)，7mM EDTA (ρΗ8.0),5%PVP40,
0.1%BSA,ImM DTT ；
[0039](3)緩沖液 2:10mM Tris-HCl (pH8.0),5mM EDTA (pH8.0)；
[0040](4)洗滌緩沖液:0.35M 山梨醇，50mM Tris-HCl (ρΗ8.0)，25mMEDTA (ρΗ8.0)；
[0041](5) 52% 的蔗糖:52% 的蔗糖溶于 50mM 的 Tris-HCl (pH8.0),25mMEDTA (ρΗ8.0)；
[0042](6) 30% 的蔗糖:30% 的蔗糖溶于 50mM 的 Tris-HCl (ρΗ8.0)，25mMEDTA (ρΗ8.0)；
[0043](7)裂解液:20% 十二烷基肌氨酸鈉，50mM Tris-HCl (pH8.0),25mMEDTA (ρΗ8.0); [0044](8 ) CTAB/NaCl 溶液:10%CTAB，0.7M NaCl。
[0045](9)瓊脂糖:Biowest Agrose (Spain)。[0046](10)含有 RNA 酶的 TE:200uL TE 加入 luL50mg/mL 的 RNAase
[0047]其它試劑耗材:10ml注射器和平頭針、異丙醇、漂白劑、無(wú)水乙醇、70%乙醇，以上試劑組分均購(gòu)自北京碧橙藍(lán)生物科技有限責(zé)任公司？。
[0048]天根植物組織DNA提取試劑盒:目錄號(hào)DP305，天根生化科技(北京)有限公司(中國(guó))。
[0049]PCR材料:TaKaRa Ex Taq?,Code drrooia,寶生物工程(大連)有限公司(中國(guó))。
[0050]脫脂棉紗布:非滅菌，山東省曹縣華魯衛(wèi)生材料有限公司(中國(guó))；MiraCl0th:cat#475855, CalbiOChem?，Merck (德國(guó));
[0051]各種規(guī)格離心管:海門(mén)市三和新華玻璃實(shí)驗(yàn)儀器廠。
[0052]實(shí)驗(yàn)儀器
[0053]低溫高速離心機(jī):SIGMALaboratory Centrifuges3K3O (德國(guó))；
[0054]制冰機(jī):三洋(日本)；
[0055]臺(tái)式高速冷凍大容量離心機(jī)(水平轉(zhuǎn)子):Eppendorf Centrifuge5810R (德國(guó))；
[0056]高速勻漿機(jī):IKA?T18 basic MLTRA-TURRAX^ (德國(guó))；
[0057]超高速低溫離心機(jī):Beckm`anCOMLTER 0ptima?L-80XPMLtracentrifUge (美國(guó))；
[0058]凝膠成像儀:Biorad (美國(guó))；
[0059]電熱恒溫水浴鍋:DK_S24型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司(中國(guó))；
[0060]電子天平:METTLER TOLEDO PL203，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司(中國(guó))；
[0061]電泳儀:DYY_8C型，北京市六一儀器廠(中國(guó))；
[0062]微量分光光度計(jì):ThermoScientific NanoDrop2000 (美國(guó))；
[0063]PCR 儀:Applied Biosystems? GeneAmp? pcr System9700 (美國(guó));
[0064]Applied Biosystems2720Thermal Cycler (美國(guó))；
[0065]生物安全柜:蘇凈安泰(中國(guó))；
[0066]渦旋儀:IKA' MS3 (德國(guó));
[0067]高壓滅菌鍋:三洋(日本)。
[0068]實(shí)施例1太白貝母葉綠體基因組的獲得
[0069]( I)太白貝母葉綠體基因組DNA提取與純化
[0070]取太白貝母新鮮幼嫩葉片(太白貝母的新鮮葉片采自重慶市巫溪縣文峰店紅池壩(緯度:31.4°，經(jīng)度:109.6° )，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所鑒定為太白貝母Fritillaria.taipaiensis P.Y.Li,),采取改良的鹿糖密度梯度離心法分離提取并純化葉綠體基因組(cpDNA),步驟如下:
[0071]①取新鮮幼嫩葉片100g，4°C暗處理24h，洗凈，去葉脈，撕成lcm2左右大小的碎片，加500mL4°C預(yù)冷的緩沖液A置于勻漿器中，使葉片基本浸沒(méi)，充分勻漿。然后用4層紗布過(guò)濾I次，4層Miracloth濾布過(guò)濾I次,收集濾液,棄洛。
[0072]②將濾液分裝到50ml離心管中，4°C下1500g, 15min離心,棄上清。[0073]③在沉淀中加入20mL緩沖液1，用玻璃棒充分懸浮沉淀，4°C下1500g離心15min，棄上清；20mL緩沖液I重懸沉淀一次，離心，以徹底清洗沉淀。
[0074]④分別用20mL洗滌緩沖液懸浮各管沉淀。在一個(gè)新的50mL離心管中加入20mL30%的蔗糖溶液，將20mL的沉淀懸浮液小心覆蓋在蔗糖溶液的表面，于4°C，2500g水平離心15min,沉淀葉綠體。將離心后的沉淀合并,再次重懸于20mL洗滌緩沖液，并重復(fù)小心覆蓋在20mL30%的蔗糖溶液上，2500g水平離心10min。將沉淀合并，重懸于20mL洗滌緩沖液，再次小心覆蓋在20mL30%的蔗糖溶液上，2500g水平離心5min。
[0075]⑤最后的沉淀物重懸于40mL洗漆緩沖液，4°C, 100g離心5min。上清轉(zhuǎn)移到新管并在380g離心10min。如果使用了大量的起始材料,進(jìn)行一次850g的第三輪離心。如果仍然沒(méi)有離心下來(lái)，則可適當(dāng)加大轉(zhuǎn)數(shù)和延長(zhǎng)離心時(shí)間。
[0076]⑥將沉淀重懸于5mL洗滌緩沖液，將此葉綠體溶液小心覆蓋于蔗糖梯度的頂部(蔗糖梯度由7mL30%和16.5~18mL52%的蔗糖溶液組成，提前配置，4°C放置至少一個(gè)小時(shí))，立即上水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)，4°C下20000g離心lhlOmin。
[0077]⑦去掉上層，從52%和30%的蔗糖溶液的中間相，將葉綠體DNA收集到50mL的離心管中，然后用洗滌緩沖液稀釋到45mL，取1.2mL4°C保存?zhèn)溆谩?5mL管子在4°C，1500g離心15min沉淀葉綠體DNA。
[0078]⑧沉淀在IOmL的緩沖液2中重懸兩次(1500g，15min，4°C離心)，取沉淀，加入2mL緩沖液2和200uL蛋白酶K (10mg/mL)，室溫靜置2min，加入1/5體積(440uL)的裂解液，輕微顛倒管子混合數(shù)次，然后在50°C保溫至少I(mǎi)h (—般2~3h)，中間溫和震蕩混合，冰上冷卻。
[0079]⑨轉(zhuǎn)移到2mL滅菌離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1 )，顛倒混勻，靜置5min,2600g室溫離心20min。
[0080]⑩上清轉(zhuǎn)移到新2mL離心管中，加入2/5體積的5mol *^01,2/5體積的預(yù)熱至65°C的CTAB/NaCl，并68°C加熱15分鐘。加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min，取上清。
[0081]O重復(fù)⑩
[0082]⑩取上清，加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心 20min。
[0083]O取上清，加入0.1倍體積的3mol.L-1NaAc70.8倍體積的預(yù)冷異丙醇(或是0.1倍體積的3mol -T1NaAc, 2倍體積的無(wú)水乙醇)，沉淀葉綠體DNA (_20°C放置至少20min，一般過(guò)夜)。
[0084]4 °C, 13500g離心20min，將沉淀用70%的乙醇室溫清洗兩次，13500g離心lOmin，風(fēng)干，用含有RNA酶的TE重懸至30~IOOuL (—般50uL)，37°C保溫lh，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。所得到的葉綠體DNA可以在4°C短期保存，-20°C長(zhǎng)期保存。利用NanoDrop2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)cpDNA的濃度并用0.8%的瓊脂糖電泳檢測(cè)cpDNA的質(zhì)量。米用 invitrogen 生化 DNA 產(chǎn)物純化試劑盒(Purelink Genomic DNA Kit, K182001)對(duì)所提取的cpDNA進(jìn)一步純化以符合高通量測(cè)序要求。
[0085]經(jīng)改良的cpDNA提取流程，太白貝母cpDNA提取效率為206.0 μ g/100g, 260/280為 1.94。
[0086](2)測(cè)序和序列拼接
[0087]經(jīng)純化后的太白貝母cpDNA樣品采用第二代高通量測(cè)序平臺(tái)Roche454GS FLXTitanium進(jìn)行測(cè)序。先將雙鏈DNA打斷為SOObp的小片段，在片段兩端添加特異性銜接子，使之變性為單鏈連接到磁珠上，經(jīng)Emulsion PCR對(duì)樣本cpDNA進(jìn)行擴(kuò)增，富集到PicoTiterPlate 板,上機(jī)測(cè)序。具體方法可以參見(jiàn) Margulies M, Egholm M, Altman WE, etal.Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J].Nature, 2005，437:3767380 中的記載。
[0088](3)葉綠體序列中空隙的填充
[0089]測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)去掉低質(zhì)量序列后，采用454測(cè)序儀自帶Newbler軟件進(jìn)行denovo拼裝。采用454FLX測(cè)序平臺(tái)對(duì)太白貝母葉綠體基因組測(cè)序共獲得41296個(gè)CCS序列(14.5Mbp)，覆蓋度約76倍。拼接后獲得45條contig，最長(zhǎng)的為42，767bp。其中20條contig的覆蓋度較高(>=20倍)，總長(zhǎng)126.398bp。對(duì)這些contig進(jìn)一步拼接,并確定其位置關(guān)系，最終獲得完整太白貝母葉綠體基因組序列。
[0090](4)基因組序列 注釋和提交
[0091]采用在線注釋軟件DOGMA (http://dogma, ccbb.utexas.edu/)對(duì)太白貝母葉綠體全序列進(jìn)行基因組注釋。根據(jù)起始密碼子和終止密碼子序列手工調(diào)整DOGMA初步注釋的編碼蛋白基因范圍，將注釋的結(jié)果用NCBI網(wǎng)站指定的Seqin軟件提交太白貝母cpDNA序列數(shù)據(jù)和注釋信息，生成太白貝母序列的sqn文件。將太白貝母序列的Genbank格式文件用GenomeVx在線繪圖工具(http://wolfe.gen.tcd.1e/GenomeVx/)繪制太白貝母葉綠體全基因組物理圖譜(圖1)。
[0092]太白貝母葉綠體DNA(chloroplast DNA, cpDNA)為環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)，其大小為151693bp(NCBI序列號(hào)KC543997)。一對(duì)反向重復(fù)區(qū)(IRs)長(zhǎng)26335bp，大單拷貝區(qū)(LSC)和小單拷貝區(qū)(SSC)分別為81471bp、17552bp。太白貝母cpDNA編碼132個(gè)基因，包括86個(gè)編碼蛋白基因，8個(gè)rRNA基因和38個(gè)tRNA基因。蛋白編碼區(qū)占整個(gè)基因組的44.88%，rRNA占5.97%, tRNA占6.61%，基因間隔區(qū)和內(nèi)含子占42.54%。其中18個(gè)基因(6個(gè)tRNA和12個(gè)蛋白編碼基因)包含內(nèi)含子。太白貝母葉綠體基因組的GC含量為42.49%，其IR區(qū)GC含量(42.49%)高于LSC (34.82%)和SSC (30.36%)，IR區(qū)的高GC含量是由于IR區(qū)包含4個(gè) rRNA 基因:rrnl6> rrn23> rrn4.5、rrn5 (GC 含量 55.07%)。
[0093]實(shí)施例2基于葉綠體基因組全序列進(jìn)行太白貝母鑒定的可行性
[0094]( I)基于單基因序列的太白貝母和川貝母生物條形碼鑒定
[0095]根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法提取藥材的基因組DNA，利用葉綠體trnh-psbA序列進(jìn)行物種鑒定。trnh-psbA區(qū)擴(kuò)增使用的引物為:
[0096]上游引物:5，-GTTATGCATGACGTAATGCTC-3’
[0097]下游引物:5’ -CGCGCATGGTGATTCACAATCC-3，。
[0098]PCR擴(kuò)增條件:94 V預(yù)變性5min，94 V變性lmin，54 °C退火lmin，72 V延伸1.5min,30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。
[0099]測(cè)序后，川貝母trnH-psbA序列:
[0100]ACAATTTCCCTCTAGACCTAGCTGCTATTGAAGTTCCATCTACAAATGGATAAGACTTACATTCTGTCTTAGTGTATACGAATCCTTGATGGAGCAATATCTTTGTATCTTGCTAAAGATATTGCTCCATCAAGGATTTTTTTTTA
TTGAACGTGTCACAGGGGATTACTCCTTTATTACATTACATTTTTAAAATTGGCATTCTATGCCCAATATATCGATC
TAAGTATGAAGGTAAGAATAAATACAATAATGATGAATGGAAAAATAAAAAAGCTAAAATCCTTTAGCTAGATAAGG
GGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGT
[0101 ] 太白貝母trnH-psbA序列:
[0102]ACAATTTCCCTCTAGACCTAGCTGCTATTGAAGTTCCATCTACAAATGGATAAGACTTACATTCTGTCTTAGTGTATACGAATCCTTGATGGAGCAATATCTTTGTATCTTGCTAAAGATATTGCTCCATCAAGGATTTTTTTTTATTGAACGTGTCACAGGGGATTACTCCTTTATTACATTACATTTTTAAAATTGGCATTCTATGCCCAATATATCGATCTAAGTATGAAGGTAAGAATAAATACAATAATGATGAATGGAAAAATAAAAAAGCTAAAATCCTTTAGCTAGATAAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGT
[0103]從目前對(duì)trnH-psbA序列研究的結(jié)果看,該序列在對(duì)川貝母和太白貝母分析時(shí)，序列相似度為100%，提示我們兩個(gè)物種在進(jìn)化時(shí)親緣關(guān)系較近，對(duì)太白貝母采用單基因進(jìn)行分子鑒定存在較大困難。
[0104](2)基于葉綠體基因組全序列對(duì)太白貝母進(jìn)行鑒定
[0105]a高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)提取
[0106]根據(jù)實(shí)施例1中太白貝母的高通量測(cè)序及注釋?zhuān)玫?6個(gè)蛋白編碼序列?；谠?6個(gè)蛋白基因序列，獲得其它近緣物種(表1) 14個(gè)樣本的86個(gè)共有基因的序列。
[0107]b數(shù)據(jù)處理
[0108]對(duì)14個(gè)樣本的共有基因分別進(jìn)行序列比對(duì)，組成序列矩陣，進(jìn)行wilcoxon twosample test種間種內(nèi)的遺傳距離分析,應(yīng)用paup軟件并采用blast和distance的方法進(jìn)行不同分類(lèi)級(jí)別(genus, species, population)的比較分析。為驗(yàn)證葉綠體基因組序列對(duì)貝母屬近緣物種的鑒定能力，采用國(guó)際上認(rèn)可的最優(yōu)單基因組合與基因組序列進(jìn)行對(duì)比。
[0109]c結(jié)果分析
[0110]在葉綠體全基因組序列的基礎(chǔ)上，提取所有樣本的共有蛋白編碼基因序列進(jìn)行太白貝母和同屬近緣物種的核苷酸序列差異分析，以獲得的遺傳差異作為比較對(duì)象，開(kāi)展物種鑒定(結(jié)果見(jiàn)表2和表3)。
[0111]從種間種內(nèi)分析看，以葉綠體基因組作為鑒定標(biāo)記的遺傳距離是國(guó)際條形碼組織推薦序列matK+rbcL的2.15倍，葉綠體基因組平均種間差異是最小種間差異的1.46倍，matK+rbcL與平均距離幾乎一樣(1.05倍)?；蚪M水平，平均種間差異是種內(nèi)差異的16.2倍，matK+rbcL只有4倍，因此葉綠體基因組更適合作為分子鑒定標(biāo)記。
[0112]從不同分類(lèi)級(jí)別上看，葉綠體基因組無(wú)論是blast還是distance統(tǒng)計(jì)方法,鑒定效率均為100%，matK+rbcL為78.6，為進(jìn)一步驗(yàn)證葉綠體基因組的鑒定效力，在matK+rbcL的基礎(chǔ)上，我們?cè)黾恿斯J(rèn)的具有更大變異位點(diǎn)的非編碼區(qū)psbA-trnH，分析結(jié)果顯示兩種統(tǒng)計(jì)方法平均鑒定效率為85.8，增加不顯著，這與國(guó)際條形碼組織的結(jié)論相一致，即多基因組合不能明顯提高DNA條形碼的鑒定能力。在種下等級(jí)，葉綠體基因組的鑒定優(yōu)勢(shì)更加明顯，兩種方法的鑒定效率分別為92.9%和100%,平均比Matk+rbcL和Matk+rbcL+psbA-trnH分別高出50.05%和28.6%。因此，葉綠體基因組適合作為貝母屬近緣物種的鑒定標(biāo)記，可以作為太白貝母和其它貝母屬植物物種的分子條碼。
[0113]表1實(shí)驗(yàn)材料[0114]
【權(quán)利要求】
1.一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，該方法包括提取待鑒定藥材的葉綠體基因組DNA并純化，進(jìn)行測(cè)序與序列拼接，得到完整的葉綠體基因組序列，將該序列與太白貝母的葉綠體基因組序列進(jìn)行比對(duì)，得到分析鑒定結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，太白貝母葉綠體基因組序列的NCBI序列號(hào)為KC543997。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，提取待鑒定藥材的葉綠體基因組DNA并純化的具體方法為: (1)取新鮮幼嫩葉片，4°C暗處理24h，洗凈，去葉脈，撕成碎片，加4°C預(yù)冷的緩沖液A置于勻漿器中，充分勻漿，然后過(guò)濾，收集濾液，棄渣； (2)將濾液，于41:，1500g，離心15min，棄上清； (3)用緩沖液1清洗沉淀； (4)用洗滌緩沖液懸浮沉淀，在一個(gè)新的離心管中加入30%的蔗糖溶液，將沉淀懸浮液覆蓋在30%的蔗糖溶液的表面，于4°C，2500g,離心15min，沉淀葉綠體； (5)沉淀重懸于洗滌緩沖液中，于4°C，100g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到新管并在380g離心10min ； (6)沉淀重懸于洗滌緩沖液中，將該溶液覆蓋于蔗糖梯度的頂部，于4°C，20000g離心70min ;其中，蔗糖梯度由7mL30%和16.5~18mL52%的蔗糖溶液組成； (7)去掉上層，從52%和30%的蔗糖溶液的中間相，將葉綠體DNA收集到離心管中，然后加入洗滌緩沖液，于4°C，1500g離心15min沉淀葉綠體DNA ； (8)用緩沖液2清洗沉淀，于4°C，1500g，離心15min，取沉淀，加入緩沖液2和濃度為10mg/mL的蛋白酶K，室溫靜置2min，加入1/5體積的裂解液，顛倒混勻，然后在50°C保溫至少I(mǎi)h，冰上冷卻； (9)轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min ;其中，酹:氯仿:異戍醇的體積比為25:24:1 ； (10)上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入2/5體積的5mol.^01,2/5體積的預(yù)熱至650C的CTAB/NaCl，并68°C加熱.15分鐘，加入等體積的氯仿:異戊醇，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min,取上清；其中，氯仿:異戍醇的體積比為24:1 ; (11)重復(fù)(10) (12)加等體積的氯仿:異戍醇,顛倒混勻，靜置5min,2600g室溫離心20min ;其中，氯仿:異戊醇的體積比為24:1 ; (13)取上清，加入0.1倍體積的3mol.T1NaAc和0.8倍體積的預(yù)冷異丙醇或是加入0.1倍體積的3mol.L-1NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇，-20°C放置至少20min沉淀葉綠體DNA ； (14)4°C,13500g離心20min，將沉淀用70%的乙醇室溫清洗兩次，13500g離心10min，風(fēng)干，用含有RNA酶的TE重懸，37°C保溫lh，得到葉綠體DNA ； 其中，所述緩沖液A含有50mM Tris, 25mM EDTA, 1.25M NaCl,0.25M抗壞血酸，1%PVP40，0.1%BSA,1mM DTT，ρΗ3.6 ；
所述緩沖液 1 含有 1.25Μ NaCl,ρΗ8.0 的 50mM Tris_HCl，pH8.0 的 7mMEDTA, 5%PVP40,0.1%BSA,ImM DTT ； 所述洗滌緩沖液含有0.35M山梨醇，pH8.0的50mM Tris-HCl，pH8.0的25mM EDTA ；所述緩沖液 2 含有 pH8.0 的 IOmM Tris-HCl，pH8.0 的 5mM EDTA ； 所述裂解液含有20%十二烷基肌氨酸鈉，pH8.0的50mM Tris-HCl，pH8.0的25mM EDTA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，葉綠體基因組DNA測(cè)序與序列拼接是采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，所述第二代高通量測(cè)序技術(shù)是通過(guò)Roche454GS FL`X高通量測(cè)序儀完成。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103849687SQ201410064966
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】盧其福, 陳士林, 黃喜梅, 李西文, 劉薇, 黃林芳, 高麗, 周立 申請(qǐng)人:廣州白云山潘高壽藥業(yè)股份有限公司