支鏈α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的制造方法以及用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供支鏈α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的制造方法以及用途。所述支鏈α-葡聚糖以葡萄糖為構(gòu)成糖，其特征在于，在甲基化分析中，具有下述特征：(1)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙?；咸烟谴贾仍?:0.6～1:4的范圍；(2)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙?；咸烟谴嫉目傆?jì)占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；(3)2,4,6-三甲基-1,3,5-三乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5%以上且小于10%；及(4)2,4-二甲基-1,3,5,6-四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5%以上。
【專(zhuān)利說(shuō)明】支鏈α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的制造方法以及用途
[0001]
[0002]本案是申請(qǐng)日為2008年4月23日，申請(qǐng)?zhí)枮?00880017583.1，發(fā)明名稱(chēng)為“支鏈α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的制造方法以及用途”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及一種支鏈α -葡聚糖及生成其的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的制造方法以及用途，詳細(xì)來(lái)講，涉及一種支鏈α-葡聚糖及具有通過(guò)與麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖作用并進(jìn)行α-葡糖基轉(zhuǎn)移而生成該支鏈α-葡聚糖的作用的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的制造方法、以及含有該支鏈α -葡聚糖的組合物及其用途，所述支鏈α -葡聚糖以葡萄糖為構(gòu)成糖，其特征在于，在甲基化分析中:
[0004](1)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙?；咸烟谴己?，3，4_三甲基_1，5，6_三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6~1:4的范圍；
[0005](2)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6-三乙?；咸烟谴嫉目傆?jì)占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；
[0006](3) 2，4，6-三甲基-1，3，5_三乙酰基葡萄糖醇為部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10% ;及
[0007](4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5%以上。`【背景技術(shù)】
[0008]所謂食物纖維，本來(lái)是指動(dòng)物難以消化的纖維素、木質(zhì)素、半纖維素、果膠等植物細(xì)胞成分，但是，廣義來(lái)講，也包含不能通過(guò)淀粉酶消化的難消化性的水溶性多糖類(lèi)，它們被稱(chēng)為水溶性食物纖維。近年來(lái)，食物纖維在作為其原本的功能的整腸作用、血中膽固醇降低作用、血糖調(diào)節(jié)作用等的基礎(chǔ)上，作為改善腸內(nèi)菌叢的益生菌的功能也開(kāi)始備受矚目。但是，食物纖維與鈣被并列認(rèn)為是日本人的飲食生活中所缺少的營(yíng)養(yǎng)素，現(xiàn)在的日本人的平均食物纖維攝取量相對(duì)平成6年提出的第5次修訂“日本人的營(yíng)養(yǎng)需要量”中所示的食物纖維的目標(biāo)攝取量20~25g/日，僅達(dá)到目標(biāo)的5~8成(參照例如《食物纖維的市場(chǎng)動(dòng)向的調(diào)查》、“食品與開(kāi)發(fā)”、第34卷、第2號(hào)、第24~27頁(yè)(1999年)等)。在這種狀況下，提出了各種可以用作各種飲食品的原料、且作為水溶性食物纖維有用的難消化性的多糖類(lèi)。
[0009]例如，作為水溶性食物纖維，市場(chǎng)上流通有難消化淀粉(濕熱處理高直鏈淀粉玉米)、瓜爾膠分解物、葡甘露聚糖、低分子海藻酸等以存在于自然界的多糖為原料的水溶性食物纖維。但是，這些水溶性食物纖維均具有粘性高、添加于食品時(shí)有損味道、食感等缺點(diǎn)，因此，其利用只局限于一部分。另一方面，作為低粘度的水溶性食物纖維，在食品領(lǐng)域中廣泛利用聚葡萄糖(美國(guó)輝瑞公司開(kāi)發(fā))或難消化性糊精。已知，聚葡萄糖是將葡萄糖和山梨糖醇及檸檬酸在高真空下進(jìn)行加熱、通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使其聚合而得到的合成多糖，葡萄糖在1，2、1，3、1，4、1，6、1，2，6、1，4，6位等具有糖苷鍵合成的支鏈。另外，難消化性糊精是在通過(guò)化學(xué)反應(yīng)分解淀粉的同時(shí)使轉(zhuǎn)移或逆合成反應(yīng)發(fā)生，通過(guò)導(dǎo)入淀粉本來(lái)不具有的1，2、1，3、1，2，4、1，3，4的各糖苷鍵而降低消化性的合成多糖。該難消化性糊精如下操作進(jìn)行制造，即，在淀粉中添加少量的鹽酸，將以粉末狀態(tài)進(jìn)行加熱而得到的焙燒糊精溶解于水，添加α-淀粉酶進(jìn)行水解，對(duì)由此得到的低粘度溶液進(jìn)行精制、凝縮、噴霧干燥。也有為了進(jìn)一步降低消化性而在難消化性糊精中添加葡萄糖淀粉酶，使可消化部分分解至成為葡萄糖，分離除去葡萄糖，同樣地進(jìn)行精制、噴霧干燥而制得的制品。但是，難消化性糊精的來(lái)自原料淀粉的收率低，并且容易著色，在工業(yè)生產(chǎn)方面具有很大缺點(diǎn)。一般認(rèn)為，被導(dǎo)入這些聚葡萄糖或難消化性糊精中的新糖苷鍵同時(shí)含有α-端基及β-端基這雙種端基差向異構(gòu)體型，而且，還原末端葡萄糖殘基部分地變化為1，6-脫水葡萄糖(參照例如《低分子水溶性食物纖維》、食品成分系列“食物纖維的科學(xué)”、第116頁(yè)~131頁(yè)、朝倉(cāng)書(shū)店(1997年)
坐')
寸/ ο
[0010]作為葡聚糖中的葡萄糖的鍵合方式的糖苷鍵(以下，在本說(shuō)明書(shū)中將“糖苷鍵”簡(jiǎn)稱(chēng)為“鍵”。)中，由于α-1，6鍵與α-1，4鍵相比，通過(guò)淀粉酶難以使其分解，因此，含有較多α-1，6鍵的葡聚糖也可以期待用作水溶性食物纖維用途。例如，利用來(lái)自屬于乳酸菌的腸膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)的葡聚糖鹿糖酶(EC2.4.1.5)以鹿糖為原料制造的葡聚糖是葡萄糖主要以α-1，6鍵聚合的葡聚糖，有時(shí)也具有α-1，2鍵合及α _1，3鍵合的支鏈。使用來(lái)自腸膜明串珠菌B-512F株的葡聚糖蔗糖酶時(shí)，期待得到的葡聚糖中的鍵的α-1，6鍵的含量也達(dá)到90%以上，為難消化性。但是，葡聚糖因來(lái)自蔗糖的收率低，并且粘性高，所以精制操作繁瑣，成本升高，因此，幾乎沒(méi)有進(jìn)行作為水溶性食物纖維使用的嘗試。
`[0011]另外，也進(jìn)行了通過(guò)使淀粉酶與廉價(jià)的淀粉作用，主要分解α-1，4鍵，從而提高α-1，6鍵的含量，制備水溶性食物纖維的嘗試。在日本特開(kāi)2001-11101號(hào)公報(bào)中，提出了如下方法:通過(guò)使α-淀粉酶和β_淀粉酶的混合物與淀粉液化液作用后，回收殘留的糊精部分，由此制備α -1, 6鍵與α -1, 4鍵的比提高至10~20%的支鏈糊精。但是，該支鏈糊精通過(guò)在保持淀粉本來(lái)具有的支鏈(α-1，6鍵)的同時(shí)除掉葡萄糖以α-1,4鍵連接的直鏈部分從而提高α -1, 6鍵的比例的方法來(lái)制造，因此，存在來(lái)自原料淀粉的收率低、不能期待大幅度的消化性降低等問(wèn)題。另外，作為與淀粉部分分解物(糊精)作用而導(dǎo)入α -1, 6鍵的酶，已知有糊精葡聚糖酶(EC2.1.1.2)(參照例如山本一也等、“生物科學(xué).生物技術(shù).生物化學(xué)”、第56卷、(1992年)、第169頁(yè)~173頁(yè))。雖然糊精葡聚糖酶是通過(guò)與淀粉部分分解物作用，主要催化α-1，6葡糖基鍵轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而生成葡聚糖結(jié)構(gòu)(葡萄糖以α-1，6鍵連接的結(jié)構(gòu))的酶，但是，目前已知的來(lái)自屬于醋酸菌的莢膜醋桿菌(Acetobacter capsulatum)的糊精葡聚糖酶存在α-1, 6鍵的的導(dǎo)入比例少(參照例如鈴木雅之等、“應(yīng)用糖質(zhì)科學(xué)(Journal of Applied Glycoscience) ”、第48卷、第2號(hào)、第143頁(yè)~151頁(yè)(2001年)等)、并且酶自身的穩(wěn)定性低等問(wèn)題，因此，未能應(yīng)用于實(shí)際中。在這種狀況下，即使在擴(kuò)展水溶性食物纖維的選擇范圍的意義上，也強(qiáng)烈期望提供新的難消化性葡聚糖及制造其的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的課題在于，提供一種作為水溶性食物纖維有用的葡聚糖及其制造方法以及其用途。
[0013]為了解決上述課題，本發(fā)明人等期待開(kāi)發(fā)出以麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖為原料(基質(zhì))，生成具有較多支鏈(在本說(shuō)明書(shū)中，所謂“支鏈”，是指在葡聚糖中的葡萄糖的鍵合方式中α-1，4鍵以外的葡萄糖的鍵合方式)的支鏈α-葡聚糖的酶，并對(duì)產(chǎn)生這種酶的微生物進(jìn)行了廣泛地探索。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從土壤中分離出的微生物、ΡΡ710株及ΡΡ349株在菌體外產(chǎn)生與麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α -1, 4葡聚糖作用并生成具有α-1, 4、α-1, 6、α-1，3、α-1，4，6及α-1, 3，6鍵的支鏈α-葡聚糖的新型α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。而且發(fā)現(xiàn)，該新型酶可以由淀粉部分分解物等α-1，4葡聚糖有效地生成支鏈α-葡聚糖，所述支鏈α-葡聚糖以葡萄糖為構(gòu)成糖，其特征在于，在甲基化分析中:
[0014](1)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙?；咸烟谴己?，3，4_三甲基_1，5，6_三乙?；咸烟谴贾仍?:0.6~1:4的范圍；
[0015](2)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙?；咸烟谴己?，3，4_三甲基_1，5，6-三乙?；咸烟谴嫉目傆?jì)占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；
[0016](3) 2，4，6-三甲基-1，3，5_三乙酰基葡萄糖醇為部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10% ;及
[0017](4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5%以上。
[0018]另外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在培養(yǎng)ΡΡ710株而得到的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液中預(yù)先混雜分解淀粉的淀粉酶，并使用該粗酶液、或?qū)⒎蛛x出的該淀粉酶與α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶并用，可以制造與單獨(dú)使用α-葡`糖基轉(zhuǎn)移酶的情況相比水溶性食物纖維含量提高了的支鏈α-葡聚糖。而且還發(fā)現(xiàn)，除了可以并用該淀粉酶之外，通過(guò)將公知的α-淀粉酶或淀粉去分支酶等與α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶并用，也可以調(diào)節(jié)得到的支鏈α-葡聚糖的重均分子量或水溶性食物纖維含量。此外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過(guò)這些方法而得到的支鏈α-葡聚糖與原料α-1,4葡聚糖相比，α-1,6鍵的比例大幅度地增大，而且具有α-1，3及α-1，3，6鍵，表現(xiàn)出顯著的難消化性，因此，作為水溶性食物纖維是有用的，也具有血糖上升抑制作用及生物體內(nèi)類(lèi)脂質(zhì)減少作用，從而完成了本發(fā)明。
[0019]即，本發(fā)明通過(guò)提供一種支鏈α-葡聚糖和生成該支鏈α-葡聚糖的新型葡糖基轉(zhuǎn)移酶、它們的制造方法以及用途來(lái)解決上述課題，所述支鏈α-葡聚糖以葡萄糖為構(gòu)成糖，其特征在于，在甲基化分析中:
[0020](1)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙?；咸烟谴己?，3，4_三甲基_1，5，6_三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6~1:4的范圍；
[0021](2)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙?；咸烟谴己?，3，4_三甲基_1，5，6_三乙酰基葡萄糖醇的總計(jì)占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；
[0022](3) 2，4，6-三甲基_1，3，5_三乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5%以上且低于10% ;及
[0023](4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5%以上。
[0024]根據(jù)本發(fā)明，可以收率良好且大量、廉價(jià)地制造并供給在以食品領(lǐng)域?yàn)橹鞯母鞣N領(lǐng)域中作為水溶性食物纖維是有用的、著色少的難消化性支鏈α -葡聚糖。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是將分別使用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710及來(lái)自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶樣品、由淀粉部分分解物制成的葡聚糖A及B的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖進(jìn)行比較的圖。
[0026]圖2是示意性地表示淀粉部分分解物及本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖的結(jié)構(gòu)的圖。
[0027]圖3是表示來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度的圖。
[0028]圖4是表示來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適pH的圖。
[0029]圖5是表示來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的溫度穩(wěn)定性的圖。
[0030]圖6是表示來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的pH穩(wěn)定性的圖。
[0031]圖7是表示來(lái)自球形節(jié)桿菌PP349的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度的圖。
[0032]圖8是表示來(lái)自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適pH的圖。
[0033]圖9是表示來(lái)自球形節(jié)桿菌PP349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的溫度穩(wěn)定性的圖。
[0034]圖10是表示來(lái)自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的pH穩(wěn)定性的圖。
[0035]圖11是表示來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的淀粉酶的最適溫度的圖。
[0036]圖12是表示來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的淀粉酶的最適pH的圖。
[0037]圖13是表示來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的淀粉酶的溫度穩(wěn)定性的圖。
[0038]圖14是表示來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的淀粉酶的pH穩(wěn)定性的圖。
[0039]圖15是將并用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和淀粉酶精制品而制成的支鏈α-葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖進(jìn)行比較的圖。
[0040]圖16是將并用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和異淀粉酶而制成的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖進(jìn)行比較的圖。
[0041]圖17是將并用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和α -淀粉酶而制成的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖進(jìn)行比較的圖。
[0042]圖18是將并用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和CGTase而制成的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖進(jìn)行比較的圖。
[0043]圖19是將并用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和異淀粉酶及CGTase而制成的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖進(jìn)行比較的圖。
[0044]符號(hào)的說(shuō)明
[0045]在圖1和圖15~19中，
[0046]1:相當(dāng)于分子量1000，000道爾頓的洗脫位置[0047]2:相當(dāng)于分子量100，000道爾頓的洗脫位置
[0048]3:相當(dāng)于分子量10，000道爾頓的洗脫位置
[0049]4:相當(dāng)于分子量1，000道爾頓的洗脫位置
[0050]5:相當(dāng)于分子量100道爾頓的洗脫位置
[0051]在圖1中，
[0052]a:作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0053]b:葡聚糖A的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0054]c:葡聚糖B的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0055]1:相當(dāng)于葡萄糖聚合度499的位置
[0056]2:相當(dāng)于葡萄糖聚合度6.3的位置
[0057]3:相當(dāng)于葡萄糖聚合度384的位置
[0058]4:相當(dāng)于葡萄糖聚合度22.2的位置
[0059]5:相當(dāng)于葡萄糖聚合度10.9的位置
[0060]6:相當(dāng)于葡萄糖聚合度I的位置
[0061]7:相當(dāng)于葡萄糖聚合度433的位置
[0062]8:相當(dāng)于葡萄糖聚合度22.8的位置
[0063]9:相當(dāng)于葡萄糖聚合度10.9的位置
[0064]10:相當(dāng)于葡萄糖聚合度I的位置
[0065]在圖2中，
[0066]1:淀粉部分分解物的示意圖
[0067]2:本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖的示意圖
[0068]a:非還原末端葡萄糖殘基
[0069]b: α -1，3鍵合的葡萄糖殘基
[0070]c: α-1, 4鍵合的葡萄糖殘基
[0071]d:a-l，6鍵合的葡萄糖殘基
[0072]e: a -1，3，6鍵合的葡萄糖殘基
[0073]f: α-1, 4, 6鍵合的葡萄糖殘基
[0074]斜向虛線(xiàn):a-1,3鍵合
[0075]橫向?qū)嵕€(xiàn):a-1，4鍵合
[0076]縱向?qū)嵕€(xiàn):a-1,6鍵合
[0077]在圖13中，
[0078].:不存在鈣離子的情況
[0079]O:存在ImM鈣離子的情況
[0080]在圖15中，
[0081]a:作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0082]b:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0.1單位淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0083]c:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0.2單位淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖[0084]d --每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0.5單位淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0085]e:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、I單位淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0086]在圖16中，
[0087]a:作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0088]b:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、50單位異淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0089]c:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、200單位異淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0090]d:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、500單位異淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0091]e:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1000單位異淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0092]在圖17中，
[0093]a:作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0094]b:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0.1單位α -淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC`的色譜圖
[0095]c:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0.2單位α -淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0096]d:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0.5單位α -淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0097]e:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1.0單位α -淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0098]在圖18中，
[0099]a:作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0100]b:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0.1單位CGTase作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0101]c:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0.2單位CGTase作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0102]d:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0.5單位CGTase作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0103]e:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1.0單位CGTase作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0104]在圖19中，
[0105]a:作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0106]b:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、50單位異淀粉酶、I單位CGTase作用而得到的支鏈α-葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0107]c:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、200單位異淀粉酶、I單位CGTase作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0108]d:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、500單位異淀粉酶、I單位CGTase作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖
[0109]e:每I克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1000單位異淀粉酶、I單位CGTase作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過(guò)濾HPLC的色譜圖【具體實(shí)施方式】
[0110]本發(fā)明中所說(shuō)的葡聚糖，是指以葡萄糖為構(gòu)成糖的葡萄糖聚合度為3以上的寡糖或多糖。本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖是以葡萄糖為構(gòu)成糖的α-葡聚糖，其特征在于，在甲基化分析中:
[0111](1)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6-三乙?；咸烟谴贾仍?:0.6~1:4的范圍；
[0112](2)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6_三乙酰基葡萄糖醇的總計(jì)占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；
[0113](3) 2，4，6-三甲基-1，3，5_三乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5%以上且低于10% ;及
[0114](4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5%以上。
[0115]本發(fā)明中所說(shuō)的甲基化分析，是通常公知的確定多糖或寡糖中構(gòu)成其的單糖的鍵合方式的方法。將甲基化分析用于葡聚糖中的葡萄糖的鍵合方式的分析時(shí)，首先，將構(gòu)成葡聚糖的葡萄糖殘基中的全部游離的羥基甲基化，接著，將完全甲基化了的葡聚糖水解。其次，將通過(guò)水解得到的甲基化葡萄糖還原，形成消除了端基差向異構(gòu)體型的甲基化葡萄糖醇，而且，通過(guò)將該甲基化葡萄糖醇中的游離的羥基乙?；?，得到部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯(以下，在本說(shuō)明書(shū)中，有時(shí)省略`“部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯”中的被乙酰基化的部位和“葡萄糖醇乙酸酯”的標(biāo)記，簡(jiǎn)稱(chēng)為“部分甲基化物”。)。通過(guò)用氣相色譜法對(duì)得到的部分甲基化物進(jìn)行分析，來(lái)自葡聚糖中鍵合方式各異的葡萄糖殘基的各種部分甲基化物可以用占?xì)庀嗌V圖中的全部部分甲基化物的峰面積的峰面積的百分率(%)表示。而且，可以由該峰面積％確定該葡聚糖中的鍵合方式不同的葡萄糖殘基的存在比、即各糖苷鍵的存在比率。在本說(shuō)明書(shū)中，部分甲基化物的“比”，是指甲基化分析的氣相色譜圖中的峰面積之比，部分甲基化物的“％”，是指甲基化分析的氣相色譜圖中的“面積％”。
[0116]上述⑴中的所謂2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴?以下，簡(jiǎn)稱(chēng)為“2，3，6-三甲基化物”)，是指C-4位參與1，4鍵合的葡萄糖殘基，2，3，4-三甲基-1，5，6-三乙?；咸烟谴?以下，簡(jiǎn)稱(chēng)為“2，3，4-三甲基化物”)是指C-6位參與1，6鍵合的葡萄糖殘基。而且，所謂“2，3，6-三甲基化物和2，3，4-三甲基化物之比在1:0.6~1:4的范圍”，即指在甲基化分析中的部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的氣相色譜圖中，對(duì)于本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖，除C-1位以外僅C-6位參與鍵合的葡萄糖殘基與除C-1位以外僅C-4位參與鍵合的葡萄糖殘基和除C-1位以外僅C-6位參與鍵合的葡萄糖殘基的總計(jì)的比例在37.5~80.0%的范圍。
[0117]上述⑵中的所謂“2，3，6_三甲基化物和2，3，4-三甲基化物的總計(jì)占部分甲基化物的60%以上”，是指對(duì)于本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖，除C-1位以外僅C-4位參與鍵合的葡萄糖殘基和除C-1位以外僅C-6位參與鍵合的葡萄糖殘基的總計(jì)占構(gòu)成葡聚糖的總葡萄糖殘基的60%以上。
[0118]同樣，上述⑶中的所謂“2，4，6-三甲基-1，3，5-三乙?；咸烟谴肌?以下，簡(jiǎn)稱(chēng)為“2，4，6-三甲基化物”)，是指C-3位參與1，3-鍵合的葡萄糖殘基，所謂“2，4，6-三甲基化物為部分甲基化物的0.5%以上且低于10%”，是指對(duì)于本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖，除C-1位以外僅C-3位參與鍵合的葡萄糖殘基為構(gòu)成葡聚糖的總葡萄糖殘基的0.5%以上且低于10%。
[0119]進(jìn)而，同樣，上述⑷中的所謂“2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙?；咸烟谴肌?以下，簡(jiǎn)稱(chēng)為“2，4- 二甲基化物”)，是指C-3位及C-6位雙方分別參與1，3鍵合和1，6鍵合的葡萄糖殘基，所謂“2，4-二甲基化物為部分甲基化物的0.5%以上”，是指對(duì)于本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖，除C-1位以外C-3位和C-6位參與鍵合的葡萄糖殘基為構(gòu)成葡聚糖的總葡萄糖殘基的0.5%以上。
[0120]完全滿(mǎn)足上述(I)~(4)的條件的本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖為目前為止所未知的新型葡聚糖。本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖在甲基化分析中，只要滿(mǎn)足上述(I)~(4)的條件，葡萄糖殘基的鍵合順序就沒(méi)有特別限定。
[0121]本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖通常為具有葡萄糖聚合度為10以上的各種葡萄糖聚合度的支鏈α-葡聚糖的混合物的形態(tài)。另外，在本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖中，其重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)通常小于20。
[0122]進(jìn)而，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖使具有即使為鄰接于葡聚糖中的異麥芽糖結(jié)構(gòu)的還原末端側(cè)的α -1, 2、α -1, 3、α -1，4及α _1，6鍵的任一種鍵也進(jìn)行水解的特征的異麥芽糖糊精酶(EC3.2.1.94)作用時(shí)，每單位消化物的固體成分通常生成異麥芽糖25質(zhì)量％以上50質(zhì)量％以下。
[0123]另外，對(duì)于本發(fā)明`的支鏈α-葡聚糖，根據(jù)平成8年5月厚生省告示第146號(hào)的營(yíng)養(yǎng)表示基準(zhǔn)、“營(yíng)養(yǎng)成份等的分析方法等(刊登于營(yíng)養(yǎng)表示基準(zhǔn)區(qū)別表第I的第3欄的方法)”中的第8項(xiàng)、記載于“食物纖維”的“高效液相色譜法(酶-HPLC法)”求出水溶性食物纖維含量時(shí)，通常含有40質(zhì)量％以上水溶性食物纖維。對(duì)上述高效液相色譜法(以下，在本說(shuō)明書(shū)中簡(jiǎn)稱(chēng)為“酶-HPLC法”)的概略進(jìn)行說(shuō)明時(shí)，為如下方法:通過(guò)利用熱穩(wěn)定α_淀粉酶、蛋白酶及淀粉葡糖苷酶(葡萄糖淀粉酶)進(jìn)行的一系列酶處理對(duì)試樣進(jìn)行分解處理，利用離子交換樹(shù)脂從處理液除去蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，由此，制備高效液相色譜(HPLC)用試樣溶液，然后，供給到凝膠過(guò)濾HPLC中，求出色譜圖中未消化葡聚糖和葡萄糖的峰面積，使用各自的峰面積、和預(yù)先另外利用常規(guī)方法的葡萄糖氧化酶法求出的試樣溶液中的葡萄糖量，算出試樣的水溶性食物纖維含量。對(duì)本方法的詳細(xì)情況，將在后述的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行說(shuō)明。
[0124]如后述的實(shí)驗(yàn)19所示，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖即使經(jīng)口攝取也難以利用唾液α-淀粉酶、胰液α-淀粉酶或小腸粘膜α-糖甙酶進(jìn)行分解，因此，難以被消化吸收，可以用作使血糖急劇上升少、刺激胰島素的分泌少的低卡路里的水溶性食物纖維。另外，該支鏈α -葡聚糖利用口腔內(nèi)的微生物，難以引起酸發(fā)酵，即使與蔗糖并用，也具有抑制成為牙垢的原因的不溶性葡聚糖的生成的作用，因此，也可以有利地用作低蛀牙性或抗致齲性糖質(zhì)。進(jìn)而，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖在使用小鼠的急性毒性試驗(yàn)中，為不顯示任何毒性的葡聚糖。[0125]進(jìn)而，如后述的實(shí)驗(yàn)20及21所示，同時(shí)攝取本發(fā)明的支鏈α _葡聚糖和通常的淀粉時(shí)，與僅攝取淀粉的情況相比，抑制血糖值或胰島素量的上升，因此，也可以用作血糖上升抑制劑。
[0126]而且，如后述的實(shí)驗(yàn)22所示，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖也具有通過(guò)攝取而抑制生物體內(nèi)的類(lèi)脂質(zhì)的過(guò)剩蓄積的作用，因此，也可以用作生物體內(nèi)類(lèi)脂質(zhì)減少劑。
[0127]將本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖用作上述血糖抑制劑或生物體內(nèi)類(lèi)脂質(zhì)減少劑時(shí)，由于水溶性食物纖維含量越高，作用效果越優(yōu)異，因此，支鏈α-葡聚糖通?？梢?xún)?yōu)選利用含有40質(zhì)量％以上、優(yōu)選50質(zhì)量％以上、進(jìn)一步優(yōu)選60質(zhì)量％以上的水溶性食物纖維的支鏈α-葡聚糖。
[0128]本發(fā)明中所說(shuō)的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，是指通過(guò)與麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖作用、基本上不進(jìn)行水解地催化α-葡糖基轉(zhuǎn)移從而生成本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的酶。在水解活性弱方面、不依賴(lài)于基質(zhì)溶液的濃度地由低濃度至高濃度均具有效率良好的轉(zhuǎn)移活性方面及也生成α-1，3及α-1，3，6鍵方面，本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶為與來(lái)自以往公知的真菌的α-葡糖苷酶或來(lái)自醋酸菌的糊精葡聚糖酶不同的酶。
[0129]本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活性可以如下測(cè)定。以最終濃度為lw/v%的方式使麥芽糖溶解于20mM醋酸緩沖液(pH6.0)并做成基質(zhì)液，在該基質(zhì)液5ml中加入酶液0.5ml，在40°C下進(jìn)行酶反應(yīng)30分鐘，將該反應(yīng)液0.5ml和5ml的20mM磷酸緩沖液(pH7.0)混合，在沸水水浴中加熱10分鐘，由此使反應(yīng)停止，然后，按照常規(guī)方法用葡萄糖氧化酶法測(cè)定反應(yīng)液中的葡萄糖量，算出通過(guò)反應(yīng)生成的葡萄糖量。α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性I單位定義為在上述條件下I分鐘內(nèi)生成Iμ摩爾的葡萄糖的酶量。
[0130]作為本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)具體例，可列舉例如具有下述理化性質(zhì)的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0131](I)分子量
`[0132]在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，為90，000± 10，000道爾頓；
[0133](2)最適溫度
[0134]在ρΗ6.0反應(yīng)30分鐘的條件下，為50~55°C ;
[0135](3)最適 pH
[0136]在40°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為5.0~6.3 ;
[0137](4)溫度穩(wěn)定性
[0138]在pH6.0保持60分鐘的條件下，在直至40°C穩(wěn)定；及
[0139](5) pH 穩(wěn)定性
[0140]在4°C保持24小時(shí)的條件下，至少在pH3.5~8.4的范圍內(nèi)穩(wěn)定。
[0141]作為本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的其它具體例，可列舉例如具有下述理化性質(zhì)的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0142](I)分子量
[0143]在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，為90，000± 10，000道爾頓；
[0144](2)最適溫度
[0145]在ρΗ6.0反應(yīng)30分鐘的條件下，為約50°C ；
[0146](3)最適 pH[0147]在40°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為約6.0 ；
[0148](4)溫度穩(wěn)定性
[0149]在pH6.0保持60分鐘的條件下，在直至40°C穩(wěn)定；及
[0150](5) pH 穩(wěn)定性
[0151]在4°C保持24小時(shí)的條件下，至少在pH4.0~8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。
[0152]雖然本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶不受其供給源的限制，但是，作為優(yōu)選的供給源，可列舉微生物，尤其優(yōu)選使用本發(fā)明人等從土壤中分離出的微生物ΡΡ710株及ΡΡ349株。下面，將在本發(fā)明的具有α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的微生物ΡΡ710株及ΡΡ349株的鑒定試驗(yàn)中判明的細(xì)菌學(xué)各種性質(zhì)分別示于表1及2。需要說(shuō)明的是，鑒定試驗(yàn)按照《微生物的分類(lèi)和鑒定》(長(zhǎng)谷川武治編、學(xué)會(huì)出版中心、1985年)進(jìn)行。
[0153][表 I]
[0154]
【權(quán)利要求】
1.一種支鏈α-葡聚糖，其以葡萄糖為構(gòu)成糖，其特征在于， 在甲基化分析中，所述支鏈α-葡聚糖是通過(guò)下述α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶作用于麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的α -1, 4葡聚糖得到的，所述的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)麥芽糖和/或葡萄糖聚合度3以上的α -1, 4葡聚糖的非還原末端具有α -1, 6葡糖基轉(zhuǎn)移活性和α -1, 3葡糖基轉(zhuǎn)移活性； 所述的支鏈α-葡聚糖具有下述特征: (1)2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6~1:4的范圍； (2)2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4-三甲基-1，5，6-三乙?；咸烟谴嫉目傆?jì)占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上； (3)2，4，6-三甲基-1，3，5-三乙酰基葡萄糖醇為部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且小于10% ;及 (4)2，4-二甲基-1，3，5，6-四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5%以上。
2.如權(quán)利要求1所述的支鏈α-葡聚糖，其特征在于，葡萄糖聚合度為10以上，重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)小于20。
3.如權(quán)利要求1或2所述的支鏈α-葡聚糖，其特征在于，通過(guò)異麥芽糖糊精酶(EC3.2.1.94)消化，每單位消化物的固體成分生成異麥芽糖25質(zhì)量％以上50質(zhì)量％以下。
4.如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)`所述的支鏈α-葡聚糖，其特征在于，利用高效液相色譜法(酶-HPLC法)求出的水溶性食物纖維含量為40質(zhì)量％以上。
5.一種α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，對(duì)麥芽糖和/或葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖的非還原末端具有α-1，6葡糖基轉(zhuǎn)移活性及α-1，3葡糖基轉(zhuǎn)移活性，且具有下述理化性質(zhì): (1)分子量 在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，為90，000 ± 10，000道爾頓； (2)最適溫度 在ρΗ6.0反應(yīng)30分鐘的條件下，為50~55°C ; (3)最適pH 在40°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為5.0~6.3 ; (4)溫度穩(wěn)定性 在pH6.0保持60分鐘的條件下，直到40°C穩(wěn)定；及 (5)pH穩(wěn)定性 在4°C保持24小時(shí)的條件下，至少在pH4.0~8.0內(nèi)穩(wěn)定。
6.一種支鏈α -葡聚糖的制造方法，其特征在于，使對(duì)麥芽糖和/或葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖的非還原末端具有α-1，6葡糖基轉(zhuǎn)移活性及α-1，3葡糖基轉(zhuǎn)移活性的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶作用于麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的α -1, 4葡聚糖、生成權(quán)利要求I~4中任一項(xiàng)所述的生成葡聚糖的步驟、和獲得該葡聚糖的步驟。
7.如權(quán)利要求6所述的支鏈α-葡聚糖的制造方法，其特征在于，在生成權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的葡聚糖的步驟中，并用選自淀粉酶、淀粉去分支酶及環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)位酶中的I種或2種以上。
8.如權(quán)利要求6所述的支鏈α-葡聚糖的制造方法，其為環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)PP710(獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心、保藏編號(hào)FERMBP-10771)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis) PP349 (獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心、保藏編號(hào)FERM BP-10770)或它們的變異株。
9.含有如權(quán)利要求1~4的任一項(xiàng)所述的支鏈α-葡聚糖的組合物，其特征在于，為飲食品、化妝品、醫(yī)藥品、醫(yī)藥部外品或工業(yè)原料的形態(tài)。
10.一種血糖上升抑制劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的支鏈α -葡聚糖作為有效成分。
11.一種生物體內(nèi)類(lèi)脂質(zhì)減少劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的支鏈α-葡聚糖作為有效成分。`
【文檔編號(hào)】C12P19/04GK103865967SQ201410065367
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2007年4月26日
【發(fā)明者】渡邊光, 山本拓生, 西本友之, 津崎桂二, 奧和之, 茶圓博人, 福田惠溫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社林原