一種甘薯病毒檢測引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明根據(jù)甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列分別設(shè)計合成出了三對用以檢測甘薯病毒的引物；并同時揭露了利用該三對引物對甘薯病毒進行檢測的方法，具體地，采用RT-PCR方法，應(yīng)用三對特異性引物同時對甘薯葉片中的3種病毒即甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒進行擴增檢測，并將擴增產(chǎn)物克隆測序比對進行驗證。本發(fā)明建立了一種通過一次反應(yīng)能夠同時可靠的檢測出3種甘薯病毒即甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒的檢測方法，具有檢測效率高、成本低的特點，且具有很高的檢測靈敏度。
【專利說明】一種甘薯病毒檢測引物及方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域的一種植物病毒檢測方法，具體涉及一種甘薯病毒檢測引物及方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]甘薯羽狀斑駁病毒(Sweetpotato feathery mottle virus, SPFMV)、甘薯 G 病毒(Sweet potato virus G, SPVG)和甘薯裡綠矮化病毒(Sweet potato chlorotic stuntvirus, SPCSV)是危害甘薯的三種主要病毒。
[0003]甘薯羽狀斑駁病毒和甘薯G病毒屬馬鈴薯Y病毒屬常常復(fù)合侵染，甘薯褪綠矮化病毒與甘薯羽狀斑駁病毒協(xié)生共侵染引起的甘薯病害被稱為甘薯病毒病害((sweetpotato virus disease, SPVD),我國于2010年首次報道了發(fā)現(xiàn)該病毒病癥狀。在田間這幾種病毒常常復(fù)合侵染，造成甘薯葉片扭曲、畸形、葉片褪綠、明脈及植株矮化，嚴(yán)重影響甘薯產(chǎn)量及品質(zhì)，嚴(yán)重時可造成90%以上的損失，甚至絕收，這幾種病毒的復(fù)合侵染已經(jīng)成為甘薯生產(chǎn)的主要限制因素。目前，甘薯病毒尚無特別有效的化學(xué)防治方法，培育和栽培無病毒苗是防治甘薯病毒最有效措施，但在無毒苗培育過程中，經(jīng)常需要對脫毒苗進行病毒檢測。
[0004]目前，植物病毒檢測大多采用基于抗血清的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA方法)，但抗血清不僅價格較高、一種抗血清只能檢測一種病毒、檢測程序繁瑣，而且還存在一定程度的假陽性反應(yīng)、檢測靈敏性相對較低等問題。近年來，為了提高病毒檢測效率，基于PCR技術(shù)的病毒檢測技術(shù)正在迅速發(fā)展，但單重PCR檢測技術(shù)，一個反應(yīng)只能檢測一種病毒，若應(yīng)用于田間多種病毒復(fù)合 侵染的甘薯病毒的檢測，則存在著耗時、耗力、費用高的問題。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種甘薯病毒檢測引物及方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的:一種甘薯病毒檢測引物，其具體包括如下三個引物對:
[0007]甘薯褪綠矮化病毒引物對:正向引物5’ -TGACTGGTGAGGCTACAAT-3’，反向引物5’-CACTTCCTTATGGCGTTCT-3’ ；
[0008]甘薯G病毒引物對:正向引物5’ -AGGGTGTCAGGGAAGATTA-3’，反向引物5’-AGTGCTGCTGCTTTCATTT-3’ ；
[0009]甘薯羽狀斑駁病毒引物對:正向引物5’ -ATCCTCCACCACCTACAAT-3’，反向引物5’-GAAGTGCGTCATAATCTGC-3’ 。
[0010]進一步地，所述甘薯褪綠矮化病毒引物對對甘薯褪綠矮化病毒PCR擴增出220bp的產(chǎn)物；所述甘薯G病毒引物對對甘薯G病毒PCR擴增出391bp的產(chǎn)物；所述甘薯羽狀斑駁病毒引物對對甘薯羽狀斑駁病毒PCR擴增出566bp的產(chǎn)物。
[0011]進一步地，利用上述三個引物對甘薯病毒進行檢測，且檢測方法如下:根據(jù)甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列分別設(shè)計合成出如權(quán)利要求1中所述甘薯褪綠矮化病毒引物對、甘薯G病毒引物對及甘薯羽狀斑駁病毒引物對；然后分別利用褪綠矮化病毒引物對對甘薯葉片中的甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒引物對對甘薯葉片中的甘薯G病毒、甘薯羽狀斑駁病毒引物對對甘薯葉片中的甘薯羽狀斑駁病毒進行RT-PCR反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析和克隆測序比對。
[0012]進一步地,所述RT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下:
[0013]反應(yīng)體系:反應(yīng)體系的總體積為25yL，含有0.3yL5U/yL的Taq酶、5yL的IOXTaq 酶 buffer,4 μ L2.5mmol/L 的 dNTPs、2 μ L 模板、0.12-0.24 μ mol/L 的甘薯褪綠矮化病毒正向引物、0.12-0.24 μ mol/L的甘薯褪綠矮化病毒反向引物、0.12-0.24 μ mol/L的甘薯G病毒正向引物、0.12-0.24 μ mol/L的甘薯G病毒反向引物、0.12-0.2 μ mol/L的甘薯羽狀斑駁病毒正向引物、0.12-0.2 μ mol/L的甘薯羽狀斑駁病毒反向引物、其余成分為滅菌雙蒸水；其中，每所述引物對中的正向引物和反向引物的濃度均相等，所述甘薯褪綠矮化病毒正向引物、甘薯褪綠矮化病毒反向引物，甘薯G病毒正向引物、甘薯G病毒反向引物、甘薯羽狀斑駁病毒正向引物、甘薯羽狀斑駁病毒反向引物的濃度均是以反應(yīng)體系的總體積25 μ L為基準(zhǔn)；
[0014]反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 30s，52_58°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循環(huán)35次；72°C延伸IOmin ;4°C終止反應(yīng)。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:
[0016]針對甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列，分別設(shè)計合成了三對相應(yīng)的特異性引物，并利用該三對特異性引物同時對甘薯葉片中的甘薯褪 綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒三種病毒進行RT-PCR反應(yīng)，建立了一種通過一次反應(yīng)能夠同時可靠的檢測出3種甘薯病毒即甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒的檢測方法，具有檢測效率高、成本低的特點，且即使樣本中3種甘薯病毒的RNA含量很低，本發(fā)明也能檢測出來，即本發(fā)明檢測方法具有很高的檢測靈敏度。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0017]下面參照附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。
[0018]圖1為本發(fā)明中實施例一的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0019]圖2為本發(fā)明中實施例二的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0020]圖3為本發(fā)明中實施例三的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
【【具體實施方式】】
[0021]本發(fā)明列舉了以下幾個代表性實施例，這些實施例僅是示例性的，且不用于限制本發(fā)明的范圍，這些實施例僅用于說明本發(fā)明的實施方法。
[0022]實施例一
[0023]本發(fā)明一種甘薯病毒的檢測方法，根據(jù)甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列分別設(shè)計合成了甘薯褪綠矮化病毒引物對、甘薯G病毒引物對及甘薯羽狀斑駁病毒引物對，然后分別利用褪綠矮化病毒引物對對甘薯葉片中的甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒引物對對甘薯葉片中的甘薯G病毒、甘薯羽狀斑駁病毒引物對對甘薯葉片中的甘薯羽狀斑駁病毒進行RT-PCR反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析和克隆測序比對。
[0024]其中，各引物對具體為:(1)甘薯褪綠矮化病毒引物對(如SEQ ID NO:1、2所示):正向引物 5’ -TGACTGGTGAGGCTACAAT-3’，反向引物 5’ -CACTTCCTTATGGCGTTCT-3’ ；( 2)甘薯G病毒引物對(如SEQ ID NO:3、4所示):正向引物5’ -AGGGTGTCAGGGAAGATTA-3’，反向引物5’ -AGTGCTGCTGCTTTCATTT-3’ ；(3)甘薯羽狀斑駁病毒引物對(如SEQ ID NO:5、6所示):正向引物 5’ -ATCCTCCACCACCTACAAT-3’，反向引物 5’ -GAAGTGCGTCATAATCTGC-3’。
[0025]另外， 申請人:為了描述方便，將甘薯褪綠矮化病毒簡稱為SPCSV，甘薯G病毒簡稱為SPVG，甘薯羽狀斑駁病毒簡稱為SPFMV。本發(fā)明檢測方法的具體操作步驟如下:
[0026]步驟1:根據(jù)甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒三種病毒的外殼蛋白基因核苷酸序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計三對特異性引物(即所述甘薯褪綠矮化病毒引物對、甘薯G病毒引物對及甘薯羽狀斑駁病毒引物對)，再用DNAman軟件對所設(shè)計的三對特異性引物進行校正，證實三對引物間不存在自身匹配和競爭性擴增，以確保上述三種病毒能擴增出差異明顯的特異性片段，并由大連寶生物工程有限公司合成上述三對特異性引物。
[0027]步驟2 =RNA提取:將同時被SPCSV、SPVG和SPFMV三種病毒復(fù)合侵染的甘薯葉片
0.2g、健康葉片0.2g分別進行RNA提取，并以健康葉片為陰性對照。RNA提取采用Trizol法:0.2g甘薯帶病毒葉片或健康葉片放入研缽中，加入液氮研磨成粉狀，接著將粉狀轉(zhuǎn)入
1.5ml第一離心管中，再加入ImL Trizol并劇烈震蕩20~30S，然后將離心管置于室溫下靜置5min以使葉片充分裂解，接著將離心管于12000rpm下離心5min，將上清移至第二離心管中，往第二離心管中加入l/5Trizol體積氯仿，并振蕩混勻，于室溫下放置3min，接著在4°C、12000rpm下離心15min，然后吸取上層水相至第三離心管中，往第三離心管中加入l/2Trizol體積異丙醇混勻，并于室溫下放置lOmin，接著將第三離心管于4°C、12000rpm條件下離心10min，并棄去上清液，則RNA沉于管底；之后加lmL75%乙醇(DEPC處理水配制)于第三離心管中并溫和振蕩第三離心管，得到懸浮液，再于4°C、1000Orpm條件下離心5min，并棄去上清液，然后將第三離心管置于冰上晾干3min，最后用30uL DEPC處理水溶解RNA樣品O
[0028]步驟3:反轉(zhuǎn)錄cDNA:將經(jīng)步驟2處理所得的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體內(nèi)容為:將反應(yīng)管置于冰上，加入IuL Primer Oligo (dt)、6uL DEPC處理水、IuL dNTP混合液(IOmMeach)、2uL RNA樣品至反應(yīng)管中，輕輕混勻再進行稍微離心，接著將反應(yīng)管置于PCR儀中65°C反應(yīng)5min后,立即將反應(yīng)管置于冰上5min,之后于上述反應(yīng)液再加入4uL5X反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、0.5uL (40U/uL)的RNAase抑制劑、IuL (200U/uL)反轉(zhuǎn)錄酶至反應(yīng)管中，加入
4.5uL DEPC處理水，輕輕混勻，再稍微離心，然后將反應(yīng)管置于PCR儀中42°C反應(yīng)50min，95°C反應(yīng)5min，反應(yīng)結(jié)束后冰上冷卻。
[0029]步驟4 =PCR擴增:以經(jīng)步驟3處理所得的cDNA為模板，并以步驟I中獲得的三對引物為引物對同時進行PCR擴增反應(yīng)，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0030]為了進行對比，本實施例同時進行了單重PCR擴增反應(yīng)和多重PCR擴增反應(yīng)，其中，單重PCR擴增反應(yīng)和多重PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)程序一致但反應(yīng)體系不同。PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序具體如下:
[0031]單重PCR反應(yīng)體系:反應(yīng)體系的總體積為254 1^，包括0.3“1^5~4 1^的了&9酶、
2.5 μ L 的 IOXTaq 酶 buffer,2.0 μ L2.5mmol/L 的 dNTP、2 μ L 模板、I μ LlO μ mol/L SPCSV或SPVG或SPFMV的正向引物、I μ LlO μ mol/L SPCSV或SPVG或SPFMV的反向引物，其余成分為滅菌雙蒸水。
[0032]多重PCR反應(yīng)體系:反應(yīng)體系的總體積為254 1^，含有0.3口1^5~4 1^的了&9酶、
2.5 μ L 的 IOXTaq 酶 buffer、2 μ L2.5mmol/L 的 dNTP、2 μ L 模板、0.24 μ mol/L 的 SPCSV 正向引物、0.24 μ mol/L的SPCSV反向引物，0.12 μ mol/L的SPVG正向引物、0.12 μ mol/L的SPVG反向引物、0.12 μ mol/L的SPFMV正向引物、0.12 μ mol/L的SPFMV反向引物、其余成分為滅菌雙蒸水；其中，所述SPCSV正向引物和反向引物、SPVG正向引物和反向引物、及SPFMV正向引物和反向引物的濃度均是以反應(yīng)體系的總體積25 μ L為基準(zhǔn)。
[0033]PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 5min、94°C變性 30s、57°C退火 30s、72°C延伸 lmin，循環(huán)35次；72°C延伸IOmin ;4°C終止反應(yīng)。
[0034]步驟5:取5 μ L PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠(熒光染料)為電泳支持介質(zhì)，在I X TAE和120V電壓下電泳30min，用紫外透射儀觀察，具體實驗結(jié)果見圖1。
[0035]本實施例1%瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果如圖1所示，SPCSV引物對的單重PCR擴增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識I所示，SPVG引物對的單重PCR擴增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識2所示，SPFMV引物對 的單重PCR擴增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識3所示，由SPCSV引物對、SPVG弓丨物對、SPFMV引物對的三對引物參與的多重PCR擴增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識4所示，健康葉片的單重PCR擴增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識5所示。由圖1可知，SPCSV引物對的單重PCR擴增反應(yīng)得到擴增片段長度為220bp的條帶，SPVG引物對的單重PCR擴增反應(yīng)得到擴增片段長度為391bp的條帶，SPFMV引物對的單重PCR擴增反應(yīng)得到擴增片段長度為566bp的條帶；由SPCSV引物對、SPVG引物對、SPFMV引物對三對引物參與的多重PCR擴增反應(yīng)，可同時得到擴增片段長度220bp、391bp和566bp的三條明亮清晰的條帶，與單一 RT-PCR檢測結(jié)果一致；可見，本發(fā)明可以一次性同時檢測出甘薯的SPCSV、SPVG, SPFMV三種病毒，且特異性好、檢測效率高。
[0036]實施例二
[0037]將實施例一步驟4中的多重PCR反應(yīng)體系得到的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)割膠回收，然后分別與PMD18-T simple vector進行體外連接,再挑取陽性克隆,最后提取質(zhì)粒測序，以檢查甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒三種病毒的擴增結(jié)果。
[0038]且測序結(jié)果為:SPCSV、SPVG和SPFMV的擴增產(chǎn)物分別是由220、391和566個核苷酸組成的序列，其中所述SPCSV擴增產(chǎn)物序列如SEQ ID NO:7所示，所述SPVG擴增產(chǎn)物序列如SEQ ID NO:8所示，所述SPFMV擴增產(chǎn)物序列如SEQ ID N0:9所示。用NCBI分析同源性結(jié)果表明，所得的擴增產(chǎn)物序列SEQ ID NO:7與參考序列即SPCSV的外殼蛋白基因序列的同源率達到100%，序列SEQ ID NO:8與參考序列SPVG的外殼蛋白基因序列的同源率達到97%，序列SEQ ID NO:9與參考序列SPFMV的外殼蛋白基因序列的同源率達到100% ;由此可見，所得的擴增產(chǎn)物SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9序列分別為SPCSV、SPVG和SPFMV的外殼蛋白基因的部分序列，從而證明了本發(fā)明檢測方法結(jié)果的可靠性。
[0039]此外， 申請人:還對本發(fā)明甘薯病毒檢測方法的靈敏度進行了檢測，具體地，對實施例一步驟2中的RNA樣品進行10—1、10_2、10' 10_4、10_5、10_6 —系列的梯度稀釋，然后經(jīng)過多重RT-PCR擴增反應(yīng)，再進行1%瓊脂糖凝膠電泳實驗，具體結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，圖2中的標(biāo)識1、2、3分別為IUO-1和Kr2倍的RNA樣品，其中SPCSV、SPVG和SPFMV三種病毒在樣品濃度稀釋10_2倍后均能擴增出特異條帶，而SPFMV、SPVG稀釋10_4倍后仍能擴增出特異條帶，由此可見本發(fā)明檢測方法具有很高的靈敏度。
[0040] 實施例三
[0041] 多重RT-PCR同時檢測SPCSV、SPVG和SPFMV的應(yīng)用:
[0042]本實施例與實施例一不同之處在于:
[0043]步驟1:隨機選取福建南安大田中疑似病毒癥狀的甘薯樣品進行檢測，10個采自大田樣品和I個脫毒苗樣品經(jīng)ELISA檢測為陰性作為陰性對照進行RNA提取，11個甘薯樣品均為0.2g，接著對各樣品進行RNA提取(操作同實施例一的步驟2)，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA (操作同實施例一的步驟3)。
[0044]步驟2:以處理所得的cDNA為模板，并以本發(fā)明所述的三對引物為引物對同時進行PCR擴增反應(yīng)，得到PCR擴增產(chǎn)物。PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序具體內(nèi)容如下:
[0045]PCR反應(yīng)體系:反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，含有0.3 μ L5U/ μ L的Taq酶、2.5 μ L的 IOXTaq 酶 buffer,2 μ L2.5mmol/L 的 dNTP、2 μ L 模板、0.24 μ mol/L 的 SPCSV 正向引物、
0.24 μ mo I /L 的 SPCSV 反向引物、0.12 μ mo I /L 的 SPVG 正向引物、0.12 μ mo I /L 的 SPVG 反向引物、0.12 μ mol/L的SPFMV正向引物、0.12 μ mol/L的SPFMV反向引物，其余成分為滅菌雙蒸水；PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min、94°C變性30s、57°C退火30s、72°C延伸lmin，循環(huán)35次，72°C延伸10min，4°C終止反應(yīng)。
[0046]步驟3:取5 μ L PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠(熒光染料)為電泳支持介質(zhì)，在I X TAE和120V電壓下電泳30min，用紫外透射儀觀察，具體實驗結(jié)果見圖3。
[0047]本實施例1%瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果如圖3所示，利用多重RT-PCR體系對11份甘薯樣品進行檢測，圖3中標(biāo)識9陽性對照未擴增出特異性條帶，圖3中標(biāo)識1-11為田間樣品中，均擴增出2條或3條特異性條帶，說明采集的田間樣品受SPCSV、SPVG和SPFMV種病毒復(fù)合侵染，得到擴增片段長度566bp、391bp和220bp的三條明亮清晰的條帶，與實施例一中單一 RT-PCR檢測結(jié)果一致?？梢姡景l(fā)明檢測方法可以一次性同時檢測出甘薯的SPCSV、SPVG, SPFMV三種病毒，特異性好、檢測效率高。
[0048]本發(fā)明針對SPCSV、SPVG和SPFMV三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列，分別設(shè)計合成了三對相應(yīng)的特異性引物，并利用該三對特異性引物同時對甘薯葉片中的SPCSV、SPVG和SPFMV進行mRT-PCR反應(yīng)，建立了一種新的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，使RT-PCR反應(yīng)得到了大小差異明顯，長度分別為220bp、391bp和566bp的三條SPCSV、SPVG和SPFMV的擴增片段序列；本發(fā)明實現(xiàn)了一次反應(yīng)就能同時檢測出3種甘薯病毒即SPCSV、SPVG和SPFMV的目標(biāo)，因而本發(fā)明檢測效率高，本發(fā)明所用試劑為分子生物學(xué)常用試劑，所需成本低，即使樣本中3種甘薯病毒的RNA含量很低，本發(fā)明也能檢測出來，因而本發(fā)明具有很高的檢測靈敏度。
【權(quán)利要求】
1.一種甘薯病毒檢測引物，其特征在于:具體包括如下三個引物對: 甘薯褪綠矮化病毒引物對:正向引物5’ -TGACTGGTGAGGCTACAAT-3’，反向引物5’-CACTTCCTTATGGCGTTCT-3’ ； 甘薯G病毒引物對:正向引物5’-AGGGTGTCAGGGAAGATTA-3’，反向引物5’-AGTGCTGCTGCTTTCATTT-3’ ； 甘薯羽狀斑駁病毒引物對:正向引物5’ -ATCCTCCACCACCTACAAT-3’，反向引物5’-GAAGTGCGTCATAATCTGC-3’ 。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種甘薯病毒檢測引物，其特征在于:所述甘薯褪綠矮化病毒引物對對甘薯褪綠矮化病毒PCR擴增出220bp的產(chǎn)物；所述甘薯G病毒引物對對甘薯G病毒PCR擴增出391bp的產(chǎn)物；所述甘薯羽狀斑駁病毒引物對對甘薯羽狀斑駁病毒PCR擴增出566bp的產(chǎn)物。
3.一種甘薯病毒檢測方法，其特征在于:根據(jù)甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽狀斑駁病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列分別設(shè)計合成出如權(quán)利要求1中所述甘薯褪綠矮化病毒引物對、甘薯G病毒引物對及甘薯羽狀斑駁病毒引物對；然后分別利用褪綠矮化病毒引物對對甘薯葉片中的甘薯褪綠矮化病毒、甘薯G病毒引物對對甘薯葉片中的甘薯G病毒、甘薯羽狀斑駁病毒引物對對甘薯葉片中的甘薯羽狀斑駁病毒進行RT-PCR反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析和克隆測序比對。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種甘薯病毒檢測方法，其特征在于:所述RT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下: 反應(yīng)體系:反應(yīng)體系的總體·積為25 μ L，含有0.3 μ L5U/ μ L的Taq酶、5 μ L的IOXTaq酶 buffer、4 μ L2.5mmol/L 的 dNTPs、2 μ L 模板、0.12-0.24 μ mol/L 的甘薯褪綠矮化病毒正向引物、0.12-0.24 μ mol/L的甘薯褪綠矮化病毒反向引物、0.12-0.24 μ mol/L的甘薯G病毒正向引物、0.12-0.24 μ mol/L的甘薯G病毒反向引物、0.12-0.2 μ mol/L的甘薯羽狀斑駁病毒正向引物、0.12-0.2 μ mol/L的甘薯羽狀斑駁病毒反向引物、其余成分為滅菌雙蒸水；其中，每所述引物對中的正向引物和反向引物的濃度均相等，所述甘薯褪綠矮化病毒正向引物、甘薯褪綠矮化病毒反向引物，甘薯G病毒正向引物、甘薯G病毒反向引物、甘薯羽狀斑駁病毒正向引物、甘薯羽狀斑駁病毒反向引物的濃度均是以反應(yīng)體系的總體積25 μ L為基準(zhǔn)； 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52_58°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)35次；72°C延伸IOmin ;4°C終止反應(yīng)。
【文檔編號】C12N15/11GK103849691SQ201410066915
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】李華偉, 許泳清, 邱思鑫, 羅文彬, 劉中華, 邱永祥, 紀(jì)榮昌, 湯浩 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所