一種線蟲凋亡調(diào)控基因ced-4誘導(dǎo)啟動(dòng)子、水稻表達(dá)載體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種線蟲凋亡調(diào)控基因ced-4誘導(dǎo)啟動(dòng)子wn-2、水稻表達(dá)載體pCA-Wn-2-CED-4及pCA-Wn-2-CED-4表達(dá)載體的制備方法。本發(fā)明利用已經(jīng)被報(bào)道的W-box系列啟動(dòng)子中誘導(dǎo)效果最佳的核心序列，在其中加入動(dòng)植物基因共享的TATA-box核心序列，創(chuàng)新設(shè)計(jì)了線蟲體細(xì)胞凋亡基因在水稻表達(dá)的新的wn-2序列。將wn-2和水稻表達(dá)載體的固有啟動(dòng)子融合，構(gòu)建成了新的水稻表達(dá)載體pCA-Wn-2-CED-4表達(dá)載體，具有誘導(dǎo)目的基因ced-4在水稻表達(dá)的優(yōu)越效果，已篩選到連接正確的載體克隆，并且成功轉(zhuǎn)化到水稻品種：日本晴和麗江新團(tuán)黑谷。
【專利說(shuō)明】—種線蟲凋亡調(diào)控基因ced-4誘導(dǎo)啟動(dòng)子、水稻表達(dá)載體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種線蟲凋亡調(diào)控基因ced-4誘導(dǎo)啟動(dòng)子、水稻表達(dá)載體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于線蟲細(xì)胞凋亡調(diào)控基因ced-4在水稻體內(nèi)不存在，ced-4基因能否在水稻中順利啟動(dòng)而成功表達(dá)目的蛋白，對(duì)啟動(dòng)子的科學(xué)設(shè)計(jì)至關(guān)重要；即動(dòng)物體的基因在植物體進(jìn)行表達(dá)，必須解決啟動(dòng)子在線蟲與水稻之間的兼容性問(wèn)題，而且還需要是病原物侵染誘導(dǎo)啟動(dòng)基因表達(dá)，這就是本專利的技術(shù)目標(biāo)。
[0003]從國(guó)內(nèi)外最新的相關(guān)研究文獻(xiàn)來(lái)看，由病原物侵染誘導(dǎo)在單子葉水稻的啟動(dòng)子及其表達(dá)載體，未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。
[0004]誘導(dǎo)啟動(dòng)子W-box已經(jīng)在煙草等雙子葉植物研究并且在病原物侵染成功誘導(dǎo)表達(dá)，但是在水稻中它啟動(dòng)誘導(dǎo)目的基因ced-4的表達(dá)載體尚未有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種線蟲凋亡調(diào)控基因ced-4誘導(dǎo)啟動(dòng)子、水稻表達(dá)載體及其制備方法。
[0006]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0007]本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種線蟲凋亡調(diào)控基因ced-4誘導(dǎo)啟動(dòng)子wn-2，所述誘導(dǎo)子wn-2序列如SEQ ID N0.1所示，具體為:
[0008]TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACCATCAACTCATCTGTATATAATA。
[0009]本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種水稻表達(dá)載體，所述水稻表達(dá)載體包括wn-2啟動(dòng)子，所述水稻表達(dá)載體的序列如SEQ ID N0.2所示，命名為pCA-Wn-2-CED-4表達(dá)載體。
[0010]本發(fā)明還提供了 pCA-Wn-2-CED-4表達(dá)載體的制備方法，所述制備方法如下:
[0011](I)將啟動(dòng)子 wn-2 和 P35S (SEQ ID N0.7)克隆至 pCAMBIA1305.1 載體(PCAMBIA1305.1載體為市售)(wn_2位于P35S前面)，得到中間載體pCA_Wn_2，擴(kuò)增Wn-2-P35S融合產(chǎn)物的引物如下:
[0012]ffn-2-P35S-FP:
[0013]AAAGAATTC-TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACCATCAACTCATCTGTATATAATATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACC (SEQ ID N0.3)；
[0014]ffn-2-P35S-RP:
[0015]AAAACTAGTCTGCAGAGTCCCCCGTGTTCTCTCCA (SEQ ID N0.4)；
[0016]具體過(guò)程是:通過(guò)EcoRI和SpeI位點(diǎn)插入到pCAMBIA1305.1載體中的EcoRI和SpeI (p35S啟動(dòng)子前和⑶S前端部分)，得到中間載體pCA-Wn_2 ；
[0017](2)將目的基 因ced-4克隆至pCA-Wn_2載體(通過(guò)PstI和PmlI位點(diǎn))，即得所述水稻表達(dá)載體，命名為pCAin-2-CED-4表達(dá)載體；
[0018]擴(kuò)增CED-4的引物如下:
[0019]Ced_4FP:
[0020]AAACTGCAGATGCTCTGCGAAATCGAATGC (SEQ ID N0.5)；
[0021]Ced-4RP:
[0022]AAAACTAGTTTAACAGCATGCAAAATTTTTGAGGG (SEQ ID N0.6)。
[0023]本發(fā)明方法設(shè)計(jì)的具體克隆方式及酶切等步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作。
[0024]下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解釋:
[0025]由于CED-4是線蟲細(xì)胞凋亡主要調(diào)控基因表達(dá)的蛋白，因此必須考慮這個(gè)調(diào)控基因如何在水稻中啟動(dòng)表達(dá)蛋白。
[0026]為了解決啟動(dòng)子在線蟲和水稻兩者的兼容性問(wèn)題，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)和無(wú)數(shù)次的實(shí)驗(yàn)篩選和驗(yàn)證，在前人報(bào)道的W-box基礎(chǔ)上，本發(fā)明加入了動(dòng)物和植物均共享的啟動(dòng)子TATA-box序列，以圖在水稻上誘導(dǎo)順利啟動(dòng)目的基因ced-4，表達(dá)線蟲細(xì)胞凋亡蛋白CED-4。經(jīng)過(guò)從多個(gè)改造的W-TATA-box啟動(dòng)子中，篩選到的誘導(dǎo)啟動(dòng)子:wn-2啟動(dòng)子，誘導(dǎo)目的基因ced-4在水稻表達(dá)CED-4效果明顯。
[0027]本發(fā)明構(gòu)建了以wn-2啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻獲得轉(zhuǎn)基因水稻，轉(zhuǎn)化水稻苗根部在寄生線蟲侵染時(shí)可誘導(dǎo)水稻表達(dá)CED-4蛋白。
[0028]本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻的轉(zhuǎn)`化苗，在水稻寄生線蟲侵染時(shí)成功誘導(dǎo)ced-4基因的表達(dá)。
[0029]目前，國(guó)內(nèi)外研究表明TIR結(jié)構(gòu)域蛋白僅發(fā)現(xiàn)在雙子葉植物存在，其表達(dá)也具有相應(yīng)的啟動(dòng)子，如在擬南芥表達(dá)；但在單子葉水稻中尚未發(fā)現(xiàn)有TIR結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)。線蟲細(xì)胞凋亡TIR結(jié)構(gòu)域蛋白基因，在表達(dá)載體中目的基因之前32— 45個(gè)堿基處加入w-box誘導(dǎo)序列，在病原線蟲侵染時(shí)，目的基因啟動(dòng)子可以應(yīng)答對(duì)寄生線蟲侵染傷口時(shí)啟動(dòng)反應(yīng)，誘導(dǎo)目的基因表達(dá)蛋白增強(qiáng)。因此，進(jìn)行這一類誘導(dǎo)啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)在理論研究和實(shí)際應(yīng)用中均具有很大的價(jià)值。
[0030]總之，本發(fā)明利用已經(jīng)被報(bào)道的W-box系列啟動(dòng)子中誘導(dǎo)效果最佳的核心序列，在其中加入動(dòng)植物基因共享的TATA-box核心序列，創(chuàng)新設(shè)計(jì)了線蟲體細(xì)胞凋亡基因在水稻表達(dá)的新的wn-2序列。將wn-2和水稻表達(dá)載體的固有啟動(dòng)子融合,構(gòu)建成了新的水稻表達(dá)載體pCA-Wn-2-CED-4表達(dá)載體，具有誘導(dǎo)目的基因ced-4在水稻表達(dá)的優(yōu)越效果，已篩選到連接正確的載體克隆，并且成功轉(zhuǎn)化到水稻品種:日本晴和麗江新團(tuán)黑谷。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為pCA-Wn-2-CED_4表達(dá)載體酶切圖；
[0032]圖2為蛋白雜交檢測(cè)水稻表達(dá)目的蛋白CED-4的電泳圖；圖中:泳道1、3為誘導(dǎo)啟動(dòng)子wn2載體轉(zhuǎn)化日本晴接種線蟲，2、4為wn2載體轉(zhuǎn)化日本晴未接種線蟲；M為蛋白Marker,9為Wn2載體轉(zhuǎn)化麗江苗接種線蟲。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1[0034]所述wn-2啟動(dòng)子序列如SEQ ID N0.1 ；
[0035]將啟動(dòng)子wn-2 和 P35S (SEQ ID N0.7)克隆至 pCAMBIA1305.1 載體(wn_2 位于P35S前面)，得到中間載體pCA-Wn-2，擴(kuò)增Wn-2_P35S融合產(chǎn)物的引物如下:
[0036]ffn-2-P35S-FP:
[0037]AAAGAATTC-TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACCATCAACTCATCTGTATATAATATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACC (SEQ ID N0.3)；
[0038]ffn-2-P35S-RP:
[0039]AAAACTAGTCTGCAGAGTCCCCCGTGTTCTCTCCA (SEQ ID N0.4)；
[0040]具體過(guò)程是:通過(guò)EcoRI和SpeI位點(diǎn)插入到pCAMBIA1305.1載體中的EcoRI和SpeI (p35S啟動(dòng)子前和⑶S前端部分)，得到中間載體pCA-Wn_2 ；
[0041]將目的基因ced-4克隆至pCA-Wn-2載體(通過(guò)PstI和PmlI位點(diǎn))，即得所述水稻表達(dá)載體，命名為pCA-wn-2-CED-4表達(dá)載體，pCA-wn-2-CED_4表達(dá)載體序列如SEQ IDN0.2所示；
[0042]擴(kuò)增CED-4的引物如下:
[0043]Ced-4FP:
[0044]AAACTGCAGATGCTCTGCGAAATCGAATGC (SEQ ID N0.5)；
[0045]Ced-4RP:`
[0046]AAAACTAGTTTAACAGCATGCAAAATTTTTGAGGG (SEQ ID N0.6)。
[0047]實(shí)施例2水稻表達(dá)載體的驗(yàn)證
[0048]構(gòu)建的水稻表達(dá)載體，通過(guò)實(shí)驗(yàn)各種處理，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其誘導(dǎo)作用實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果如下:
[0049](I)轉(zhuǎn)基因水稻苗接種水稻潛根線蟲。
[0050](2)檢測(cè)水稻根部表皮細(xì)胞凋亡和過(guò)敏性反應(yīng)表型，見(jiàn)染色檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表。
[0051 ] (3 )轉(zhuǎn)基因目的基因表達(dá)蛋白CED-4檢測(cè)，見(jiàn)說(shuō)明書附圖。
[0052]染色測(cè)定水稻根部細(xì)胞過(guò)敏反應(yīng)方法:
[0053]水稻根部分別染色15min后以流水充分沖洗去除未結(jié)合染料，在50°C下用20mL含50%甲醇和1%SDS的溶液抽提與死細(xì)胞結(jié)合的染料30min，測(cè)定抽提液光吸收值，溴酚藍(lán)染色的測(cè)定波長(zhǎng)為595nm。
[0054]具體測(cè)定內(nèi)容為:
[0055](a)精確稱量不同處理水稻和對(duì)照處理的根部組織，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)樣品隨機(jī)取10條水稻根，取相同品種野生型的水稻10條根，甲醇處理15min水稻根部細(xì)胞，分別用相同濃度溴酚藍(lán)染色后測(cè)定，測(cè)定比較不同處理在接種水稻寄生線蟲之后對(duì)根部表皮發(fā)生細(xì)胞凋亡的影響；接種水稻潛根線蟲的影響(各處理分別接種水稻潛根線蟲，在常溫22°C的光照培養(yǎng)箱，根部在500條有活力的潛根線蟲水溶液接種96小時(shí)之后)，與未接種線蟲的樣品分別染色檢測(cè)比較；
[0056](b)用甲醇或乙醇處理，或煮沸處理水稻細(xì)胞不同時(shí)間后，再用0.03%溴酚藍(lán)染色測(cè)定，比較不同處理(野生型、誘導(dǎo)載體、非誘導(dǎo)載體；接種線蟲與不接種線蟲)水稻根部表皮細(xì)胞發(fā)生凋亡數(shù)量的差異；
[0057](C)用可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)(UV-6100和Perkin Elmer Lambda35)對(duì)不同處理溴酚藍(lán)染色并且洗脫之后進(jìn)行波長(zhǎng)(595nm)掃描檢測(cè)，記錄結(jié)果進(jìn)行分析。
[0058](d)對(duì)這些同樣數(shù)量的水稻根部樣品進(jìn)行染色，測(cè)定表皮細(xì)胞凋亡的數(shù)量，計(jì)算各處理表皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生率。
[0059](e)按公式計(jì)算:細(xì)胞凋亡發(fā)生率(%) = (0D595處理-0D595對(duì)照)/(100-0D595對(duì)照校正值)X 100%計(jì)算。
[0060](f)已知的野生型水稻表皮活細(xì)胞，在線蟲侵染過(guò)程中發(fā)生細(xì)胞損傷均會(huì)增加染色測(cè)定的結(jié)果值。
[0061](g)不同水稻(日本晴)處理在不接種線蟲、接種線蟲情況下的表皮細(xì)胞染色處理的檢測(cè)結(jié)果如下:
[0062]表1各處理未接種線蟲的檢測(cè)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種線蟲凋亡調(diào)控基因ced-4誘導(dǎo)啟動(dòng)子wn-2，其特征在于，所述誘導(dǎo)子wn-2序列如 SEQ ID N0.1 所示。
2.一種水稻表達(dá)載體，其特征在于，所述水稻表達(dá)載體包括權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，所述水稻表達(dá)載體的序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如權(quán)利要求2所述水稻載體的制備方法，其特征在于，所述制備方法如下: (1)將啟動(dòng)子wn-2和P35S克隆至pCAMBIA1305.1載體，得到中間載體pCA-Wn_2，擴(kuò)增Wn-2-P35S融合產(chǎn)物的引物如下:
ffn-2-P35S-FP: AAAGAATTC-TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACCATCAACTCATCTGTATATAATATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACC ；ffn-2-P35S-RP:
AAAACTAGTCTGCAGAGTCCCCCGTGTTCTCTCCA ； (2)將目的基因CED-4克隆 至pCA-Wn-2載體，即得所述水稻表達(dá)載體，命名為 pCA-wn-2-CED-4 表達(dá)載體； 擴(kuò)增CED-4的引物如下:
Ced-4FP:
AAACTGCAGATGCTCTGCGAAATCGAATGC ；
Ced-4RP:
AAAACTAGTTTAACAGCATGCAAAATTTTTGAGGGo
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103882019SQ201410067025
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】鄒一平, 韓成云 申請(qǐng)人:宜春學(xué)院