一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組dna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法，步驟如下：（1）取活性污泥，然后加入氯化鈉溶液洗滌，制得初洗污泥；（2）向初洗污泥中加入提取緩沖液和溶菌酶溶液；然后加入十二烷基硫酸鈉溶液，離心取上清液；（3）加入Tris-飽和酚溶液，再加入Tris-飽和酚溶液，離心取上清，制得提取液A；（4）加入混合溶液I，再加入混合溶液II，離心取上清，加入乙酸鈉溶液，再加入預(yù)冷無水乙醇，離心取沉淀，制得粗提物；（5）加入乙醇溶液，離心，收集沉淀，再加入TE緩沖液和RNaseA溶液，即得。本發(fā)明提高了活性污泥宏基因組DNA樣品的產(chǎn)量和質(zhì)量。
【專利說明】一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法，屬于生物技術(shù)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)氧丙烷皂化廢水是一種由氯醇法生產(chǎn)環(huán)氧丙烷過程產(chǎn)生的大量污水。根據(jù)相關(guān)報道，每生產(chǎn)It環(huán)氧丙烷就產(chǎn)生50-80t廢水。該廢水具有pH值高、氯化鈣含量高、COD高的特點，其中含有大量難以生化降解的氯化物，如氯丙醇、二氯異丙醚、二氯丙烷等。這種高鹽、富含有機(jī)物的廢水可造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，采用合理有效的方式處理這種廢水不容忽視。
[0003]生物活性污泥法是當(dāng)前環(huán)氧丙烷皂化廢水處理的主要方式，但這種方法受到微生物活性及其耐鹽度的限制，處理效果有待提高。采用有效的方法研究分析活性污泥微生物群落的主要的建群種，有針對性的進(jìn)行馴化培養(yǎng)，可大大提高活性污泥菌種的活性及耐鹽度，進(jìn)而提高活性污泥處理廢水的工作能力。
[0004]活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且絕大多數(shù)的微生物是不能被傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)的，通過傳統(tǒng)的富集、分離、培養(yǎng)很難對污泥微生物群落進(jìn)行準(zhǔn)確分析。宏基因組技術(shù)突破了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的局限性，是當(dāng)前進(jìn)行微生物群落分析最有效的方式之一，而獲得高質(zhì)量的宏基因組DNA，是準(zhǔn)確分析微生物群落的必要條件。
[0005]中國專利文獻(xiàn)CN101392248A (申請?zhí)?0081006477L I)公開了一種厭氧活性污泥DNA的提取方法，按照以下步驟進(jìn)行:一、污泥清洗；二、裂解細(xì)胞；三、DNA的純化；即提取出厭氧活性污泥DNA。
[0006]中國專利文獻(xiàn)CN102732504A (申請?zhí)?01110096525.6)公開了一種由油/氣藏復(fù)雜環(huán)境樣品中直接提取微生物宏基因組的簡易方法，包括以有機(jī)相/水相萃取獲得油樣/油水樣中微生物組份，真空過濾水相富集微生物，以溶菌酶、蛋白酶、十二烷基硫酸鈉(SDS)等裂解細(xì)胞，在聞鹽條件下通過十TK烷基二甲基漠化按(CTAB)去除蛋白質(zhì)以及多糖等有機(jī)大分子組份，隨后通過核酸抽提及沉淀，獲得無偏好的油/氣藏微生物宏基因組成分。
[0007]但上述方法應(yīng)用與環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA提取是，均出現(xiàn)DNA樣品條帶彌散，無法獲得較高質(zhì)量的宏基因組DNA樣本的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟如下:
[0011](I)取0.5~2g活性污泥，離心，收集沉淀；然后加入5~20ml的質(zhì)量濃度為0.9%的氯化鈉溶液洗滌I~5min，離心，收集沉淀，重復(fù)3~5次，制得初洗污泥；
[0012](2)向步驟(1)制得的初洗污泥中加入600~2400 μ L提取緩沖液和20~80 μ L溶菌酶溶液，混合均勻，36~38°C水浴保溫25~40min ;然后加入200~800 μ L的質(zhì)量濃度為10%的十二烷基硫酸鈉溶液，混合均勻，離心，取上清液；
[0013]所述提取緩沖液含有濃度為80~120mmol/L的三羥甲基氨基甲烷、濃度為80~120mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉、濃度為150~250mmol/L的NaCl、質(zhì)量濃度為1%的聚乙烯吡咯烷酮和質(zhì)量濃度為2%的十六烷基三甲基溴化銨，pH7.5~8.5 ;
[0014](3)向步驟(2)的上清液中加入800~3300 μ L Tris-飽和酚溶液，混合均勻，離心，取上清，再加入等體積500~2000 μ L Tris-飽和酚溶液，混合均勻，離心，取上清，制得提取液A ；
[0015](4)向步驟(3)制得的提取液A中加入等體積混合溶液I，混合均勻，離心，取上清，再加入等體積混合溶液II,混合均勻，離心,取上清,加入上清1/10~1/5體積的乙酸鈉溶液，再加入上清2~3倍體積的預(yù)冷無水乙醇，冰上放置30~40min ;低溫離心，取沉淀，制得粗提物；
[0016]所述混合溶液I是酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1的比例混合的混合溶液；
[0017]所述混合溶液II是氯仿、異戊醇按體積比25:1的比例混合的混合溶液；
[0018](5)向步驟(4)制得的粗提物中加入500~2000 μ L的體積百分比為70%的乙醇溶液，懸浮沉淀,離心,收集沉淀,重復(fù)I~3次；然后加入500~2000 μ L的無水乙醇，懸浮沉淀，離心，收集沉淀，室溫干燥，再加入60~240 μ L的TE緩沖液和3~12 μ L的RNaseA溶液，制得宏基因組DNA。該宏基因組DNA需置于_20°C進(jìn)行冷凍保存。
[0019]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的離心，條件均為:8000~1000Og離心I~1.5min。
[0020]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中溶菌酶溶液濃度為10~15mg/ml。溶菌酶的作用是通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β -1, 4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶為市售產(chǎn)品，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)該溶菌酶的目的選擇合適廠家生產(chǎn)的溶菌酶。
[0021]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)、(3)和(4)中的離心，條件均為:8000~1000Og離心10~15min。
[0022]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中的低溫離心，條件為:_4~0°C，10000~12000g 離心 10 ~15min。
[0023]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中的乙酸鈉溶液濃度為3mol/L，pH5.2。
[0024]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(5)中的離心，條件均為:10000~12000g離心I~
1.5min。
[0025]如無特殊說明，上述工藝條件均可采用本領(lǐng)域慣用條件，常用試劑如=Tris-飽和酚溶液、TE緩沖液、RNaseA溶液等如無特殊說明，均采用本領(lǐng)域常用試劑。
[0026]有益效果
[0027]本發(fā)明克服了現(xiàn)有宏基因組DNA提取方法無法提取環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥中宏基因組DNA的弊端，通過采用質(zhì)量濃度為0.9%的氯化鈉溶液一提取緩沖液一溶菌酶一十二烷基硫酸鈉溶液對活性污泥樣品進(jìn)行預(yù)處理和微生物細(xì)胞壁破碎，將獲得的高純度、高含量的宏基因組DNA樣品用酚、氯仿、異戊醇的混合溶液反復(fù)多次處理，并將上述處理后DNA樣品進(jìn)行無水乙醇/乙酸鈉沉淀提取獲得宏基因組DNA。本發(fā)明所述方法大大提高了活性污泥宏基因組DNA樣品的產(chǎn)量和質(zhì)量，獲得豐富度較高的環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA樣品，并且操作簡單、可行性強(qiáng)，成本低，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0029]其中:泳道Ml、泳道M2為DNA Ladder ;泳道I~2為實施例1提取的宏基因組DNA,泳道3為實施例2提取的宏基因組DNA，泳道4~6為對比例I提取的宏基因組DNA ；
[0030]圖2為環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0031]其中:泳道Ml、泳道M2為DNA Ladder ;泳道3為實施例1提取的宏基因組DNA，泳道4為實施例2提取的宏基因組DNA，泳道I~2為對比例2提取的宏基因組DNA。
【具體實施方式】
[0032]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
[0033]生物材料來源
[0034]實施例中所述的環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥取自濱化集團(tuán)股份有限公司環(huán)氧丙烷皂化廢水處理過程中的活性污泥。
[0035]溶菌酶購自Amresco公司，濃度10mg/ml。
[0036]RNaseA溶液購自天根生化科技(北京)有限公司。
[0037]Tris-飽和酌溶液購自Amresco公司。
[0038]TE 緩沖液:10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)，ρΗ=8.0
[0039]實施例1
[0040]一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA提取方法，步驟如下:
[0041](I)在離心管里加濕質(zhì)量為0.5g活性污泥，于1000Og離心lmin，收集沉淀；然后加入0.9%的氯化鈉溶液5ml洗漆lmin, 1000Og離心lmin,重復(fù)洗漆、離心步驟三次,收集沉淀，制得初洗污泥；
[0042](2)向步驟(1)制得的初洗污泥中加入600 μ L提取緩沖液和20 μ L濃度為IOmg/ml的溶菌酶溶液，渦旋至混勻；37°C水浴保溫30min ;然后加入200 μ L的質(zhì)量濃度為10%的十二烷基硫酸鈉溶液，渦旋至混勻；10000g離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；
[0043]所述提取緩沖液含有100mmol/L三輕甲基氨基甲燒(Tris)、100mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、200mmol/L的NaCl、質(zhì)量濃度1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和質(zhì)量濃度2%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，pH8.0。
[0044](3)向步驟(2)的800 μ LTris-飽和酚溶液，振蕩混勻，1000Og離心IOmindfi清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，向獲得的上清液中再加入500 μ LTriS-飽和酚溶液，振蕩混勻，1000Og離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，制得提取液A ；
[0045](4)向步驟(3)制得的提取液A中加入等體積混合溶液I，振蕩混勻，1000Og離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；再加入等體積混合溶液II，振蕩混勻，1000Og離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；加入上清液1/10體積的乙酸鈉溶液，乙酸鈉溶液濃度為3mol/L,乙酸鈉溶液pH5.2,再加入兩倍上清液體積的預(yù)冷無水乙醇,然后于冰上放置30min ;在(TC, 12000g離心IOmin,收集沉淀,制得粗提物；
[0046]所述混合溶液I是酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1的比例混合的混合溶液；
[0047]所述混合溶液II是氯仿、異戊醇按體積比25:1的比例混合的混合溶液；
[0048](5)向步驟(4)制得的粗提物中加入500 μ L的體積百分比為70%的乙醇溶液，上下顛倒振蕩懸浮沉淀；12000g離心lmin,收集沉淀；向獲得的沉淀中加入500 μ L體積百分比為70%乙醇溶液，上下顛倒振蕩懸浮沉淀；12000g離心lmin，收集沉淀；然后再加入500 μ L無水乙醇洗滌沉淀I次；上下顛倒振蕩懸浮沉淀，12000g離心lmin，收集沉淀，室溫干燥，再加入60 μ L的TE緩沖液和3 μ L的RNaseA溶液，制得宏基因組DNA，置于_20°C冷凍保存。
[0049]實施例2
[0050]一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA提取方法，步驟如下:
[0051](I)在離心管里加濕質(zhì)量為2g活性污泥，于SOOOg離心1.5min，收集沉淀；然后加入0.9%的氯化鈉溶液20ml洗漆5min, 8000g離心1.5min,重復(fù)洗漆、離心步驟5次,收集沉淀，制得初洗污泥；
[0052](2)向步驟(1)制得的初洗污泥中加入2400 μ L提取緩沖液和80 μ L濃度為IOmg/ml的溶菌酶溶液，渦旋至混勻；38°C水浴保溫40min ;然后加入800 μ L的質(zhì)量濃度為10%的十二烷基硫酸鈉溶液，渦旋至混勻；8000g離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；
[0053]所述提取緩沖液含有120mmol/L三輕甲基氨基甲燒(Tris)、120mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、250mmol/L的NaCl、質(zhì)量濃度1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和質(zhì)量濃度2%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，pH8.5。
[0054](3)向步驟(2)的上清液中加入3300 μ LTris-飽和酚溶液，振蕩混勻，8000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，向獲得的上清液中再加入2000 μ LTris-飽和酚溶液，振蕩混勻，8000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，制得提取液A ;
[0055](4)向步驟(3)制得的提取液A中加入等體積混合溶液I，振蕩混勻，8000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；再加入等體積混合溶液II，振蕩混勻，8000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；加入上清液1/5體積的乙酸鈉溶液，乙酸鈉溶液濃度為3mol/L,乙酸鈉溶液pH5.2,再加入兩倍上清液體積的預(yù)冷無水乙醇,然后于冰上放置30min ;在-4°C, 1000g離心15min,收集沉淀,制得粗提物；
[0056]所述混合溶液I是酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1的比例混合的混合溶液；
[0057]所述混合溶液II是氯仿、異戊醇按體積比25:1的比例混合的混合溶液；
[0058](5)向步驟(4)制得的粗提物中加入2000 μ L的體積百分比為70%的乙醇溶液，上下顛倒振蕩懸浮沉淀；1000Og離心1.5min,收集沉淀；向獲得的沉淀中加入2000 μ L體積百分比為70%乙醇溶液，上下顛倒振蕩懸浮沉淀；12000g離心lmin，收集沉淀；然后再加入500 μ L無水乙醇洗漆沉淀I次；上下顛倒振蕩懸浮沉淀，1000Og離心1.5min,收集沉淀,室溫干燥，再加入240 μ L的TE緩沖液和12 μ L的RNaseA溶液，制得宏基因組DNA，置于_20°C冷凍保存。
[0059]對比例I
[0060]采用中國專利文獻(xiàn)CN101392248A (申請?zhí)?0081006477L I)說明書中實施例1所述的方法提取宏基因組DNA。
[0061]對比例2
[0062]一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA提取方法，步驟如下:
[0063](1)在離心管里加濕質(zhì)量為0.5g活性污泥，于1000Og離心lmin，收集沉淀，制得污泥；
[0064](2)向步驟(1)制得的污泥中加入600 μ L提取緩沖液和20 μ L濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液，渦旋至混勻；37°C水浴保溫30min ;然后加入200 μ L的質(zhì)量濃度為10%的十二烷基硫酸鈉溶液，渦旋至混勻；10000g離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；
[0065]所述提取緩沖液含有100mmol/L三輕甲基氨基甲燒(Tris)、100mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、200mmol/L的NaCl、質(zhì)量濃度1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和質(zhì)量濃度2%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，pH8.0。
[0066](3)向步驟(2)的上清液中加入800 μ LTris-飽和酚溶液，振蕩混勻，1000Og離心IOmin,將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，向獲得的上清液中再加入500 μ L Tris-飽和酚溶液，振蕩混勻，1000Og離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，制得提取液A ;
[0067](4)向步驟(3)制得的提取液A中加入等體積混合溶液I，振蕩混勻，1000Og離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；再加入等體積混合溶液II，振蕩混勻，1000Og離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；加入上清液1/10體積的乙酸鈉溶液，乙酸鈉溶液濃度為3mol/L,乙酸鈉溶液pH5.2,再加入兩倍上清液體積的預(yù)冷無水乙醇,然后于冰上放置30min ；12000g離心lOmin,收集沉淀,制得粗提物；
[0068]所述混合溶液I是酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1的比例混合的混合溶液；
[0069]所述混合溶液II是氯仿、異戊醇按體積比25:1的比例混合的混合溶液；
[0070](5)向步驟(4)制得的粗提物中加入500 μ L的體積百分比為70%的乙醇溶液，上下顛倒振蕩懸浮沉淀；12000g離心lmin,收集沉淀；向獲得的沉淀中加入500 μ L體積百分比為70%乙醇溶液，上下顛倒振蕩懸浮沉淀；12000g離心lmin，收集沉淀；然后再加入500 μ L無水乙醇洗滌沉淀I次；上下顛倒振蕩懸浮沉淀，12000g離心lmin，收集沉淀，室溫干燥，再加入60 μ L的TE緩沖液和3 μ L的RNaseA溶液，制得宏基因組DNA，置于_20°C冷凍保存。
[0071]試驗例
[0072]分別取通過實施例1、實施例2、對比例I和對比例2的方法提取的宏基因組DNA溶液5 μ L點樣于含I μ g/mL溴化乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。電泳緩沖液為I XTAE,電壓為100V，電泳時間為40min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄相應(yīng)結(jié)果，如圖1和圖2所示。
[0073]由圖1中可以看出，實施例1、實施例2提取的宏基因組DNA (泳道I~3)具有明顯的亮帶，而對比例I所述方法提取的宏基因組DNA沒有明顯亮帶，因此采用本發(fā)明所述方法提取的環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA樣品的產(chǎn)量較高、質(zhì)量較好，豐富度較聞。
[0074]由圖2可以看出，實施例1、實施例2提取的宏基因組DNA (泳道3~4)具有明顯的売帶，而對比例2所述方法提取的宏基因組DNA樣品條帶彌散,売帶沒有實施例1的売帶明顯，因此采用本發(fā)明所述方法提取的環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA樣品的產(chǎn)
量較高、質(zhì)量較好，豐富度較高。[0075]結(jié)果分析
[0076]通過上述結(jié)果，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)影響環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA提取的主要因素可能為高濃度的氯化鈣，因此通過利用生理鹽水稀釋、緩沖液中添加具有絡(luò)合作用能力的EDTA試劑，絡(luò)合活性污泥中存在的鈣離子，使溶菌酶能夠在較為溫和的條件下有效地作用于活性污泥中的微生物菌體，從而獲得質(zhì)量較好的宏基因組DNA樣品，同時消除相關(guān)干擾因素的作用。
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟如下: (1)取0.5~2g活性污泥，離心，收集沉淀；然后加入5~20ml的質(zhì)量濃度為0.9%的氯化鈉溶液洗滌I~5min，離心，收集沉淀，重復(fù)3~5次，制得初洗污泥； (2)向步驟(1)制得的初洗污泥中加入600~2400μ L提取緩沖液和20~80 μ L溶菌酶溶液，混合均勻，36~38°C水浴保溫25~40min ;然后加入200~800 μ L的質(zhì)量濃度為10%的十二烷基硫酸鈉溶液，混合均勻，離心，取上清液； 所述提取緩沖液含有濃度為80~120mmol/L的三羥甲基氨基甲烷、濃度為80~120mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉、濃度為150~250mmol/L的NaCl、質(zhì)量濃度為1%的聚乙烯吡咯烷酮和質(zhì)量濃度為2%的十六烷基三甲基溴化銨，pH7.5~8.5 ; (3)向步驟(2)的上清液中加入800~3300μ L Tris-飽和酚溶液，混合均勻，離心，取上清，再加入等體積500~2000 μ L Tris-飽和酚溶液，混合均勻，離心，取上清，制得提取液A ； (4)向步驟(3)制得的提取液A中加入等體積混合溶液I，混合均勻，離心，取上清，再加入等體積混合溶液II，混合均勻，離心，取上清，加入上清1/10~1/5體積的乙酸鈉溶液，再加入上清2~3倍體積的預(yù)冷無水乙醇，冰上放置30~40min ;低溫離心，取沉淀，制得粗提物； 所述混合溶液I是酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1的比例混合的混合溶液； 所述混合溶液II是氯仿、異戊醇按體積比25:1的比例混合的混合溶液； (5)向步驟(4)制得的粗提物中加入500~2000μ L的體積百分比為70%的乙醇溶液，懸浮沉淀，離心，收集沉淀，重復(fù)I~3次；然后加入500~2000 μ L的無水乙醇，懸浮沉淀，離心，收集沉淀，室溫干燥，再加入60~240 μ L的TE緩沖液和3~12 μ L的RNaseA溶液，制得宏基因組DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(1)中的離心，條件均為:8000 ~1000Og 離心 I ~1.5min。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(2)中溶菌酶溶液濃度為10~15mg/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(2)、(3)和(4)中的離心，條件均為:8000~1000Og離心10~15min。
5.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(4)中的低溫離心，條件為:-4 ~(TC，10000 ~12000g 離心 10 ~15min。
6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(4)中的乙酸鈉溶液濃度為3mol/L, pH5.2。
7.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(5)中的離心，條件均為:10000 ~12000g 離心 I ~1.5min。
【文檔編號】C12N15/10GK103789300SQ201410067311
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】李強(qiáng), 李玉梅, 曲衍洪, 宋冬雪, 郝大魁, 胡志恒, 楊敏 申請人:濟(jì)南大學(xué)