一種牙鲆腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牙鲆腦組織來源細(xì)胞系建立的方法。包括腦組織原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)，及其冷凍保存、復(fù)蘇和鑒定，其中所采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液中添加胎牛血清和人堿性成纖維細(xì)胞生長因子。建立的牙鲆腦細(xì)胞系形態(tài)為類上皮樣的星形膠質(zhì)細(xì)胞，該細(xì)胞系可以連續(xù)傳代，能提供大量牙鲆腦細(xì)胞，直接用于牙鲆功能基因的研究。不僅可望成為牙鲆分子細(xì)胞水平理論研究的平臺，而且可作為魚類內(nèi)分泌學(xué)、繁殖生物學(xué)、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物毒理學(xué)研究的理想材料。
【專利說明】一種牙鲆腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海水魚類細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體說是一種牙鲆腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]構(gòu)建與培養(yǎng)動物細(xì)胞系早已成為研究發(fā)育生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、毒理學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)的有力工具。截至目前，已有近280余株不同的魚類細(xì)胞系相繼建立起來，在生理學(xué)、病毒學(xué)、毒理學(xué)、腫瘤及基因工程等多個領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。但相對來說，海水魚類的細(xì)胞系還較少，包括咸水魚才僅有約100株。
[0003]魚類腦組織是魚的重要組織器官，其所有生命活動的調(diào)節(jié)和控制都受制于神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，如性腺分化、發(fā)育、成熟、配子排放等生殖活動就是靠腦組織的內(nèi)分泌反饋調(diào)節(jié)來控制。因此，腦組織細(xì)胞除了具有一般細(xì)胞系在基因功能分析、病毒學(xué)等研究中的應(yīng)用價值外，還可以 應(yīng)用于現(xiàn)在較少探究的魚類腦室膜功能研究領(lǐng)域，以及魚類內(nèi)分泌學(xué)、繁殖生物學(xué)、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物毒理學(xué)的相關(guān)研究。目前，魚類腦細(xì)胞系報道還較少，特別是鲆鰈魚類尚未見到相關(guān)報道。
[0004]牙鲆(Paralichthys olivaceus)俗稱牙片魚、偏口魚、比目魚,隸屬于硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鰈形目、鰈亞目、牙鲆科、牙鲆屬。其肉質(zhì)鮮嫩，是一種名貴的海水經(jīng)濟(jì)魚類，也是日本、韓國以及我國的重要海水增養(yǎng)殖魚類之一。因此，其發(fā)育生物學(xué)、繁殖生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、性別控制等方面的研究已成為焦點(diǎn)。隨著研究深入，牙鲆細(xì)胞離體培養(yǎng)體系在細(xì)胞生物學(xué)及基因功能等科學(xué)問題解析中的作用越來越引起重視。但是，迄今為止，目前國內(nèi)外僅有牙鲆鰭條細(xì)胞系(中國海洋大學(xué)，童裳亮，Aquaculture，1997，156:327-333.)、胚胎細(xì)胞系(中國水產(chǎn)研究院黃海水產(chǎn)研究所，陳松林，Diseases of Aquatic Organisms, 2004,60:241-246.)、腎臟細(xì)胞系(中國水產(chǎn)研究院黃海水產(chǎn)研究所，王娜，Journal of FishDiseases，2011，34:81-85.)等3個細(xì)胞系，未見有該魚種腦組織細(xì)胞系的建立。因此，如果能體外建立牙鲆腦細(xì)胞系，不僅可以為研究魚類腦室膜功能以及中樞神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)在其性別決定、生長、繁殖中的作用提供平臺；而且，可以為離體研究魚類病原的致病機(jī)理及免疫抗病基因的功能提供材料；體外篩選實驗甚至還可用于目前較為關(guān)注的內(nèi)分泌干擾物毒理研究，即在海洋環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的毒理學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。同時，這種方法也可以適用于其他鲆鰈魚類甚至于其他海水魚類。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種牙鲆腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為:
[0007]一種魚類腦組織來源細(xì)胞系建立方法，包括以下步驟:
[0008]I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液:取Hyclone公司的MEM培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入占細(xì)胞培養(yǎng)液總體積20%的胎牛血清，10ng/mL人堿性成纖維生長因子，100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，PH值為7.0-7.4，于4°C下保存，備用；[0009]2)原代培養(yǎng):將0.5-lmL腦組織小塊加入到步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液中懸浮，而后將懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中于25±0.2°C培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)，待組織塊完成貼壁后再補(bǔ)加l_2mL上述配制細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0010]3)傳代培養(yǎng):待上述原代培養(yǎng)組織塊周圍細(xì)胞遷出并增殖至形成巢式細(xì)胞暈時，加入0.25%胰蛋白酶消化液使細(xì)胞懸起，而后利用步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行原瓶傳代培養(yǎng)，待原瓶傳代細(xì)胞長滿瓶底后，以1:1-1:2分瓶傳代，以后3-7天傳代一次；傳至10代，進(jìn)而細(xì)胞系建立成功。傳至10代之后，傳代所用培養(yǎng)液是血清含量減為總體積10%的步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液。目前，該細(xì)胞已經(jīng)傳至40代。
[0011]所述魚類為牙鲆，同時也適用于如大菱鲆、圓斑星鰈等其他魚類腦細(xì)胞系的構(gòu)建。
[0012]所述步驟2)中腦組織小塊為約Imm3大小的小塊。
[0013]所述步驟2)無菌條件下取牙鲆的腦組織，置于添加青霉素、鏈霉素的Hyclone公司MEM培養(yǎng)液中3-5min后，吸出培養(yǎng)液，用1_1.2mL PBS (pH7.2)多次沖洗腦組織，再吸出PBS,將腦組織剪成小塊，待用。
[0014]所述步驟3)待上述原代培養(yǎng)組織塊周圍細(xì)胞遷出并增殖至形成巢式細(xì)胞暈時，吸出培養(yǎng)液，用PBS(pH7.2)沖洗，吸出PBS，加入0.25%胰蛋白酶液消化，而后顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續(xù)在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，在原瓶中加入新鮮的步驟O配制細(xì)胞培養(yǎng)液使細(xì)胞懸浮，而后將懸液進(jìn)行傳代。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:
[0016]1.采用本發(fā)明方法構(gòu)建的牙鲆腦細(xì)胞系可以進(jìn)行連續(xù)傳代，目前已傳至40代，能提供大量的牙鲆腦細(xì)胞，細(xì)胞生長溫度為25±0.2°C，細(xì)胞形態(tài)為類上皮樣，生長曲線正常，染色體眾數(shù)為正常的48條，可以應(yīng)用于魚類細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、繁殖生物學(xué)、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物毒理學(xué)及病毒學(xué)等方面的研究；而且，以PEGFP-N3進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實驗，可以觀察到較強(qiáng)的綠色熒光，證實牙鲆腦細(xì)胞系可以直接應(yīng)用于外源基因功能研究。
[0017]2.本發(fā)明通過易于操作、簡便的方式將腦組織來源細(xì)胞經(jīng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方式，獲得可以連續(xù)傳代且細(xì)胞能維持良好生長狀態(tài)的腦來源細(xì)胞。具體是指本發(fā)明中的牙鲆腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法操作簡單，重復(fù)性強(qiáng)，較之前報道的其他魚類腦細(xì)胞系建立中的胰酶或膠原酶消化法原代培養(yǎng)方法更容易掌握和操作，因此該構(gòu)建方法更適用于構(gòu)建其他魚類特別是海水魚類腦組織來源的細(xì)胞系，應(yīng)用價值極大。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1A、1B分別為本發(fā)明實施例提供的相差顯微鏡下傳代培養(yǎng)的牙鲆腦細(xì)胞系圖，其中A為牙鲆腦細(xì)胞3代圖(100X )，B為牙鲆腦細(xì)胞23代圖(100X )。
[0019]圖2為本發(fā)明實施例提供的牙鲆腦細(xì)胞系的生長曲線圖。
[0020]圖3A、B、C分別為本發(fā)明實施例提供的牙鲆腦細(xì)胞系的染色體核型圖，其中A為染色體數(shù)目分布圖，B為中期分裂相(1000 X )，C為核型。
[0021]圖4為本發(fā)明實施例提供的牙鲆腦細(xì)胞免疫熒光顯微圖片(200X )。
[0022]圖5為本發(fā)明實施例提供的牙鲆腦細(xì)胞系轉(zhuǎn)染PEGFP-N3后的熒光顯微圖片(IOOX)0【具體實施方式】:
[0023]本發(fā)明對目前的魚類細(xì)胞系構(gòu)建方法進(jìn)行了優(yōu)化，構(gòu)建方法操作簡單，重復(fù)性強(qiáng)，較之前報道的其他魚類腦細(xì)胞系的建立方法更容易掌握和操作，應(yīng)用價值極大，為進(jìn)一步的實驗研究提供了材料和技術(shù)支持。
[0024]下面結(jié)合實施例詳述本發(fā)明的構(gòu)建、鑒定和應(yīng)用方法。
[0025]實施例1
[0026]牙鲆腦來源細(xì)胞系的建立方法，步驟如下:
[0027]I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液:取Hyclone公司MEM培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入占總體積20%的胎牛血清，100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，10ng/mL人堿性成纖維細(xì)胞生長因子，pH值為7.0-7.4，4°C存放，備用。
[0028]2)原代培養(yǎng):無菌取體重250g牙鲆的腦組織，置于添加了 400U/mL青霉素、400 μ g/mL鏈霉素的4mL Hyclone公司MEM培養(yǎng)液的無菌玻璃平皿中3_5min后，吸出培養(yǎng)液，用1-1.2mL PBS (pH7.2)沖洗腦組織兩次，吸出PBS，將腦組織剪成大約Imm3的小塊，加ImL上述步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液，使腦組織小塊懸浮，而后轉(zhuǎn)至25cm2培養(yǎng)瓶中，于25±0.2°C培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)。第二天向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充上述步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液lmL，然后每隔7天更換培養(yǎng)瓶中半量細(xì)胞培養(yǎng)液一次。
[0029]3)傳代培養(yǎng):待步驟2)原代培養(yǎng)細(xì)胞不斷從組織塊周圍遷出并迅速增殖，當(dāng)組織塊周圍細(xì)胞暈停止生長后，吸出培養(yǎng)液，用PBS (pH7.2)沖洗，吸出PBS，加入ImL的0.25%胰蛋白酶液消化。顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續(xù)在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，在原瓶中加入新鮮的步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液使細(xì)胞懸浮，而后將懸液進(jìn)行傳代。第一次傳代后，待細(xì)胞長滿瓶底，以2\104-2\105細(xì)胞/1^濃度進(jìn)行1:1-1:2分瓶傳代；以后3-7天傳代一次；傳至10代，進(jìn)而細(xì)胞系建立成功。傳至10代之后，傳代所用培養(yǎng)液是血清含量減為總體積10%的步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液。目前，該細(xì)胞已經(jīng)傳至40代。細(xì)胞已能穩(wěn)定增值，細(xì)胞系命名為P0BC。該細(xì)胞系主要細(xì)胞類型為類上皮樣細(xì)胞(如圖1A、B所示)。
[0030]實施例2
[0031]牙鲆腦細(xì)胞系的鑒定和應(yīng)用
[0032]I)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
[0033]細(xì)胞的凍存:
[0034]選取上述處于指數(shù)生長期、細(xì)胞密度達(dá)到90%以上的傳代培養(yǎng)腦細(xì)胞，按常規(guī)方法消化:吸出培養(yǎng)液，用PBS(pH7.2)沖洗，吸出PBSjPA ImL的0.25%胰蛋白酶液消化。顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續(xù)在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，在原瓶中加入2mL新鮮上述實施例步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，以2200rpm離心2min，去上清。用2mL預(yù)冷的凍存液(即含10% 二甲基亞砜的Hyclone公司MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)懸浮細(xì)胞，并移至2mL凍存管中，將凍存管放入程序降溫盒中后依次于4°C放置30min, -20°C放置2h, _80°C放置過夜,然后移至液氮中保存,并做好記錄。
[0035]細(xì)胞的復(fù)蘇:
[0036]自液氮中取出保存的凍存管，迅速置于42°C水浴中融化，2200rpm離心5min，棄上清，并加入2mL上述實施例步驟I)配制的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮上述凍存細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，放置于培養(yǎng)箱中25±0.2°C培養(yǎng)，次日待細(xì)胞貼壁后棄上清，再加入2mL新的上述實施例步驟I)配制的細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0037]2)細(xì)胞生長曲線繪制
[0038]為了分析牙鲆細(xì)胞系的生長情況，取22代腦細(xì)胞，按照1.2 X IO5個細(xì)胞/孔的密度在24孔板中接種18孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在接種后的第1，3，5,7,9,11天按照常規(guī)胰蛋白酶液消化法消化，收集3孔細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以每mL培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo),繪制生長曲線,如圖2所示。
[0039]3)染色體分析
[0040]取25代牙鲆腦細(xì)胞，用按照上述實施例步驟I)配制的2mL細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，接種密度為I X IO6個細(xì)胞/瓶。25±0.2°C下培養(yǎng)24h，加入終濃度I μ g/mL的秋水仙素3h后,按照常規(guī)胰蛋白酶液消化法消化,2200rpm離心2min收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀中加入IOmL0.075mol/LKC1溶液37°C水浴低滲處理20min后，加入ImL預(yù)冷的卡諾氏固定液(甲醇:乙酸=3:1 (v/v)),預(yù)固定2min, 1000rpm離心5min后棄上清,細(xì)胞沉淀用5mL預(yù)冷卡諾氏固定液固定15min后，以1000rpm離心5min收集細(xì)胞,重復(fù)操作兩次。然后將細(xì)胞重懸于0.5mL預(yù)冷卡諾氏固定液中，將細(xì)胞懸液以冷滴法滴片，風(fēng)干，10%吉姆薩染色lOmin，用Nikon顯微 鏡觀察。結(jié)果顯示牙鲆腦細(xì)胞的染色體數(shù)目在29~93之間，其中染色體眾數(shù)為48條(圖3A)，均為端部著絲粒染色體，染色體核型為2n=48t (圖3B、C)。
[0041]4)細(xì)胞免疫熒光鑒定
[0042]取28代牙鲆腦細(xì)胞，用按照上述實施例步驟I)配制的2mL細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，按照I X IO5個細(xì)胞/孔的密度在24孔板中接種，置于25±0.2°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到95-100%，用預(yù)冷PBS (pH7.2)洗3次，每次IOmin ;用4%多聚甲醛固定IOmin,用PBS洗5min ;用0.5%預(yù)冷的Triton穿孔15min,用PBS洗2次,每次5min。清洗后用1%BSA封閉30min 后加一抗(2.5μ L Rabbit ant1-GFAP [X] 18-0063 溶于 200 μ L 的 1%BSA)4°C 過夜；用PBS 洗 2 次,每次 5min,再加二抗(2.5 μ L Labeled Donkey Anti Rabbit IgG Antibodies溶于200 μ L的1%BSA) 25°C孵育lh，用PBS洗2次，每次5min，最后加入25 μ L DAPI染色2min。用Nikon ECLIPSE TE2000-U熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光的表達(dá)，表明該細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖4)。
[0043]5) GFP報告基因在腦細(xì)胞中的表達(dá)
[0044]轉(zhuǎn)染前一天，取第22代腦細(xì)胞，用按照上述實施例步驟I)配制的2mL細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，以2X IO5個細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板中，25±0.2°C培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞密度超過 80%,以 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染 pEGFP_N3。具體步驟為將 IyLLipofectamine2000加入到包含49 μ L Hyclone公司的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液的1.5mL離心管中，另一個離心管中加入2μ L pEGFP-N3 (400ng/μ L)和48 μ L Hyclone公司的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液。5min后，將上述兩管溶液混合，室溫放置25min。將上述100 μ L混合液加入到包含500 μ L不含血清的上述實施例步驟I)配制的細(xì)胞培養(yǎng)液(即不含血清的配制細(xì)胞培養(yǎng)液，取Hyclone公司MEM培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，IOng/mL人堿性成纖維細(xì)胞生長因子，pH值為7.0-7.4，4°C存放，備用。)的24孔板的一孔中，25±0.2°C培養(yǎng)4.5h后，吸出培養(yǎng)液，加500 μ L按照上述實施例步驟I)配制的細(xì)胞培養(yǎng)液，72h后，用Nikon ECLIPSE TE2000-U熒光顯微鏡觀察綠色熒光的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)約有20%以上的細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)熒光(具體參見圖5)。
[0045]上述實施例表明，用本發(fā)明方法建立的牙鲆腦組織來源細(xì)胞系，生長曲線正常，染色體為正常的48條，可以進(jìn)行連續(xù)傳代，也可以對其進(jìn)行冷凍保存。以PEGFP-N3進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實驗，也觀察到 較強(qiáng)的綠色熒光。細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果表明所培養(yǎng)細(xì)胞為腦部星形膠質(zhì)細(xì)胞。證實牙鲆腦組織來源細(xì)胞系可以直接應(yīng)用于外源基因功能研究。
[0046]本發(fā)明牙鲆腦組織來源細(xì)胞系的建立方法重復(fù)性強(qiáng)，經(jīng)染色體鑒定結(jié)果可信，取材的牙鲆體重恰當(dāng)，操作方法簡便，也可以適用于構(gòu)建其他魚類腦組織來源的細(xì)胞系。
【權(quán)利要求】
1.一種魚類腦組織來源細(xì)胞系建立方法，包括以下步驟: O配制細(xì)胞培養(yǎng)液:取Hyclone公司的MEM培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入占細(xì)胞培養(yǎng)液總體積20%的胎牛血清，10ng/mL人堿性成纖維生長因子，100U/mL青霉素，ΙΟΟμ g/mL鏈霉素，PH值為7.0_7.4，于4°C下保存，備用； 2)原代培養(yǎng):將0.5-lmL腦組織小塊加入到步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液中懸浮，而后將懸浮液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中于25±0.2°C培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)，待組織塊完成貼壁后再補(bǔ)加l_2mL步驟1)配制細(xì)胞培養(yǎng)液； 3)傳代培養(yǎng):待上述原代培養(yǎng)組織塊周圍細(xì)胞遷出并增殖至形成巢式細(xì)胞暈時，加入0.25%胰蛋白酶消化液使細(xì)胞懸起，而后利用步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行原瓶傳代培養(yǎng)，待原瓶傳代細(xì)胞長滿瓶底后，以1:1-1:2分瓶傳代，以后3-7天傳代一次；傳至10代,進(jìn)而細(xì)胞系建立成功。
2.按照權(quán)利要求1所述的魚類腦組織來源細(xì)胞系建立方法，其特征在于:所述傳至10代之后，傳代所用培養(yǎng)液是血清含量減為總體積10%的步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種牙鲆腦組織來源細(xì)胞系的建立方法，其特征在于:所述步驟2)無菌條件下取牙鲆的腦組織，置于添加青霉素、鏈霉素的Hyclone公司MEM培養(yǎng)液中3-5min后，吸出培養(yǎng)液，用1-1.2mLPBS(pH7.2)多次沖洗腦組織，再吸出PBS，將腦組織剪成小塊，待用。
4.按照權(quán)利要求1所述的魚類腦組織來源細(xì)胞系建立方法，其特征在于:所述步驟2)中腦組織小塊為約Imm3大小的小塊。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種牙鲆腦組織來源細(xì)胞系的建立方法，其特征在于:所述步驟3)待上述原代培養(yǎng)組織塊周圍細(xì)胞遷出并增殖至形成巢式細(xì)胞暈時，吸出培養(yǎng)液，用PBS (pH7.2)沖洗，吸出PBSjPA 0.25%胰蛋白酶液消化，而后顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續(xù)在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，在原瓶中加入步驟I)配制細(xì)胞培養(yǎng)液使細(xì)胞懸浮，而后將懸液進(jìn)行傳代。
【文檔編號】C12R1/91GK103789263SQ201410071475
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】尤鋒, 鄭媛, 彭麗敏, 鄒玉霞, 吳志昊, 譚訓(xùn)剛, 焦爽 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所